實驗六細菌的生理生化試驗

1、實驗六細菌的生理生化試驗 一、 目的 1、了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應(yīng)原理 。2、掌握細菌生理生化試驗的方法。2020/11/32二、原理 由于細菌特有的單細胞原核生物的特性，各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同細菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物學技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天，細菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。 2020/11/33三、材料 1菌種 大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌的斜面菌種 。 2培養(yǎng)基 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵

2、培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂斜面等。2020/11/34 3試劑 5%的-萘酚溶液、 40KOH溶液、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚。 4器具 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、接種環(huán)等。 2020/11/35四、流程 糖類發(fā)酵試驗 V-P試驗M.R試驗吲哚試驗 硫化氫試驗三糖鐵 （TSI）瓊脂試驗 2020/11/36五、步驟 (一)糖類發(fā)酵試驗 1目的 了解不同細菌分解利用糖的能力及實驗原理，并掌握其操作方法。 2020/11/37 2原理 可根據(jù)細菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲

3、酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察是否產(chǎn)生氣泡來判斷。 2020/11/383材料 3.2菌種 大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）、沙門氏菌的斜面菌種 3.培養(yǎng)基 葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管 2020/11/39流程 發(fā)酵液試管標記接種培養(yǎng)觀察記錄 2020/11/3105步驟 5.1試管標記 取分別裝有葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對

4、照。 2020/11/311 5.2接種 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對照均不接菌。置37恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結(jié)果。 2020/11/3122020/11/3132020/11/314 5.3觀察記錄 與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”表示。 2020/11/315

5、(二)、乙酰甲基甲醇試驗(VP試驗) 1.目的 檢測細菌能否利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，并掌握其操作方法。2020/11/3162原理 葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 二乙酰 與胍基生成紅色化合物 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。2020/11/3173材料(1)、菌種 大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌的斜面菌種 (2)、培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(3)、試劑 V-P指試劑20

6、20/11/318流程培養(yǎng)液試管標記接種培養(yǎng)觀察記錄 2020/11/319 5步驟 （1）、標記試管 取4支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對照。 2020/11/320（2）、接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)4872h。 2020/11/321（3）、觀察記錄 取出以上試管，先加甲液（6%的-萘酚溶液）0.5毫升,再加乙液（40KOH溶液）0.5毫升,充分混勻,靜置15min后，若培養(yǎng)液呈紅色者，記錄為V.P.試驗陽性反應(yīng)（用“”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應(yīng)（用“”表示）

7、。1小時后可出現(xiàn)假陽性。 2020/11/3222020/11/323（三）甲基紅試驗（M.R.試驗） 1、目的 檢測細菌能否分解葡萄糖產(chǎn)生有機酸的能力。了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗原理，并掌握其操作方法。 2020/11/324 2、原理 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。 2020/11/3253、材料 （1）、菌種 大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌的斜面菌種 （2）、培養(yǎng)基 葡萄糖蛋

8、白胨水培養(yǎng)基2020/11/3264流程 培養(yǎng)液試管標記接種培養(yǎng)指示劑觀察記錄2020/11/327 （1）、標記試管 取4支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對照。 5、步驟 2020/11/328（2）、接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)4872h。 2020/11/329（3）、觀察記錄 取出以上試管，各加入56滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細觀察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“”或“”表示。 注意：甲基紅指示劑不能加太多，以免出現(xiàn)假陽性

9、。2020/11/330 甲基紅（Methyl Red）試驗結(jié)果2020/11/331陽性陰性對照2020/11/332（四）、靛基質(zhì)（吲哚）試驗 1目的 用來檢測細菌能否分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。掌握吲哚試驗(Ehrlich法)的原理和方法 。2020/11/333 2、原理 有些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))。吲哚本身沒有顏色，不能直接看見，但當加入對二甲基氨基苯甲醛試劑時，該試劑與吲哚作用，形成紅色的玫瑰吲哚。2020/11/3343、材料 3.1菌種 大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌3.2 培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基 3.3試劑 對二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 2

10、020/11/3354流程 標記試管接種培養(yǎng)觀察記錄 2020/11/3365步驟 （1）、標記試管 取4支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對照。 2020/11/337（2）、接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)4872h。 2020/11/338 （3）觀察記錄 在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入510滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽

11、性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“”、陰性用“”表示。2020/11/3396結(jié)果2020/11/340(五)硫化氫試驗?zāi)承┠芊纸怆装彼酘2S與醋酸鉛或硫酸亞鐵黑色（硫化鉛或硫化鐵）沙門氏菌2020/11/3412020/11/342（六）、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗 原理 本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。 2020/11/3433材料(1)、菌種 大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣

12、腸桿菌桿菌、沙門氏菌的斜面菌種 (2)、培養(yǎng)基 三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基2020/11/3444流程 標記試管接種培養(yǎng)觀察記錄 2020/11/345（1）、標記試管 取4支三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對照。2020/11/346（2）、接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管先作劃線分離培養(yǎng)，然后采用穿刺培養(yǎng)方法刺到試管底，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。 2020/11/347（3）觀察記錄 本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃