生物化學(xué)第二章-《核酸化學(xué)》 自動保存的課件

1、第二章 核酸化學(xué)第一節(jié) 核酸的概述 第二節(jié) 核苷酸 第三節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的提取、分離和測定 第五節(jié) 核酸的變性、復(fù)性與雜交 學(xué)習(xí)要求掌握DNA和RNA在組成、結(jié)構(gòu)和功能上的差異。 掌握DNA雙螺旋模型的要點，以及模型在生物學(xué)上的意義。 掌握幾種類型RNA結(jié)構(gòu)特征。 掌握核酸的性質(zhì)，及核酸的變性和復(fù)性。1染色體和基因2核酸第一節(jié) 核酸的概述在生物細胞核中存在著一種能被堿性染料著色的螺旋集縮體，它是由核酸、 組蛋白、非組蛋白等組成，稱此物質(zhì)為染色體。經(jīng)典遺傳學(xué)認為，染色體和基因（遺傳因子）間有平行現(xiàn)象，基因存在于染色體上，基因在遺傳中具有完整性，隨染色體的分裂、配對而進行獨立的分配。

2、核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進展 1868年 Fridrich Miescher從膿細胞中提取“核素” 1944年 Avery等人證實DNA是遺傳物質(zhì)1953年 Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1958年 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則1961年 Jacob和Monod提出操縱子學(xué)說1965年 Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1970年 Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 測序方法1985年 Mullis發(fā)明PCR 技術(shù)1990年 美國啟動人類基因組計劃(HGP) 1994年 中國人類基因組計劃啟動2001年 美、英等國完成人

3、類基因組計劃基本框架1868年，從外科繃帶上的膿細胞的細胞核中分離得到一種含磷較高的酸性物質(zhì)，稱之為核素。（nuclein）核素實質(zhì)是一種核糖核蛋白。瑞士科學(xué)家 F.Miescher1952年，美國冷泉港 Hershey-Chase噬菌體浸染細菌的實驗。(侵染大腸桿菌的病毒)35S32P蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA按照自身的結(jié)構(gòu)將遺傳信息精確復(fù)制傳遞給子代作為模板將儲存的遺傳信息傳給mRNA1958年 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則1970年 Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶1985年 Mullis發(fā)明PCR 技術(shù) 核酸以核苷酸為基本結(jié)構(gòu)單位,按照一定的排列順序,以

4、3，5-磷酸二酯鍵相連接,并通過折疊、卷曲形成具有特定生物學(xué)功能的線形或環(huán)形多聚核苷酸。核酸與蛋白質(zhì)一樣，是一切生物有機體不可缺少的組成部分。 核酸是生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，它不僅對于生命的延續(xù)，生物物種遺傳特性的保持，生長發(fā)育，細胞分化等過程中起著重要的作用，而且與生物變異，如腫瘤、遺傳病、代謝病等也密切相關(guān)。 因此，核酸的研究是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。引 言：核酸概述核酸的種類、分布和生物功能 90%以上分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。90%分布胞液，10%分布胞核(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucle

5、ic acid, RNA)脫氧核糖核酸 核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。信使RNA轉(zhuǎn)移RNA核糖體RNA核糖核酸（ribonucleic acid-RNA） 轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA-tRNA) 信使RNA(messenger RNA-mRNA) 核糖體RNA（ribosomal RNA-rRNA）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid- DNA）真核生物原核生物 DNA細胞核（95%）線粒體、葉綠體（5%）核質(zhì)區(qū)（擬核） RNA細胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（

6、15%）細胞核（10%）細胞質(zhì)第二節(jié) 核酸核酸(nucleic acid) 由堿基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸組成的高分子物質(zhì)，是生物體的基本組成，攜帶和傳遞遺傳信息。 核酸的化學(xué)組成主要元素：C、H、O、N、P與蛋白質(zhì)比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占911% 實驗室中用定磷法進行核酸的定量分析。（DNA9.9% 、RNA9.5%）核苷酸核酸的基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸(nucleotide) DNA,RNA中主要的堿基、核苷 戊糖 堿基 核苷 RNA D-核糖 A 腺嘌呤核苷 G 鳥嘌呤核苷 C 胞嘧啶核苷 U 尿嘧啶核苷DNA D-2-脫氧核糖 A 脫氧腺嘌呤核苷 G 脫氧鳥嘌呤核苷

7、C 脫氧胞嘧啶核苷 T 脫氧胸腺嘧啶核苷核糖核苷脫氧核糖核苷堿基嘌呤(purine) 腺嘌呤(adenine, A)鳥嘌呤(guanine, G)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶(thymine, T) 堿基的互變異構(gòu)酮式烯醇 C=O C-OH N N 受介質(zhì)pH影響在生理pH下，在生物體內(nèi)，堿基多以酮式存在。核苷核苷：A、G、C、U；脫氧核苷：dA、dG、dC、dTN-糖苷鍵：糖與堿基之間的C-N鍵1911修飾核苷核酸中還存在少量修飾核苷，有三種：由稀有堿基參與，如： 5-甲基脫氧胞苷， 次黃嘌呤核苷由稀有戊糖參與，如： 2-O

8、-甲基胞苷堿基與戊糖連接方式特殊，如： 假尿苷（）C1-C5 5-甲基脫氧胞苷2-O-甲基胞苷次黃嘌呤核苷假尿苷（） DNA的甲基化導(dǎo)致基因沉默核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP 核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。 核苷酸(ribonucleotide)532M-單(D-二；T三） ；P-磷酸RNA的名稱為某（單、二、三）苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷磷酸（脫氧腺苷酸）。八種核苷酸如下表所示(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)O-POO-NNNNN

9、H2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP)與一個磷酸結(jié)合MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMP與二個磷酸結(jié)合DP：如：ADP與三個磷酸結(jié)合TP：如：ATP 一、核苷酸b. 多磷酸核苷酸： 指含兩個以上磷酸基的核苷酸,如ADP 、ATP 、GDP、 GTP 、 UDP和UTP等. ATP在細胞能量代謝上起著極其重要的作用。 UTP參與糖原合成作用以供給能量, UDP有攜帶轉(zhuǎn)運葡萄糖的作用。 GDP和GTP為蛋白質(zhì)生物合成的起始和延伸提供能量。AMPADPATP c. 含核苷酸的生物活性物質(zhì)： NAD+、NADP+、CoA-SH、FA

10、D 等都含有 AMP; NAD+及FAD是生物氧化體系的重要組成成分，在傳遞氫原子或電子中有著重要作用。CoA作為有些酶的輔酶成分,參與糖有氧氧化及脂肪酸氧化過程。 NADP+NAD+d 核苷多磷酸和寡核苷多磷酸類化合物蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)，或?qū)蜣D(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)功能鳥苷-5-二磷酸-3-二磷酸（ppGpp）第三節(jié) 核酸的性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)二、互變異構(gòu)現(xiàn)象三、紫外吸收特性 四、核苷酸的解離性質(zhì)一般物理性質(zhì)無色粉末易溶于水，不溶于有機溶劑具有旋光性酸性溶液中不穩(wěn)定，易破壞中性或堿性溶液中穩(wěn)定互變異構(gòu)現(xiàn)象凡堿基上有酮基的核苷酸有酮式和烯醇式的互變異構(gòu)現(xiàn)象在生理pH下，在生物體內(nèi)，堿基多以酮式存在。紫外

11、吸收特性核苷酸的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，所以核苷酸在紫外光區(qū)具有強烈的吸收，其最大吸收在260nm處。核苷酸的解離性質(zhì)堿基雜環(huán)：N原子及其取代基具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力，所以核苷酸具有解離性質(zhì)磷酸基團：可以解離的，并且其解離對整個核苷酸的解離所帶的凈電荷量有著重要影響5端3端2.4 核苷酸的連接 核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA第四節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu)一、DNA的結(jié)構(gòu) 二、RNA的結(jié)構(gòu) 一、DNA的結(jié)構(gòu)1(總）（一）DNA的的堿基組成 （二）DNA的一級結(jié)構(gòu) （三）DNA的二級結(jié)構(gòu) （四）DNA的三級結(jié)構(gòu) （一）DNA的堿基組成堿基組成的規(guī)律：1A=T，G=C A+G=C+T2

12、沒有組織和器官的特異性3具有種的特異性4年齡、營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成定義核酸中核苷酸的連接方式和排列順序。5端3端CGADNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種脫氧核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。（二）DNA的一級結(jié)構(gòu)1脫H2O脂鍵相連3，5-磷酸二酯鍵首尾3553連接鍵（二）DNA的一級結(jié)構(gòu)3(線條縮寫)DNA線條縮寫:戊糖5-磷酸PA核苷酸53首端末端PPPPPP A G C T G C OH3-OH 核苷酸順序又稱堿基順序，是蛋白質(zhì)與核酸結(jié)構(gòu)的生物語言。鹼基A G P5 P T PG PC PT P OH 3 書寫方法

13、5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 線條式字母式（二）DNA的一級結(jié)構(gòu)4(字母簡寫)DNA字母簡寫: 5 A P G P C P T P G P C P 3 或 5 A G C T G C 3 堿基序列從左到右表示5 3，由3-, 5磷酸二酯鍵連接。 若兩鏈反向平行，則需注明每條鏈的走向。如： 5A-T-G-C-C-T-G-A 3 3 T-A-C-G-G-A-C-T 5一、核苷酸讀向（二）DNA的二級結(jié)構(gòu)1(總)1DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點 2雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素3DNA雙螺旋的不同類型 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的歷史意義：揭示了生物體遺傳信息儲存及表達的分子機

14、制開創(chuàng)了現(xiàn)代分子生物學(xué)生物學(xué)發(fā)展史上的里程碑DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點 （Watson, Crick, 1953）DNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。形成大溝(major groove)及小溝(minor groove)相間。嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè);磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)，彼此以3,5-磷酸二酯鍵連接，形成DNA分子的骨架。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90角。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點 （Watson, Crick, 1953）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點 （Watson, Crick, 1953）螺旋直徑為2nm，相

15、鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對堿基。堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側(cè)，與對側(cè)堿基形成氫鍵配對（互補配對形式：A=T; GC） 。堿基互補配對 TAGCDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點螺旋表面有一條大溝和一條小溝大溝小溝DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點 （Watson, Crick, 1953）氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。離子鍵屏蔽磷酸基團之間的靜電斥力DNA雙螺旋的不同類型B型DNA（BDNA）:在相對濕度為92%時,所得到的DNA鈉鹽纖維。A型DNA（ADNA）:在相對溫度低于75%時，獲得的DNA鈉鹽纖維。此外還有ZDNA等。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性B-A

16、-DNA、B-DNA和Z-DNA的主要結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點 A-DNAB-DNAZ-DNA螺旋方向右手右手左手每一堿基對旋轉(zhuǎn)角度 32.734.630每一轉(zhuǎn)的堿基對數(shù)1110.4 12堿基對相對螺旋軸的傾斜角度 191.29每一堿基對沿螺旋軸上升的距離0.23nm 0.33nm0.38nm螺距2.46nm3.40nm4.56nm螺旋直徑 2.55nm 2.37nm 1.84nmH-DNA:三條鏈局部螺旋DNA一級結(jié)構(gòu)的改變DNA變異與進化基因突變：個別dNMP（脫氧單磷酸核苷）殘基以至片段DNA在結(jié)構(gòu)、復(fù)制或表型功能的異常變化。隨機性、稀有性、可逆性、少利多害性基因重組：生物在有性生殖的過程中，控

17、制不同性狀的基因自由組合的過程。DNA變異與疾病鐮刀型細胞貧血癥（點突變）癌變一母生九子九子各不同 重組DNA技術(shù)來源于兩個方面的基礎(chǔ)理論研究限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）和基因載體（簡稱載體）。約翰霍普金斯大學(xué)的丹尼爾那森斯、漢彌爾頓史密斯與伯克利加州大學(xué)的沃納亞伯因為限制酶的發(fā)現(xiàn)及研究，而共同獲得1978年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。 基因重組與遺傳工程二、 RNA的分子結(jié)構(gòu)1（一）RNA一級結(jié)構(gòu)（二）RNA的堿基組成（三）RNA的類型（四）RNA的二級結(jié)構(gòu) 4、RNA組成：4種核苷酸（AUGC），有稀有堿基；連接：3,5-磷酸二酯鍵形成：一般以DNA為模板合成，有例外。結(jié)構(gòu)：單鏈線形分子，局

18、部區(qū)域有雙螺旋。 DNA RNA糖 脫氧核糖 核糖堿基 AGCT AGCU 不含稀有堿基 含稀有堿基 雙鏈 單鏈，局部雙鏈 RNA與DNA的差異RNA的結(jié)構(gòu)1234.1 mRNA結(jié)構(gòu)與功能約占總RNA的3%-5%，含量最少，種類最多，壽命較短。成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA含有（細胞核內(nèi)合成）。mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。* mRNA的功能 把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細胞 細胞質(zhì)細胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運mRNAhnR

19、NA翻譯蛋白真核細胞 原核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)原核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)與真核細胞顯著不同：無內(nèi)含子5端無帽狀結(jié)構(gòu)3端不含polyA結(jié)構(gòu)一般為多順反子結(jié)構(gòu)（解釋），即一個mRNA中常含有幾個蛋白質(zhì)信息，能指導(dǎo)幾個蛋白質(zhì)的生物合成，mRNA代謝很快，代謝半衰期一般以秒計，很少達到10min以上。hnRNA 內(nèi)含子(intron)mRNA * 真核hnmRNAmRNA成熟過程 外顯子(exon)* 真核mRNA結(jié)構(gòu)特點：單順反子1. 大多數(shù)真核mRNA的5末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。2. 大多數(shù)真核mRNA的3末端有一個多聚腺苷

20、酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。帽子結(jié)構(gòu) m7G 5ppp 5 Np (O型) m7G 5ppp 5 NmpNp (I型) m7G 5ppp 5 NmpNmpNp (II型) 指5端核糖甲基化的情況mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位mRNA的穩(wěn)定性維系翻譯起始的調(diào)控 帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能eIF4A帽結(jié)合蛋白（CBPs)polyA結(jié)合蛋白(PAB)4.2 轉(zhuǎn)運RNA的結(jié)構(gòu)與功能轉(zhuǎn)運RNA是具有攜帶并轉(zhuǎn)運氨基酸功能的一類小分子核糖核酸，簡稱tRNAtRNA約占總RNA的10-15%。結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)：三葉草型三級結(jié)構(gòu)：倒L型4.2 轉(zhuǎn)運RNA的結(jié)構(gòu)與功能tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點相對分子量較小，分子

21、量25000左右，沉降系數(shù)為4S左右，大約由7090個核苷酸組成。3末端為 CCA-OH， 5末端大多數(shù)為G 含有較多的修飾成分：稀有堿基和稀有核苷 * tRNA的二級結(jié)構(gòu)三葉草形 氨基酸接受臂 DHU環(huán) 反密碼環(huán) 額外環(huán) TC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)（四）RNA的二級結(jié)構(gòu)2(1)（1）tRNA一般由四臂四環(huán)組成。分子由A-U、G-C堿基對構(gòu)成的雙螺旋區(qū)叫做臂；不能配對部分叫環(huán)。葉子臂123（四）RNA的二級結(jié)構(gòu)2(2)（2）三葉草的葉柄叫做氨基酸臂，它包括3，端接受氨基酸的部位CpCpAOH載運氨基酸（四）RNA的二級結(jié)構(gòu)2(3)（3）位于氨基酸臂對面的反密碼環(huán)含有組成該tRNA反密碼子的三個核苷酸

22、。反密碼子環(huán) 反密碼子（四）RNA的二級結(jié)構(gòu)2(4)（4）左臂連接一個二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)），環(huán)上含有二氫尿嘧啶。D環(huán)（四）RNA的二級結(jié)構(gòu)2(5)（5）右側(cè)有一個TC環(huán)（含有T C順序，代表假尿苷）和一個可變環(huán)，不同tRNA的可變環(huán)上核苷酸的數(shù)目變化較大。TC（四）RNA的二級結(jié)構(gòu)2(5)（6）tRNA分子中含有修飾堿基，但多少不等。在某些位置上的核苷酸對于所有的tRNA都是同樣的，或變化很少叫做不變核苷酸。稀有堿基約占全部RNA的80%，核糖體的主要組成部分。rRNA的功能與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)，可分別與mRNA、tRNA作用，催化肽鍵的形成。(1992年,H.F.Noller等證明23S r

23、RNA有核酶活性,催化肽鍵的形成)（見蛋白質(zhì)生物合成）4.3 核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能* rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物（以小鼠肝為例）小亞基30S40SrRNA16S1542個核苷酸18S1874個核苷酸蛋白質(zhì)21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個核苷酸120個核苷酸28S5.85S5S4718個核苷酸160個核苷酸120個核苷酸蛋白質(zhì)31種占總重量的30%49種占總重量的35%核

24、蛋白體的組成4.4 其他小分子RNA及RNA組學(xué)除了上述三種RNA外，細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 snmRNAssnmRNAs的種類核內(nèi)小RNA核仁小RNA胞質(zhì)小RNA催化性小RNA小片段干涉 RNA snmRNAs的功能參與hnRNA和rRNA的加工和轉(zhuǎn)運。4.5 RNA的功能1、RNA在傳遞遺傳信息上的作用2、催化作用3、在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯中起重要調(diào)控作用； 如 miRNA，siRNA等。4、可作為遺傳物質(zhì)（如逆轉(zhuǎn)錄病毒）;RNA即可為遺傳物質(zhì)，又可行使蛋白質(zhì)的功能，

25、故RNA在生命起源于生物進化的研究中有重要意義RNA組學(xué)研究細胞中非信使小RNA（snmRNAs）的種類、結(jié)構(gòu)和功能。同一生物體內(nèi)不同種類的細胞、同一細胞在不同時間、不同狀態(tài)下snmRNAs的表達具有時間和空間特異性。RNA組學(xué)是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的擴充、發(fā)展和延伸。 RNA組學(xué)核酸的性質(zhì)5.1 一般理化性質(zhì)5.2 紫外吸收性質(zhì)5.3 核酸的變性5.4 核酸的復(fù)性和分子雜交5.5 核酸的沉降特性和浮力密度一般理化性質(zhì)兩性電解質(zhì)核酸含酸性的磷酸基團，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離；溶解性DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于一般有機試劑（乙醇沉淀核酸

26、），鈉鹽易溶于水。粘度高一般DNA比RNA粘度高。水解性可被酸、堿或酶水解，DNA比RNA對稀堿穩(wěn)定。RNA的等電點比DNA低的原因，RNA分子中核糖基2-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質(zhì)子的解離，DNA沒有這種作用5.2 紫外吸收性質(zhì)堿基具共軛雙鍵強烈吸收260-290nm波段紫外光，最大吸收峰在260nm附近。紫外吸收性質(zhì)1、DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50g/ml雙鏈DNA40g/ml單鏈DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2、確定所提取的核酸是否純品。 1）DNA： 1.8 純品 OD260/OD280 1.8 RNA 污染 1.8 protein 污染 2）RNA： O

27、D260/OD280 2.0 純品3、紫外可使相鄰T T間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，引起基因突變。A = TC = GT = AT = A紫外A = TC = GT AT A5.3 核酸的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，氫鍵斷裂，變成單鏈，并不涉及共價鍵的斷裂。方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高黏度下降比旋度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時其溶液

28、OD260增高的現(xiàn)象。熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。 Tm：熱變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，DNA紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度，即DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度(melting temperature, Tm)。影響Tm的因素：DNA的均一性G-C含量Tm與G-C含量成正比介質(zhì)中的離子強度離子強度低，Tm低，熔解溫度范圍寬。Tm大小可反映出DNA的均一性：均質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個較小的溫度范圍

29、內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個較寬的溫度范圍內(nèi)。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G、 C含量，可通過經(jīng)驗公式計算： （G+C)%=(Tm-69.3)2.44Tm與介質(zhì)中離子強度有關(guān)：DNA的保存應(yīng)在含鹽的緩沖液中。核酸的復(fù)性和分子雜交DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)：DNA復(fù)性時，其溶液OD260降低。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing) 。影響因素： DNA濃度、溫度、DNA片段大小、堿基重復(fù)序列多少、離子濃度。Cot1/2值：復(fù)性完成一半時的Cot值在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。5.5 核酸分子雜交(hybridization) DNA-DNA雜交雙鏈分子變性 復(fù)性 不同來源的DNA分子探針在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來