微生物-育種課件

1、菌種選育的目的菌種選育的目的1.提供分子遺傳學研究材料；2.分析生物合成機制；3.增加菌種遺傳標記；4.了解菌種遺傳背景。一、科研：1.產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)；2.改變產(chǎn)品組分；3.抵抗不良培養(yǎng)條件；4.簡化生產(chǎn)工藝； 5.適應原材料；6.縮短生產(chǎn)周期；7.合成新的化合物；8.改進質(zhì)量；9.提高產(chǎn)量。二、生產(chǎn)：自然篩選自然篩選生產(chǎn)菌種3.從一些發(fā)酵制品中分離。一、從自然界分離所需要的菌株1.向菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)菌株，從中篩選所需菌株。如：中國微生物菌種保藏管理委員會（CCCCM）；美國典型菌種保藏中心(ATCC)；英國國家典型菌種保藏中心(NCTC)等。2.由自然界采集樣品。自然篩選自然篩選生

2、產(chǎn)菌種二、把分離到的野生型菌株進一步純化并進行代謝產(chǎn)物鑒別。樣品的采集具體步驟：（一）、從土壤中采樣細菌（108）放線菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻類（104）原生動物（103）根據(jù)土壤有機質(zhì)含量，通氣狀況，酸堿度，植被狀況，地理條件（南 方較好），季節(jié)條件（秋季最佳）一、含微生物樣品的采集富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境中地優(yōu)勢種，以利分離到所需要地菌株。主要根據(jù)微生物的碳、氮源、pH值、溫度、需氧等生理因素加以控制。二、富集

3、培養(yǎng)注意：如果按通常分離方法在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)足夠多數(shù)量的目的微生物，則不必進行富集培養(yǎng)。（二）、控制培養(yǎng)條件 如：細菌、放線菌生長繁殖pH 7.0-7.5 霉菌、酵母菌生長繁殖pH 4.5-6（一）、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分三、分離稀釋平板法（一）、稀釋平板法（pour plate method）將含微生物的樣品用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取少量與冷卻至50的固體培養(yǎng)基混合，搖勻，倒混菌平板或涂平板，倒置培養(yǎng)24小時，出現(xiàn)菌落。適用于：數(shù)量占優(yōu)的微生物。好氧，在平板上形成菌落的微生物。不適用于：相反。25g或25mL225mL無菌生理鹽水1mL9mL10-110-210-310-610-7倒平

4、板平皿劃線分離法（二）、平皿劃線分離法：連續(xù)劃線交叉劃線方格劃線扇形劃線適用于：好氧，能在平皿上形成好的菌落。生化反應分離在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基渾濁。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應該菌株利用底物的能力。分解水解酶產(chǎn)生菌時多采用，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌。（三）、利用平皿的生化反應進行分離1.透明圈法：透明圈法（1）分離淀粉酶產(chǎn)生菌：以淀粉為唯一碳源，樣品涂布培養(yǎng)形成單菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。（2）分離核酸水解酶產(chǎn)生菌：普通平板，樣品涂布培養(yǎng)長出菌落后覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，內(nèi)含3%酵母RN

5、A，0.7%瓊脂及0.1mol/L EDTA, pH 7.0,于42左右培養(yǎng)2-4小時，挑四周產(chǎn)生透明圈的菌落。（3）分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株：選擇培養(yǎng)基+CaCO3變色圈法（1）篩選果膠酶產(chǎn)生菌0.2%果膠為唯一碳源培養(yǎng)基平板涂布培養(yǎng)長出菌落后，加入0.2%剛果紅溶液染色4小時，具有分解果膠能力的菌落周圍會出現(xiàn)絳紅色水解圈。2.變色圈法在底物平板中+指示劑或顯色劑抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選。培養(yǎng)基+抗生素的敏感菌（作為檢驗菌）+被檢菌采用冷敏感菌篩選抗生素突變株，Giuseppe Satta 等從人的病源菌中誘變分離低溫敏感菌突變株（冷敏菌），在20以下不生長。將冷敏菌+放線菌孢子

6、混合于平板上20培養(yǎng)3-4天，放線菌生長產(chǎn)抗生素，再移至37培養(yǎng)18-20小時，冷敏菌迅速生長，觀察抑菌圈。4.抑菌圈法變色圈生長圈抑菌圈透明圈單細胞或單孢子分離法濾紙片法：取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙3-4層，浸在培養(yǎng)液中，取出放在空皿內(nèi)，在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥，蓋好皿蓋，滅菌。將稀釋為1500ml-1的孢子懸液用滴管滴在濾紙上，每皿約點20滴左右，經(jīng)恒溫培養(yǎng)，每滴約出現(xiàn)10個菌落，將單菌落移接于斜面上。（五）、單細胞或單孢子分離法通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離1.控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分如特殊菌類-環(huán)保降解菌（降解烴類、有機染料、表面活性劑、農(nóng)藥等）的分離：以該物質(zhì)為唯一碳源或氮源進行長時間（

7、幾個月的連續(xù)培養(yǎng)）富集培養(yǎng)。2.控制培養(yǎng)基的pH3.排除不需要的菌類4.控制培養(yǎng)溫度（六）、通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離厭氧微生物的分離1.加還原劑于培養(yǎng)基中如半胱氨酸等。2.去氧 ：焦性沒食子酸 + NaOH（七）、厭氧微生物的分離厭氧微生物分離裝置四、篩選和目的產(chǎn)物的鑒別2.搖瓶發(fā)酵篩選搖瓶振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液 待測平板打孔(厚3mm 內(nèi)徑5mm鋼圈打孔)+過濾后的發(fā)酵液10ul或滅菌圓濾紙片上滴入1-2ul發(fā)酵液代替打孔孔或濾紙片的周圍出現(xiàn)活性圈（溶菌圈或水解圈），根據(jù)其大小判定活力大小1.平板篩選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)

8、生產(chǎn)用菌種。五.毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。誘變育種誘 變 育 種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。.提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量；.改善菌種特性，提高產(chǎn)品質(zhì)量；.簡化工藝條件；.開發(fā)新品種一.育種目的.了解出發(fā)菌株：適宜的培養(yǎng)條

9、件、溫度、濕度、培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基上的菌落情況。2.建立一個準確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方法。3.研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。二.準備工作出發(fā)菌株的選擇1.自然選育的具有一定生產(chǎn)能力的野生或至少能少量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的菌株。2.具有有利性狀的菌株，如生長速度快，營養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株。3.選擇已發(fā)生其它變異的菌株。4.采用“增變菌株”（對誘變劑的敏感性比原始菌株大為提高）的變異菌株。三、步驟與方法（一）出發(fā)菌株的選擇單細胞或單孢子懸液的制備*誘變育種工作中，一般采用3-4個出發(fā)菌株，在逐代處理后，將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。（二）單細胞或單孢子懸液的制備采用對數(shù)期

10、細胞或成熟而新鮮的孢子：用發(fā)芽孢子（芽長為孢子 0.5-1倍）或直接用斜面孢子。不產(chǎn)生孢子的真菌采用年幼的菌絲體。均勻的懸液。誘變劑及誘變劑量的選擇（三）誘變劑及誘變劑量的選擇（1）物理誘變劑非電離輻射（只使物質(zhì)分子或原子中的電子級能提高）-紫外線1.誘變劑的種類紫外線誘變機制紫外線誘變機制形成胸腺嘧啶二聚體；嘧啶間的水合作用；DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)，DNA分子間交聯(lián)；DNA鏈斷裂。紫外線最有效的波長是2537埃。采用15w紫外線燈管，30cm距離。電離輻射射線種類放射源性質(zhì)能量范圍危險性透過組織的深度X射線X 光機電離輻射50-300kv危險，有穿透力幾mm-幾cm射線放射形同位素及核反應同上達

11、幾百萬ev同上1cm中子核反應堆或加速器不帶電子的粒子1ev-幾百萬ev危險性高，穿透力強1cm粒子放射性同位素或加速器電子幾百萬ev有時有危險1cm粒子放射性同位素氦核2106-9 106ev內(nèi)照射，很危險1cm電離輻射：殺菌率90%-99.9%其它物理誘變劑：微波、紅外線、激光、高能電子流等。化學誘變劑(2).化學誘變劑缺失誘變劑名稱誘變效應羥胺亞硝基胍（NTG）吖啶類亞硝酸5-BUGC ATAT GC 顛換移換回復效應+/ +化學誘變劑大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。化學誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射

12、進行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：誘變劑的選擇堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺失突變。但它可能影響鄰近基因的性能。2

13、.誘變劑的選擇誘變劑量的選擇（1）處理劑量大，殺菌率高（90%-99%），在單位存活細胞中負變菌株多，正變菌株少。（2）用小劑量進行誘變處理時，殺菌率約50%-80%，在單位存活細胞中正變株多，然而大幅度提高產(chǎn)量的菌株可能較少。3.誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇（3）化學誘變劑主要是調(diào)節(jié)濃度、處理時間、處理條件（溫度、pH值等）。物理誘變劑主要是控制照射距離、時間和照射過程中的條件（O2、水等）。誘變劑處理方式（1）單因子處理處理1次連續(xù)重復使用（2）復合因子處理兩個以上因子同時處理不同誘變劑交替處理4.誘變劑處理方式中間培養(yǎng)（四）中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程

14、，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。中間培養(yǎng)方法 方法： 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。突變株的分離與篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差

15、異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。（五）突變株的分離與篩選篩選程序1.篩選程序常規(guī)法（1）常規(guī)法誘變第一代：出發(fā)菌株分離到平皿上（結(jié)合指示劑、呈色劑或底物等）挑選菌落（200個）初篩1瓶/株50株復篩3-5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）第二代：出發(fā)菌株4株誘變分離到平皿上（結(jié)合指示劑、呈色劑或底物等）挑菌落100個菌落100個菌落100個菌落100個菌落初篩1瓶/株50株復篩3-

16、5株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）第三代、第四代直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。簡便法2.簡便法第一代：出發(fā)菌株誘變分離到平皿上打瓊脂塊菌落1000-3000塊檢定板上挑取5%-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落初篩1-2瓶/株30-50株復篩3-5瓶/株3-5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）第二代：出發(fā)菌株4株誘變分離到平皿上打瓊脂塊1000-3000塊檢定板上挑取5%-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落初篩1-2瓶/株30-50株復篩3-5瓶/株3-5株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）第三代、第四代直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。特點（1）分離采用瓊脂塊法； （2）初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析采用簡便、快速

17、的瓊脂平板測定法或其他簡便方法。隨機篩選2.篩選方法出發(fā)菌株誘變平皿生長出菌落隨機挑選菌落于斜面接種三角瓶振蕩培養(yǎng)測定產(chǎn)物活性的高低，決定取舍缺點：如果菌落挑取少了，很難篩選到理想的突變株（因為突變概率?。?）隨機篩選（搖瓶篩選）初篩方法平板菌落篩選 可根據(jù)菌落形態(tài)或利用菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中檢定菌、底物或指示劑作用后，在其周圍形成抑菌圈、呈色圈或其他特異性反應圈，測定反應圈直徑。如：紅霉素誘變突變株帶色素（低產(chǎn)株）產(chǎn)孢子菌誘變不產(chǎn)孢子突變株由突變引起形態(tài)劇烈變化的菌落（負突變多）（2）平板菌落篩選（搖瓶初篩前的一種預篩）根據(jù)菌落形態(tài)突變的高產(chǎn)菌株其菌落形態(tài)往往在常態(tài)的正常范圍內(nèi)，因為

18、它們的遺傳物質(zhì)僅受到微小損傷，還保留了正常代謝的基本功能。一個菌株的高產(chǎn)性能是經(jīng)過多代微小突變累積的，一代誘變后的菌落形態(tài)與直接親本之間形態(tài)變化一般不明顯，但經(jīng)長期多代誘變后，高產(chǎn)菌株與其最原始的親代在形態(tài)特征上還是有明顯差異。根據(jù)平板菌落生化反應篩選濃度梯度法加入抗生素上層不加抗生素，接種涂平板低濃度高濃度(3).濃度梯度法瓊脂塊法 日本人八木建立，此法廣泛用于抗生素和酶類等突變株的篩選。 優(yōu)點：準確性比直接平板上特異性反應圈更可靠；方法較為簡便；篩選量很大，一次可篩選瓊脂塊上的菌落達1000-3000個或更高。（比常規(guī)篩選量提高15-20倍）（4）瓊脂塊法單孢子懸液誘變接種到瓊脂平皿上（2

19、0-50個菌落/皿）用直徑6mm打孔器每皿80-120瓊脂塊直徑9 cm平皿中加入20ml培養(yǎng)基保持一定濕度29，4-5天生物鑒定平板每板130-150塊含供試菌種29，17-18小時選出菌落接入斜面其他復印技術(shù)應用：從平板上可直接篩選產(chǎn)脂野生株和具有高脂含量的突變株，是產(chǎn)脂微生物的簡便檢測方法。步驟：誘發(fā)產(chǎn)脂的限氮培養(yǎng)基制平板，接種30培養(yǎng)3-4天。在平皿上覆蓋一張濾紙（直徑9cm，1號），用“絲絨印?！陛p壓后取出已復印菌落的濾紙，置于50，干燥20min。（5）其它將濾紙浸入含蘇丹黑（質(zhì)量體積比為0.08%，溶劑95%乙醇）溶液的平皿內(nèi)，染色20min。取出濾紙，放入95%乙醇平皿中輕搖3

20、min去多余染料。取出放入95%乙醇平皿中脫色5min。將濾紙干燥，高脂酵母菌落呈現(xiàn)深藍色或紫色，而低脂菌落為淺藍色或無色。搖瓶液體培養(yǎng)其培養(yǎng)條件接近于發(fā)酵罐，可作為發(fā)酵工藝模擬試驗，選出的菌種易推廣到大生產(chǎn)中去。初篩：1瓶/株，逐個進行活性測定，凡生產(chǎn)能力比出發(fā)菌株高10%以上的進行保種和復篩。復篩：3-5瓶/株，觀測重復性。*注意：培養(yǎng)條件要盡量與大生產(chǎn)發(fā)酵條件相近。培養(yǎng)條件的相似性：搖瓶型號、裝量、瓶塞厚度、搖瓶轉(zhuǎn)速、溫度、搖瓶位置、室內(nèi)相對濕度等。復篩方法搖瓶液體培養(yǎng)產(chǎn)物活性測定一般突變規(guī)律：一個出發(fā)菌株通過一次誘變，生產(chǎn)能力提高5%的突變株約為1/50，而生產(chǎn)能力提高10%以上的突變

21、株約為1/300。通常誘變一代至少要挑選1000株以上，經(jīng)平皿預篩后，約保留200株進行搖瓶初篩。經(jīng)典法：蛋白酶測定采用分光光度法；脂肪酶測定采用NaOH滴定法；。缺點是操作繁瑣、樣品不能同時測定，帶來誤差。（六）產(chǎn)物活性測定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整快速檢驗法：瓊脂平板活性圈法：平板打孔加入發(fā)酵液或濾紙片浸透發(fā)酵液覆蓋于瓊脂平板上（加有檢驗菌或底物）。其他法（七）培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整紫外線的誘變育種實例一 紫外線的誘變育種 紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537埃燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量

22、死亡率控制在7080%為宜。被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106107個ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。操作步驟單細胞懸液制備 將細菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個ml左右，作為待處理菌

23、懸液。操作步驟紫外線照射 取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。 殺菌率計算 取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5mL進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 中間培養(yǎng) 取照射菌液2mL于液體培養(yǎng)基中(300mL三角瓶內(nèi)裝30mL培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。 分離、篩選 取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。挑取菌落進行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌實例二 亞硝基胍誘變曲霉菌 N甲基N-硝基-N-

24、亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。 單孢子懸液制備 取斜面，加入6mL 0.1molL pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個mL，此為待處理孢子懸液。 MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2mL 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。操作步驟操作步驟 單孢子懸液制備

25、 取斜面，加入6mL 0.1molL pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個mL，此為待處理孢子懸液。 MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2mL 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。誘變處理 吸取MNNG溶液lmL，加入到1mL孢子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30 3天后計數(shù)。 死亡率計算 將未處理的孢子液1mL加入1mL磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計

26、算出死亡率。分離、篩選 挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選實例三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選2.營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：由于基因突變引起代謝過程中某種酶合成能力喪失的突變型，它們必須在原有培養(yǎng)基中添加相應的營養(yǎng)成分才能正常生長。1.野生型菌株（wild typestrain）：從自然界分離到的微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株。一、定義：基本培養(yǎng)基（minimal medium, MM）：僅能滿足微生物野生型菌株生長所需的培養(yǎng)基。用-表示。不同微生物的基本培養(yǎng)基是不同的。補充培養(yǎng)基（supplemental medium, SM）：凡只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培

27、養(yǎng)基。由MM+該菌株不能合成的營養(yǎng)因子而組成。完全培養(yǎng)基（complete medium, CM）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需求的天然或半合成培養(yǎng)基。用符號+表示。一般可在MM中加入富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質(zhì)配制成。（一）營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)：亞硝基胍、紫外線、亞硝酸等作誘變劑。二、步驟：淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株細菌：青霉素法（抑制肽聚糖交鏈）真菌：制霉素法（作用于細胞膜上的甾醇，引起細胞膜損傷）將誘變處理后的菌體用CM振蕩培養(yǎng)2-3代后，離心、洗滌菌體，轉(zhuǎn)移至MM中饑餓培養(yǎng)4-6小時，轉(zhuǎn)至MM中（+20%蔗糖）培養(yǎng)3-4小時，加一定濃度的青霉素。1.抗生素法：+MM振

28、蕩培養(yǎng)約10小時，用滅菌的脫脂棉或濾紙等除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3-4小時過濾一次，重復3-4次。誘變，MM振蕩培養(yǎng)，加熱至80。2.菌絲過濾法（絲狀菌）3.高溫殺菌法（芽孢菌）（三）營養(yǎng)缺陷型的檢出點植對照法1.點植對照法（點種法）CMMMCM突變株影印法2.影印法CM8cmMM高10cm+0.5%脫氧膽酸鈉防止菌落擴散Yi 夾層法3.夾層法（延遲補給法）MM（?。㎝M（含菌）MMCM最上層MM傾注后培養(yǎng)24小時，非營養(yǎng)缺陷型菌株生長成菌落，再傾注最后一層CM，在MM上不長，后在CM上長出的小的菌落為營養(yǎng)缺陷型菌落。限量補充培養(yǎng)法限量某種營養(yǎng)物質(zhì)（如0.01%蛋白胨），野生型長出大菌落，缺陷

29、型長出小菌落。4.限量補充培養(yǎng)法營養(yǎng)缺陷型的鑒定（四）營養(yǎng)缺陷型的鑒定1.測定缺陷型菌株所需生長因子的類別（哪類的判定）（1）氨基酸混合物（21種）；（2）維生素混合物（15種）；（3）核酸堿基混合液或酵母核酸（0.1%）；（4）酵母浸出液。待鑒定菌從斜面上用生理鹽水刮洗，離心洗滌，制成106-108個/ml的菌懸液，取0.1ml加入MM中，混勻到平皿，凝固后用濾紙片分別沾各類物質(zhì)覆于平板上，培養(yǎng)后觀察生長圈。2.具體測出缺陷型所需生長因子分組測定1963年Epstein.R.H.最先研究。在許可的溫度下能正常生長，在非許可的溫度條件下不能生長或微弱生長，表型與野生型不同，這種條件致死突變株即

30、Ts突變株。溫度敏感突變株溫度敏感突變株（temperature-sensitive mutant）的篩選Ts突變株累積中間發(fā)酵產(chǎn)物的機理：突變導致某種酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，即突變體的酶蛋白一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列發(fā)生了變化，而酶的活性中心并未發(fā)生改變。在許可溫度下培養(yǎng)時，酶活力、菌體生長和代謝均正常。當菌體生長到一定階段，轉(zhuǎn)移到非許可溫度時，突變株生長停止，酶活力逐漸喪失，從而使發(fā)酵目的產(chǎn)物得以不斷合成累積和往外分泌。篩選步驟：1.誘變：亞硝酸、紫外線等。2.富集：因為頻率極低（0.1%）（1）抗生素法（2）過濾或離心法（3）H3-前體法：誘變后菌體在非許可溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)基中+相應的H3-前體物（如

31、+H3-尿嘧啶篩選RNA合成缺損的Ts突變株），野生型菌株或其它大分子合成缺陷型Ts都可吸收H3-前體物，3.分離篩選：主要根據(jù)菌株在高于或低于最適生長溫度5-15的生長狀況。一般細菌 30為許可溫度，40為非許可溫度；放線菌 30為許可溫度，38為非許可溫度；酵母菌 23為許可溫度，36為非許可溫度。并摻入合成為細胞物質(zhì)。含有H3-前體物的細胞在長時間低溫保存過程中由于射線損傷而死亡。谷氨酸發(fā)酵高產(chǎn)途徑1.菌量達一定后添加表面活性劑（土溫80）或抗菌素（青霉素），阻止細胞膜或細胞壁的結(jié)構(gòu)合成，從而提高細胞膜的透性，促使Glu大量外泄/2.誘變篩選生物素缺陷型：在培養(yǎng)基中加入亞適量生物素，有利

32、于Glu的產(chǎn)量提高。例：谷氨酸發(fā)酵高產(chǎn)途徑4.誘變篩選細胞膜結(jié)構(gòu)或功能缺損的Ts突變株，通過溫度調(diào)節(jié)來控制細胞膜透性，使菌體能在含高濃度生物素的培養(yǎng)基中能分泌大量Glu。3.誘變篩選油酸或甘油缺陷型，限量供給油酸或甘油以控制細胞膜磷脂的含量和組成，促使Glu外滲?；蛑亟M育種自然存在原核微生物中基因重組方式轉(zhuǎn)化（transformation）受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在肺炎鏈球菌、葡萄球菌和流感嗜血桿菌等中被證實。轉(zhuǎn)化因子（transforming principle ）在轉(zhuǎn)化過程中，轉(zhuǎn)化的DNA片段稱為

33、轉(zhuǎn)化因子 ，分子量小于107，最多不超過10-20個基因。感受態(tài)（competence）受體菌只有處于感受態(tài)時，才能攝取轉(zhuǎn)化因子。細菌處于感受態(tài)是因為其表面有一種吸附DNA的受體.轉(zhuǎn)化圖接合（conjugation）接合是細菌通過性菌毛相互連接溝通，將遺傳物質(zhì)（主要是質(zhì)粒DNA）從供體菌轉(zhuǎn)移給受體菌。 接合性質(zhì)粒：能通過接合方式轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒稱為接合性質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒和毒力質(zhì)粒。F、F、HfrF+與接合F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientHfr高頻重組菌株F+F+HfrHfr與F接合HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-F與接合FFFFFF-FF-轉(zhuǎn)導（t

34、ransduction）轉(zhuǎn)導是以轉(zhuǎn)導噬菌體為載體，將供體菌的一段DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的性狀。 普遍性轉(zhuǎn)導（generalized transduction）局限性轉(zhuǎn)導（restricted transduction）普遍性轉(zhuǎn)導完全缺陷型噬菌體：病毒蛋白質(zhì)衣殼包裹著一小段宿主的DNA。部分缺陷型噬菌體的產(chǎn)生過程普遍性轉(zhuǎn)導與局限性轉(zhuǎn)導的區(qū)別區(qū)別要點普遍性轉(zhuǎn)導局限性轉(zhuǎn)導基因轉(zhuǎn)導發(fā)生的時期裂解期溶原期轉(zhuǎn)導的遺傳物質(zhì)供體菌染色體DNA任何部位或質(zhì)粒噬菌體DNA及供體菌DNA的特定部位轉(zhuǎn)導的后果完全轉(zhuǎn)導或流產(chǎn)轉(zhuǎn)導受體菌獲得供體菌DNA特定部位的遺傳特性轉(zhuǎn)導頻率受體菌的10-7轉(zhuǎn)導頻率較普遍

35、轉(zhuǎn)導增加1000倍(10-4)真核微生物基因重組方式1、有性雜交有性細胞的接合和隨之發(fā)生的染色體重組。二、真核微生物基因重組方式能產(chǎn)生有性孢子的酵母和霉菌2、準性生殖（parasexuality）是真菌中不產(chǎn)生有性孢子的一種導致基因重組的過程。類似于有性生殖而又比它更原始的一種繁殖方式。原生質(zhì)體育種 原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合是將兩種不同的微生物細胞經(jīng)酶等方法處理，去掉細胞壁成為原生質(zhì)體后進行融合的過程。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上

36、提出來的。原生質(zhì)體融和原生質(zhì)體融合育種的特點(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較小：二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。 (四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。原生質(zhì)體融合育種步驟標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。原生質(zhì)體制備。等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。生產(chǎn)性能篩選。原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合育種的要點獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。最重要的是標記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。（一）標記菌種的選擇（二）原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。 在放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母