酶學實驗技術課件

1、酶學實驗技術第一節(jié) 概述第二節(jié) 酶的來源和生產第三節(jié) 酶和細胞的固定化第四節(jié) 酶的應用第一節(jié) 概述一、酶的特性酶：有催化能力的蛋白質酶促反應（酶催化反應）1961年按酶所催化的反應類型將酶分成6大類： 氧化還原酶類； 轉移酶類； 水解酶類； 裂合酶類； 異構酶類； 合成酶（或稱連接酶）類。二、酶學實驗技術簡介有機相中酶反應的研究；酶的分離、提純、大批量生產及新酶和酶的 應用開發(fā)；酶和細胞的固定化及酶反應器的研究（包括酶傳感器、反應檢測等）；酶生產中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶（突變酶）的研究；第二節(jié) 酶的來源和生產利用微生物生產酶的優(yōu)點是：一、酶的來源：主要是動植物和微生物微生物具有較強的適

2、應性，通過各種遺傳變異的手段， 能培育出新的高產菌株。微生物繁殖快、生產周期短、培養(yǎng)簡便，并可以通過 控制培養(yǎng)條件來提高酶的產量；微生物種類繁多，動植物體內存在的酶，幾乎都 可從微生物中得到；二、酶的生產菌1、對菌種的要求：（4）能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。（3）穩(wěn)定，不易產生變異退化，不易感染噬菌體；（2）不是致病菌；（1）產酶量、酶的性質、最好是胞外酶；菌種保藏機構和有關研究部門，從自然界中分離篩選菌樣采集、菌種分離初篩、純化、復篩和生產性能鑒定等。改良（如基因突變、基因轉移和基因克?。?。2、生產菌的來源：3、目前常用的產酶微生物：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、青霉菌、 木霉菌

3、、根霉菌、鏈霉菌等。三 酶的制備（一） 生物提取蛋白質提取，采用保持活性的分離法大致步驟： 細胞破碎離心分離硫酸銨鹽析透析凝膠過濾離子交換冷凍干燥2、純化倍數(shù)：指提純后與提純前酶比活力 的比值。1、比活力： 單位質量酶產品中酶活力稱比活力。比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或IU) mg蛋白（二）利用DNA重組技術改造和生產酶外源酶基因工程菌重組入優(yōu)點：不受天然來源限制，迅速，且易于誘變改造酶產品酶反應幾乎都在水溶液中進行，自然簡便缺點是游離酶只能一次性使用，不僅造成酶的浪費，而且會增加產品分離的難度和費用，影響產品的質量；另外溶液酶很不穩(wěn)定，容易變性和失活。原因：比水溶性酶更適合于多酶反

4、應。固定化酶的優(yōu)點：可多次使用，酶的穩(wěn)定性提高。酶與底物和產物易于分開，易于純化，產品質量高；反應條件易于控制，可實現(xiàn)轉化反應的連續(xù)化和自動控制；酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少；酶和細胞的固定化方法載體結合法交聯(lián)法包埋法物理吸附法共價結合法離子結合法吸附法，包埋法，共價鍵結合法，交聯(lián)法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共價結合法交聯(lián)法包埋法（1）載體結合法物理吸附法：載體：無機載體、天然高分子、大孔型合成樹脂、 疏水型的載體。缺點：酶與載體之間的結合力不強，酶易于脫落， 導致酶活力下降并污染產物。（1）載體結合法離子結合法：載體：多糖類離子交換劑和離子交換樹脂，

5、如DEAE-纖維素等。缺點：結合力也比較弱，酶易脫落 （1）載體結合法原理：酶分子上的功能團，如氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基等和載體表面的反應基團之間形成共價鍵，因而將酶固定在載體上。共價結合法：優(yōu)點：酶與載體結合牢固，不會輕易脫落。缺點：反應條件劇烈，往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的專一性等性質也會發(fā)生變化。（2）交聯(lián)法原理：用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物 的細胞與細胞之間交聯(lián)的固定化方法。常用的交聯(lián)劑有戊二醛等。缺點：反應條件強烈，固定化酶的酶活較低；優(yōu)點：酶的穩(wěn)定性提高。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它的二個醛基與酶分子的游離氨基反應形成schiff堿，彼此交聯(lián)： CH=N-酶

6、-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-交聯(lián)方式NCH(CH2)3CHNNCH(CH2)3CHNCH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶-N=CH-交聯(lián)法常與吸附法或包埋法聯(lián)合使用。如先使用明膠（蛋白質）包埋，再用戊二醛交聯(lián)；常在被交聯(lián)的酶溶液中添加一定量的輔助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的穩(wěn)定性。（3）包埋法網格型、微囊型網格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等合成高分子和淀粉、明膠、膠原、海藻膠和角叉菜膠等天然高分子。網格型包埋法是固定化細胞中用得最多、最有效的方法。2、固定化酶的性質一般酶活力下降，可在固定化反應體系中加入 抑制劑、底物或產物以保護酶的活性中心。（1）酶活力的變化（2）酶穩(wěn)定性的變化操作穩(wěn)定性，半衰期在1個月以上，可以認為 其具有一定的工業(yè)應用價值；貯藏穩(wěn)定性；對蛋白酶的穩(wěn)定性。 熱穩(wěn)定性（3）酶學特性的變化底物專一性、最適pH、最適溫度、米氏常數(shù)最大反應速度等，均可能發(fā)生變化。填充床反應器第五節(jié) 酶在醫(yī)藥工業(yè)中的應用一、固定化細胞法生產6-氨基青霉烷酸技術路線E.coli 斜面固定化細胞（顆粒狀）青霉素G轉化液濾液細胞6-APA培養(yǎng)明膠包埋-戊二醛交聯(lián)過濾抽提填充床式反