常用抗菌藥物的抑殺菌活性檢測與評價課件

1、 微生物學 綜合性設計實驗常用抗菌藥物的抑殺菌活性檢測與評價 匯報人：第三組成員名單：目錄CONTENTS實驗目的及原理實驗設計思路實驗步驟實驗結果分析討論實驗目的通過實驗培養(yǎng)學生自主設計實驗的能力1 鞏固已學習的微生物實驗技能，學以致用2培養(yǎng)學生的團隊合作意識3 培養(yǎng)學生總結實驗結果和撰寫科研論文的能力4抗生素1 中藥復方抗菌類藥物2實驗原理抗 生 素 抗生素是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）產(chǎn)生、能抑制或殺滅其他微生物的物質?？股丶炔粎⑴c細胞結構，也不是細胞內(nèi)的貯存性養(yǎng)料，對產(chǎn)生菌本身無害，但對某些微生物有拮抗作用，是微生物在種間競爭中戰(zhàn)勝其他微生物保存自己的一種防衛(wèi)機制。Firef

2、lySeries實驗原理天然品人工合成品微生物對天然抗生素進行結構改造獲得的部分合成產(chǎn)品抗生素的特點實驗原理2 抗生素的作用具有選擇性，不同抗生素對不同病原菌的作用不一樣。對某種抗生素敏感的病原菌種類稱為該抗生素的抗生譜（抗菌譜）。 廣譜抗生素對多種病原菌有抗生作用，例如青霉素對多種革蘭氏陽性細菌都有良好藥效，鏈霉素對多種革蘭氏陽性和陰性細菌都有良好藥效，對結核桿菌有特殊的療效。 抗生素的特點實驗原理3 有效作用濃度。各種抗生素一般都在很低濃度下對病原菌就發(fā)生作用，這是抗生素區(qū)別于其他化學殺菌劑的又一主要特點。 各種抗生素對不同微生物的有效濃度各異，通常以抑制微生物生長的最低濃度作為抗生素的抗

3、菌強度，簡稱有效濃度 。 有效濃度越低，表明抗菌作用越強。 實驗原理抗生素分解或失去活性抗拒藥物的靶點發(fā)生變化細胞特性的改變細菌產(chǎn)生藥泵將進入細胞的抗生素泵出細胞細菌對抗生素（包括抗菌藥物）的抗藥性的4種機制雙黃連一種理想的抗病毒及細菌感染的中藥新劑型，清熱解毒用于風熱感冒發(fā)熱，咳嗽，咽痛實驗原理傳統(tǒng)中藥的抗菌活性（金銀花、黃芩、連翹）清熱解毒口服液感冒類非處方藥藥品，清熱解毒用于熱毒壅盛所致發(fā)熱面赤，煩躁口渴，咽喉腫痛等癥；流感、上呼吸道感染等實驗原理傳統(tǒng)中藥的抗菌活性（含有石膏 、知母 、金銀花、 連翹 、黃芩、 梔子、 龍膽、 板藍根 、 甜地丁、玄參 、地黃 、麥冬）實驗設計思路明確實

4、驗目的、原理聯(lián)系原有知識形成各種思路評價各種思路選擇最優(yōu)思路確定總方案實驗設計思路大腸桿菌、白色葡萄球菌雙黃連、清熱解毒口服液鏈霉素、氨芐青霉素、卡那霉素二倍濃度稀釋法菌種濃度藥品實驗步驟配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基打孔器打出直徑6mm的圓形小濾紙片，約200張；制備生理鹽 水；將 牛津杯、槍頭盒以及上述實驗材料包扎好，于高壓蒸汽滅菌 鍋內(nèi)121 下滅菌0.75mL 0.75mL 0.75mL0.75ml無菌生理鹽水0.75mL藥品原液（100g/mL）對三種抗生 素進行二倍稀釋，配制出濃度為50g/mL，25g/mL，12.5g/mL，6.25g/mL的藥品稀釋液。實驗步驟0.5mL 0.5mL

5、0.5mL 0.5mL4.5ml無菌生理鹽水0.5mL初配菌懸液菌種的擴繁將 6支裝有培養(yǎng)基的已滅菌的試管拉斜面，劃線接種實驗室提供的菌種，進行擴繁，每個菌種各3個斜面，然后恒溫37培養(yǎng)24h。菌懸液的制備試管中的無菌生理鹽水約10mL，取一半倒入白色葡萄球菌的斜面中，將菌種刮下混勻；試管中剩余的生理鹽水取一半倒入大腸桿菌的斜面中，將菌種刮下混勻。 實驗步驟藥品pH值的調節(jié)首先，使用pH廣泛試紙大致測定藥品酸堿度范圍，然后使用精密試紙測出具體pH值，利用氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液，在原pH值基礎上使藥品偏酸性和偏堿性，并保證新調節(jié)的pH在兩側大致對稱。用移液器為每個平板接種0.2mL稀釋過的菌懸液

6、，接著用涂布棒小心地將菌液在培養(yǎng)基表面輕輕涂抹均勻。貼平板同時，取初配的、未經(jīng)過梯度稀釋的大腸桿菌、白色葡萄球菌的菌懸液各0.2mL涂平板，留作計算CFU用。實驗步驟 三種抗生素，每種都有五個濃度，分別為100g/mL，50g/mL，25g/mL，12.5g/mL，6.25g/mL。每個平板貼6個濾紙片，分別為同種藥品的五個濃度，和中間的生理鹽水對照。對同一菌種，每種藥物重復3皿。兩種中藥，無需稀釋。每個平板內(nèi)貼5枚濾紙片，分別為2枚清熱解毒口服液，2枚雙黃連口服液，和中間的生理鹽水對照。每個菌種重復2皿。濾紙片法：每張濾紙片吸取20L所需藥品，待完全干燥后貼平板實驗步驟同時，將各藥物的最高濃

7、度集中到了一個平板上，以便觀察和分析。平板上共6枚濾紙片，包括了五種藥品和中間的生理鹽水對照。牛津杯法菌種白色葡萄球菌，藥品鏈霉素。每個平板放置6個牛津杯，分別為五個濃度的鏈霉素，生理鹽水對照。研究pH值對藥物抑殺菌效果的影響，選用白色葡萄球菌，分別將偏酸、偏堿、原pH值的藥物注入到牛津杯中，每杯加20L，同時在中間設置一個生理鹽水對照。實驗步驟要注意所有操作保證在無菌條件下進行。培養(yǎng)皿全部按照實驗設計處理完畢后，放在37下培養(yǎng)24h。觀察結果、分析，并對實驗作進一步規(guī)劃。 1.1大腸桿菌的菌落數(shù) 表1 大腸桿菌的菌落數(shù) 1.2 白色葡萄球菌的菌落數(shù)表2 白色葡萄球菌的菌落數(shù) 表3 鏈霉素對大

8、腸桿菌菌的抑菌圈直徑大小表4 卡那霉素對大腸桿菌菌的抑菌圈直徑大小2.2各種藥品對大腸桿菌抑菌效果的結果與分析氨芐青霉素對大腸桿菌沒有明顯的抑菌效果分析1.這兩種抗生素對大腸桿菌都都有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑分布在820mm之間，直徑與藥劑濃度呈正相關，其中卡那霉素效果較明顯。2.從實驗得出鏈霉素和卡那霉素對大腸桿菌的最低抑菌濃度均為6.25g/mL。表5 清熱解毒液對大腸桿菌的抑菌圈直徑大小分析： 實驗結果顯示，雙黃連對大腸桿菌沒有抑菌效果，經(jīng)查閱文獻，雙黃連對大腸桿菌有較強抑菌作用，故實驗結果不可靠。清熱解毒口服液對大腸桿菌有抑菌效果，但不明顯。就中藥和抗生素對大腸桿菌的抑菌效果相比，抗

9、生素的抑菌效果較中藥更好一些。2.3各種藥品對白色葡萄球菌的抑菌圈結果示意圖鏈霉素氨芐青霉素卡那霉素兩種中藥2.4各種藥品對白色葡萄球菌抑菌效果的結果與分析表6 鏈霉素對白色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小表7 卡那霉素對白色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小氨芐青霉素對白色葡萄球菌沒有明顯的抑菌效果分析：1.這兩種抗生素對大腸桿菌都都有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑分布在625mm之間，直徑與藥劑濃度呈正相關，其中鏈霉素效果較明顯。2.從實驗得出卡那霉素對白色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為25g/mL，而鏈霉素的最低抑菌濃度在6.25g/mL 12.5g/mL 之間，通過進一步實驗我們得出鏈霉素的最低抑菌濃度為7.5

10、g/mL 。表7 雙黃連對白色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小分析： 實驗結果顯示，清熱解毒口服液對白色葡萄球菌沒有抑菌效果。雙黃連對白色葡萄球菌有抑菌效果，但不明顯。就中藥和抗生素對白色葡萄球菌的抑菌效果相比，抗生素的抑菌效果較中藥更好一些。2.5 牛津杯法的結果表8 鏈霉素對白色葡萄球菌的抑菌圈大小以鏈霉素對白色葡萄球菌的作用為例濾紙片法與牛津杯法的比較分析： 從鏈霉素對白色葡萄球菌抑菌效果來看，在鏈霉素濃度較高時，濾紙片法的作用效果較牛津杯法好，在濃度很低時，牛津杯法的作用效果較濾紙片法好，但總體來說，濾紙片法的效果比牛津杯法好。 pH對不同菌的抑菌效果表9 卡那霉素的不同pH對兩種菌的抑菌圈直

11、徑大小分析： 采用牛津杯法，以卡那霉素的不同pH值對大腸桿菌和白色葡萄球菌的抑菌效果進行測定，結果表明：卡那霉素在不同pH值條件下對兩種菌的抑菌效果不盡相同,在酸性條件下的抑菌效果整體比堿性條件好，但差別不大。 實驗反思 實驗數(shù)據(jù)是綜合不同平板上抑菌圈的大小，而不同的平板其菌懸液的濃度等因素都是不一樣的，從而造成誤差 濾紙片實驗中，雙黃連對大腸桿菌的抑菌圈均沒有測量出數(shù)據(jù)，原因是在實驗過程中，由于對移液槍的錯誤使用，使加入到培養(yǎng)基中的菌懸液超出實驗所設計的加入的量，在對涂有大腸桿菌的平板貼濾紙片時，培養(yǎng)基表面還有大量的菌懸液，造成濾紙片無法吸收藥品溶液。 接種菌過多結果 接種菌不多結果關于第一次未找出卡那霉素和鏈霉素的MIC的原因分析： 1、牛津杯法的使用。 2、移液槍的錯誤使用或是菌懸液濃度過大致使培養(yǎng)基上菌臺太厚而影響抗生素的抑菌效果。實驗反思實驗反思關于細菌的抗性 西藥中氨芐青霉素的抑菌效果最差可能是因為日常生活中使用的頻率太高而使細菌對其產(chǎn)生的抗性增強。 實驗總結1.不同藥劑不同濃度對不同病原菌效果不同;2.鏈霉素是一種很有效的抑殺菌劑，在很低濃度時就對病原菌起到有效作用;3.通過對氨芐青霉素用牛津杯法加大劑量后，仍沒有抑菌圈產(chǎn)生