125羥化維生素D3對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞侵襲、遷移和粘

1、1，25羥化維生素D3對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞侵襲、遷移和粘【摘要】目的討論1，25羥化維生素D3骨化三醇對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGL3細(xì)胞粘附、侵襲和遷移才能的影響。方法TT法檢測(cè)其對(duì)PGL3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；分別用粘附相關(guān)基底膜成分分析實(shí)驗(yàn)、重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)、Transell室趨化運(yùn)動(dòng)模型研究骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞的粘附、侵襲和運(yùn)動(dòng)才能的影響。結(jié)果骨化三醇明顯抑制PGL3細(xì)胞的生長(zhǎng)。骨化三醇作用PGL3細(xì)胞24h的I50值為0.158l/L。骨化三醇0.025、0.05、0.075l/L處理PGL3細(xì)胞24h，對(duì)PGL3細(xì)胞侵襲才能的抑制率分別為12.94%、27.33%、38.2

2、2%，對(duì)PGL3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)才能的抑制率分別為8.70%、29.83%、43.62%。降低PGL3細(xì)胞對(duì)層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率，且其效果呈一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論骨化三醇抑制人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGL3細(xì)胞的粘附、侵襲和遷移才能；骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞粘附和侵襲的影響與其降低PGL3細(xì)胞對(duì)層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】1，25羥化維生素D3；粘附；侵襲;遷移；人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGL3細(xì)胞【Abstrat】bjetiveThisstudyasdesignedtinvestigatetheeffetsf1，25-dihydrxyvitainD3nadhesin，invasi

3、nandigratinfPGL3ells.ethdsellgrinhibitinaseasuredbyTTassay.Theeffetsf1，25H2vitD3nadhesin、invasinandigratinfPGL3ellseredeterinedusinganalysisfadhesin-relatedbaseentebranepnentsfibrnetinandlainin，renstitutedbaseentebraneinvasinassay，andTranselldel，respetively.Results1，25H2vitD3displayedgrthinhibitryat

4、ivityagainstPGL3ellsithI50valuesf0.158l/Lfr24hursftreatent.0.025，0.05and0.075l/Lf1，25-dihydrxyvitainD3inhibitedPGL3ellstinvadetherenstitutedbaseentebraneby12.94%，27.33%，38.22%，anddereasedtheperentagesfltinandigratinfPGL3ellsby8.70%，29.83%，43.62%.Inadditin，1，25-dihydrxyvitainD3inhibitedPGL3ellstadher

5、etthebaseentebranepnentsfibrnetinandlainin.nlusin1，25-dihydrxyvitainD3ansignifiantlyinhibittheadhesin，invasinandigratinfPGL3ells，andthesuppressinfadhesinfPGL3ellstfibrnetinandlaininayberespnsiblefrtheinhibitinfadhesinandinvasinfPGL3ells.【Keyrds】1，25-dihydrxyvitainD3;adhesin;invasin;igratin;PGL3ells侵

6、襲和轉(zhuǎn)移是不斷改良性腫瘤最重要的惡性行為和治療的主要障礙，是臨床90%以上癌癥患者的致死因素，因此，控制侵襲和轉(zhuǎn)移成為惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，研發(fā)具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的新藥有著非常重要的意義。1，25羥化維生素D31，25-dihydrxyvitainD3又名骨化三醇，是維生素DVitainD，VitD在肝臟和腎臟羥化酶的作用下最終被轉(zhuǎn)化為其活性形式。近幾年來其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響備受關(guān)注。骨化三醇對(duì)體外培養(yǎng)的幾乎所有類型的腫瘤細(xì)胞有抑制或促分化作用，并且可以抑制、殺死或預(yù)防體內(nèi)多種腫瘤15。但其對(duì)腫瘤的作用機(jī)制尚未完全明確，最近的研究結(jié)果說明骨化三醇的抗腫瘤作用與其抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成

7、相關(guān)。目前，骨化三醇對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGL3細(xì)胞轉(zhuǎn)移才能的影響還未見報(bào)道。本文對(duì)骨化三醇對(duì)人PGL3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲、運(yùn)動(dòng)和粘附才能的影響進(jìn)展研究，為將其開發(fā)成為有效的臨床抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥提供理論根據(jù)。1材料與方法1.1材料與試劑1，25H2VitD3、TT、纖維粘連蛋白fibrnetin，F(xiàn)N、蘇木精、伊紅、優(yōu)凱特均購自Siga公司；超級(jí)無支原體新生牛血清購自杭州四季青生物材料；RPI-1640購自美國Hylne公司；層粘連蛋白lainin，LN購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系；胰酶購自美國Gib公司；Transell室直徑6.5、孔徑8購自美國star公司；聚碳酸酯膜直徑13、孔徑8購自美國il

8、lipre公司；膠原購自華美生物工程公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGL3細(xì)胞引自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)PGL3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，100ku/L青霉素和100g/L鏈霉素的RPI-1640培養(yǎng)液中，37、5%2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2TT法檢測(cè)骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，每孔接種100l含5.0103細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，參加新培養(yǎng)液90l，及不同濃度的骨化三醇溶液10l，使終濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20l/L。對(duì)照組那么參加一樣體積的培

9、養(yǎng)液，每一濃度設(shè)8個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔參加TT5g/L20l，培養(yǎng)46h。每孔參加三聯(lián)液DS100l。用ELX800型酶標(biāo)儀在570n波長(zhǎng)處測(cè)量D值，以Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度。1.2.3細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Transell室朝上室方向的上膜面已鋪好atrigel，朝下室方向的下膜面涂纖維粘連蛋白10l約2g，風(fēng)干后放入已含有600l含0.1%牛血清白蛋白BSA的RPI-1640培養(yǎng)液的下小室中，37孵育1h，取出備用。將經(jīng)0.025、0.05、0.075l/L骨化三醇處理24h的PGL3細(xì)胞重懸于含0.1%BSA的RPI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0109個(gè)/L，加100l細(xì)

10、胞懸液于Transell室的上小室。對(duì)照組為未經(jīng)骨化三醇處理的PGL3細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6h。取出上小室，甲醇固定3in，蘇木精染色3in，水洗。伊紅染色10s，水洗。擦去上膜面的atrigel及未穿過膜的細(xì)胞，優(yōu)凱特膠封片。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿過膜的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算平均值，以穿過膜的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲才能。侵襲抑制率=1實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)100%。1.2.4細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)除膜上不涂纖維粘連蛋白外，其余方法步驟同1.2.3。1.2.5細(xì)胞與FN、LN的粘附實(shí)驗(yàn)分別將5.0gFN、LN鋪于96孔板。用50l含2%BS

11、A的RPI-1640培養(yǎng)液封閉1h，PBS洗2次，待用。將經(jīng)0.025、0.05、0.075l/L骨化三醇處理24h的PGL3細(xì)胞重懸于含0.1%BSA的無血清RPI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為8108個(gè)/L，每孔加100l細(xì)胞懸液，對(duì)照組為未經(jīng)骨化三醇處理過的PGL3細(xì)胞，每一濃度設(shè)8個(gè)平行孔。37孵育1h，吸去培養(yǎng)液，每孔參加200l預(yù)熱的PBS洗去未粘附細(xì)胞。每孔參加100lTT0.1g，調(diào)零孔無細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔參加100lDS，用ELX800型酶標(biāo)儀在570n波長(zhǎng)處測(cè)量D值，細(xì)胞粘附率按下式計(jì)算。細(xì)胞粘附率=實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值100%。1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

12、數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差xs表示，結(jié)果用Studentsttest進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1骨化三醇對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGL3生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果說明，骨化三醇可明顯抑制PGL3細(xì)胞的生長(zhǎng)。骨化三醇作用PGL3細(xì)胞24h的I50為0.158l/L見表1。表1不同濃度骨三醇對(duì)PGL3的生長(zhǎng)抑制作用xs注：與對(duì)照組比擬，*P0.0012.2骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞侵襲才能的影響經(jīng)骨化三醇0.025、0.050、0.075l/L作用24h后，PGL3細(xì)胞侵襲重組基底膜的才能明顯受到抑制，抑制率分別為12.94%、27.33%、38.22%見表2。表2骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞侵襲才能的影響xs注：與對(duì)照組比擬，

13、*P0.012.3骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)才能的影響骨化三醇0.025、0.050、0.075l/L作用PGL3細(xì)胞24h后，能抑制PGL3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)才能，且呈劑量依賴性，抑制率分別為8.70%、29.83%、43.62%表3。表3骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)才能的影響xs注：與對(duì)照組比擬，*P0.012.4骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞與FN、LN粘附才能的影響見圖1。圖1骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞FN、LN粘附才能的影響由圖1看出0.025、0.050、0.075l/L的骨化三醇作用PGL3細(xì)胞24h后能降低PGL3細(xì)胞對(duì)基質(zhì)成分LN、FN的粘附率，并呈一定的劑量依賴關(guān)系。3討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明骨化三醇

14、能明顯抑制PGL3細(xì)胞生長(zhǎng)，作用PGL3細(xì)胞24h后的I50為0.158l/L。而抗腫瘤侵襲、運(yùn)動(dòng)和粘附才能的藥物其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用應(yīng)控制在10%左右，因此，選擇0.025、0.050、0.075l/L骨化三醇來進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。這三個(gè)濃度的骨化三醇對(duì)PGL3細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯影響抑制率10%，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)說明可降低PGL3細(xì)胞的侵襲才能，這說明骨化三醇抑制PGL3細(xì)胞侵襲、粘附和遷移可能與其細(xì)胞毒作用無直接關(guān)系。近年來，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究在細(xì)胞和分子程度上已獲得了一不定期的進(jìn)展。Litta等提出侵襲過程分為“三步：粘附、降解基底膜和基質(zhì)運(yùn)動(dòng)。上述三步重復(fù)進(jìn)展，使得腫瘤細(xì)胞向深層侵襲。0.075

15、l/L骨化三醇即可明顯抑制PGL3細(xì)胞侵襲才能抑制率38.22%和細(xì)胞趨向性運(yùn)動(dòng)才能抑制率43.62%，并能降低PGL3細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分FN、LN的粘附。因此，上述幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明骨化三醇是通過抑制細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)而抑制PGL3細(xì)胞的體外侵襲才能的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1PurghlaiH，AkhterJ，LuY，etal.Invitrandinvivinhibitinfliveranerellsby1，25-dihydrxyvitainD3.anerLett，2000，1511:97-102.2KshizudaK，Kike，AsuH，etal.binedeffetfvitainD3analgsandpalitaxelinthegrthfF-7breastanerellsinviv.BreastanerResTreat，1999，532:113-120.3NivY，SperberAD，F(xiàn)igerA，etal.Inlretalarinapatients，seruvitainDlevelsvaryardinggstagefthearina.aner，1999，863:391-397.4