大黃素抑制HL60 ADR耐藥細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用

1、摘要】本研究探討中藥大黃素（emodin）對(duì)人白血病耐藥細(xì)胞株HL 60/ADR的增殖、凋亡影響及其相應(yīng)的可能作用機(jī)制。采用 MTT 法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；集落培養(yǎng)法觀察大黃 素對(duì)HL60/ADR克隆形成的影響；細(xì)胞周期分析、線粒體跨膜電位檢測(cè)、Caspase 3酶活性檢測(cè)、Annexin V FITC/PI法、TdT酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）分析凋亡 細(xì)胞；RT PCR及Western blot法檢測(cè)大黃素作用后不同時(shí)間段bcl2、c myc mRNA及 Bcl 2、 c Myc、 Caspase 3 前體蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明， 大黃素對(duì) HL 60/ADR細(xì)胞增殖具有明

2、顯的抑制作用，呈時(shí)間和濃度依賴性。較低濃度大黃素即可抑制 HL 60/ADR細(xì)胞集落形成，IC50值為5.79 p mol/L。細(xì)胞周期分析顯示，與對(duì)照組比較， 40、80 p mol/L濃度組細(xì)胞被阻滯于G0/G1期比率明顯增高（pv 0.01）, G2/M期細(xì)胞比率 降低（pv0.01 ），而20 p mol/L濃度組細(xì)胞周期改變差異不具有顯著性（p 0.05），各濃度 組均檢測(cè)到典型的亞二倍體峰（凋亡峰）。大黃素作用12小時(shí)HL 60/ADR細(xì)胞線粒體跨 膜電位降低，Annexin V FITC/PI法檢測(cè)到早期凋亡細(xì)胞，作用24小時(shí)caspase 3酶活性 顯著升高，作用 48 小時(shí)

3、TUNEL 法檢測(cè)到晚期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率呈藥物濃度依賴性。 大黃素作用 HL 60/ADR 細(xì)胞不同時(shí)間段， bcl 2、 c myc mRNA 和 Bcl 2、 c Myc、 Caspase 3前體蛋白表達(dá)水平均有不同程度下調(diào)，并呈時(shí)間依賴性。結(jié)論 ：大黃素 能夠有效抑制HL 60/ADR細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，bcl2、c myc表達(dá)水平下調(diào)，線粒體跨膜電位水平降低和caspase3激活可能參與了該過(guò)程?！娟P(guān)鍵詞】 細(xì)胞增殖Inhibitory Effects of Emodin on Drug resistant HL 60/ADR Cell Proliferation and It

4、s Induction of ApoptosisCHEN Ying Yu, ZHENG He Yong, HU Jian Da, ZHENG Zhi Hong, ZHENG Jing, LIAN Xiao Lan, L Lian HuangFujian Institute of Hematology, Union Hospital, Fujian Medical University,Fuzhou 350001,ChinaAbstract The study was aimed to investigate the effects of emodin on the proliferation

5、and apoptosis of adriamycin resistant HL 60/ADR cells, and to explore the underlying mechanism. The cell viability and colony formation were detected by MTT assay and colony formation assay respectively. Apoptotic cells were tested by means of cell cycle analysis, mitochondrial transmembrane potenti

6、al levels, caspase 3 activity detection, Annexin V FITC/PI staining and TUNEL labeling. RT PCR was used to analyze the bcl 2 and c myc mRNA expressions. The protein expressions of Bcl 2， c Myc and caspase 3 precursor were determined by Western blot. The results showed that HL 60/ADR cell growth was

7、significantly inhibited by emodin in dose and time dependent manners. Cell colony formation obviously decreased with IC50 5.79 p mol/L. G0/G1 phase cell population increased while G2/M phase cells decreased in 40 and 80 p mol/L groups compared with control group (pv0.01) , and no significant differe

8、nce of cell cycle was observed in 20 p mol/L grou(p p 0.05).The typical hypo diploid peak (apoptotic peak) appeared in each dose group. The levels of mitochondrial transmembrane potential of HL 60/ADR cells decreased and caspase 3 activity increased when incubated with emodin for 12 and 24 hours res

9、pectively. Apoptosis occured in a dose dependent manner,and its earlier and later stages were identified by Annexin V FITC/PI staining and TUNEL labeling methods respectively. The expressions of bcl 2,c myc mRNA and Bcl 2,c Myc,caspase 3 precursor protein were all down regulated in a time dependent

10、manner after treatment with emodin at different times. It is concluded that emodin efficiently inhibits growth and induces apoptosis on HL 60/ADR cells, which may be related with the down regulation of mitochondrial transmembrane potential and expressions of bcl 2 and c myc, as well as up regulation

11、 of caspase 3 activity.Key words emodin; HL 60/ADR cell; proliferation; apoptosisJ Exp Hematol 2007; 15（5）:955-960大黃素（emodin）,化學(xué)名稱為6甲基一1,3,8 三羥基蔥醌，是從大黃屬、鼠李屬、 蓼屬和番瀉葉等中藥中提取的一種蒽醌類單體化合物。研究表明，大黃素能夠抑制包括神經(jīng) 外胚層腫瘤、肺癌、肝癌、髓系白血病等多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡1-5，具有明顯 的抗腫瘤活性，但對(duì)人白血病耐藥細(xì)胞株HL60/ADR作用的研究未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)多種檢測(cè)方法觀察大黃素在不同

12、作用濃度和不同作用時(shí)間下對(duì)HL60/ADR細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并對(duì)其中可能涉及的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。細(xì)胞株及試劑HL 60/ADR是由阿霉素誘導(dǎo)的人白血病耐藥細(xì)胞株，引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研 究所。大黃素為南京青澤醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品，溶解于二甲亞砜（DMSO ）中，配制成 50 000 p mol/L的母液濃度，-20 C保存。細(xì)胞生長(zhǎng)的MTT法測(cè)定HL 60/ADR細(xì)胞的初濃度為2.0X105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板（Costar）。實(shí)驗(yàn)組分 別含10、20、40 p mol/L大黃素，對(duì)照組含與最高濃度組等量的DMSO。每組重復(fù)3個(gè)平 行孔，每孔100 p l。用藥24、48、

13、72、96和120小時(shí)后，每孔加入5 mg/ml MTT（Sigma 公司產(chǎn)品）10 p l,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，小心地吸去上清，每孔加入100 p l DMSO，在酶 標(biāo)儀（STAT FAX 2100型）上充分震蕩混勻，進(jìn)行雙波長(zhǎng)492 nm和630 nm比色，測(cè)定 吸光度值（A值），繪制HL 60/ADR細(xì)胞增殖曲線。集落形成試驗(yàn)收集細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板（Costar），分為對(duì)照組和1.25、2.5、5、10和20 p mol/L 5種濃度大黃素加藥組。每組重復(fù)3個(gè)平行孔，每孔接種200個(gè)細(xì)胞，總體積1 ml,并含 0.7%的甲基纖維素，常規(guī)培養(yǎng) 10 天后倒置顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)。大于 4

14、0 個(gè)的細(xì)胞團(tuán)為 1 個(gè)集落，對(duì)照組集落形成率大于 40%者實(shí)驗(yàn)有效。集落形成率= （各組集落數(shù)/200） X100%； 集落形成抑制率=（1加藥組集落數(shù)/對(duì)照組集落數(shù)）X100%。以藥物濃度對(duì)抑制率做線性 回歸計(jì)算IC50值6 （IC50值為集落形成抑制率達(dá)到50%時(shí)的藥物濃度）。線粒體跨膜電位改變檢測(cè)收集對(duì)照組和20、40、80 p mol/L大黃素加藥組作用12小時(shí)的細(xì)胞，按照 MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測(cè)試劑盒(Biovision)說(shuō)明書進(jìn)行操作，其具體步驟為：加1 p l MitoCapture Reagent到1 ml 37C預(yù)熱的孵育緩沖液中充分混勻后，13 000X

15、g離心1分 鐘取上清，將約1.0 X106細(xì)胞沉淀團(tuán)重懸于該上清液中，于37C、5% CO2溫箱孵育15 20分鐘，離心棄上清，細(xì)胞沉淀團(tuán)重懸于1 ml 37C預(yù)熱的孵育緩沖液中，立即在流式細(xì) 胞儀(BD FACScan)上檢測(cè)結(jié)果。早期凋亡細(xì)胞的Annexin V FITC/PI檢測(cè)收集對(duì)照組和20、40、80 p mol/L大黃素加藥組作用12小時(shí)的細(xì)胞，按照Annexin V FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Beckton Dickinson)說(shuō)明書操作。用1Xbinding buffer調(diào)整細(xì)胞濃 度為1.0 X 106/ml，吸取100 p l到另一 EP管，加入5 p l FITC和

16、5 p l PI試劑，輕輕混勻， 室溫放置暗處15分鐘，再加入400 p l 1Xbinding buffer，在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。Caspase3酶活性檢測(cè)20、 40、 80 p mol/L 大黃素作用 24 小時(shí)后收集對(duì)照組和各藥物組細(xì)胞，按照 CaspGLOWTM Fluorescein Active Caspase 3 Staining Kit(Biovision)說(shuō)明書進(jìn)行操作。從 1.0 X 106/ml濃度的細(xì)胞懸液中吸取 300 p l,加 1 p l FITC DEVD FMK,于 37C、5% CO2 溫箱孵育0.5-1小時(shí)，離心棄上清，將細(xì)胞重懸于500 p

17、l工業(yè)Wash Buffer,離心，再重復(fù) 后者1次，最后將細(xì)胞重懸于300 p l Wash Buffer，置于冰上，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。細(xì)胞凋亡的TdT酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)米用 DeadEndTMColorimetric TUNEL System 試劑盒(Promega),其步驟如下：收集對(duì) 照組和20、40、80 p mol/L大黃素加藥組作用48小時(shí)后的細(xì)胞，涂片，干燥后用4%低聚 甲醛固定，0.2% TritonX 100滲透細(xì)胞，緩沖液平衡后，滴加TUNEL反應(yīng)液，置于濕盒 內(nèi)，37C孵育60分鐘，2XSSC終止反應(yīng)，0.3% H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，

18、再與辣根 過(guò)氧化物酶連接的抗體反應(yīng)，加DAB底物，顯色。鏡下觀察細(xì)胞核染成棕褐色者為凋亡細(xì) 胞，計(jì)數(shù) 1 000 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率。細(xì)胞周期分析收集20、40、80 p mol/L各組藥物作用48小時(shí)后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，按Cell Cycle Test Plus DNA Reagent Kit (Beckton Dickinson)說(shuō)明書操作。先用 1 ml Buffer Solution 重懸細(xì)胞， 重復(fù)3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0X 106/ml,加250 p l Solution A混勻后室溫孵育10分鐘， 再加入Solution B 200 p l,室溫孵育10分鐘，最后加200 p

19、 l Solution C,混勻，冰上孵 育10min,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。bcl 2、 c myc mRNA 表達(dá)變化的 RT PCR 檢測(cè)收集對(duì)照組和40 p mol/L大黃素作用12、24、48、72小時(shí)后的細(xì)胞，用TRIZOL試劑（Life Technology）提取總RNA,取2 p g反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以B actin為內(nèi)參照進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。B actin 上游引物：5 GGCATGGGTCAGAAGGATTCC3,下游引物：5ATGTCA CGCACGATTTCCCGC3,擴(kuò)增產(chǎn)物為 500 bp。 bcl 2 上游引物： 5CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC3

20、, 下 游 引 物 ：5CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC 3, 擴(kuò)增產(chǎn)物為 318 bp。反應(yīng)條件：94C預(yù)變性 5分鐘，94C變性1分鐘，62C退火30秒，72C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸7分 鐘。 c myc 上游引物： 5 TCCTGGCAAAAGGTCAGAGT3,下游引物： 5GTTGTGTGTTCGCCTCTTGA 3，擴(kuò)增產(chǎn)物為265 bp。反應(yīng)條件：94C預(yù)變性5分鐘， 94C變性1分鐘，56C退火45秒，72C延伸30秒，共32個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀作條帶密度掃描。結(jié)果以目的基因和B actin 條帶

21、灰度值比值表示。Western blot 檢測(cè)收集對(duì)照組和40 p mol/L大黃素作用12、24、48小時(shí)后的HL 60/ADR細(xì)胞，用PBS 洗滌后加細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)紫外分光光度儀（Beckman DU640）定量后，取各組等 量總蛋白進(jìn)行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上；膜用封閉液封閉1 小時(shí)，加鼠抗人 Bcl 2 單克隆抗體、鼠抗人 c Myc 單克隆抗體、鼠抗人 caspase 3 前 體單克隆抗體及兔抗人B actin單克隆抗體（SantaCruz公司產(chǎn)品），4C過(guò)夜，TBS洗膜后 加辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔抗鼠或羊抗兔 IgG 抗體,于室溫孵育 1 小

22、時(shí)，洗膜后顯色。檢測(cè) 過(guò)程參照KPL公司蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。單因素方差分析比較各組間差異，結(jié)果以均數(shù)土 標(biāo)準(zhǔn)差（土 SD）表示。結(jié)果大黃素對(duì)HL 60/ADR細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度大黃素在不同作用時(shí)間對(duì)HL 60/ADR細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，并呈時(shí) 間和濃度依賴性，濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯（圖 1）。大黃素對(duì) HL 60/ADR集落形成亦具有明顯抑制作用，IC50值為5.79 p mol/L （表1）。線粒體跨膜電位的變化藥物作用12小時(shí)后，對(duì)照組線粒體跨膜電位下降的細(xì)胞數(shù)很少，占0.51%； 20 p

23、mol/L、 40 p mol/L組分別為5.47%、15.90%； 80 p mol/L組線粒體跨膜電位下降的細(xì)胞數(shù)明顯增 多，占 52.44%（圖 2）。早期凋亡細(xì)胞的比率大黃素作用HL60/ADR 12小時(shí)即可以檢測(cè)到早期凋亡細(xì)胞,20、40 p mol/L藥物組 凋亡率為8.05%、23.70%, 80 p mol/L作用組的凋亡率最高，達(dá)到35.01%，而對(duì)照組僅2.12% (圖 3)。Caspase 3酶活性大黃素作用24小時(shí)對(duì)照組caspase3酶活性增高細(xì)胞數(shù)較少，占(2.300.38)%, 20、40和80 p mol/L組細(xì)胞caspase 3酶活性依次增高，增高細(xì)胞數(shù)分別

24、為(14.60 1.51) %、 (27.125.56) %和(70.791.60) %，各加藥組與對(duì)照組比較差異具有顯著性(pv0.005) (圖 4)。晚期凋亡細(xì)胞的比率大黃素作用細(xì)胞 48 小時(shí)后，對(duì)照組僅偶見(jiàn)棕褐色晚期凋亡細(xì)胞，占(0.370.15)%。20、 40、80 p mol/L加藥組均可見(jiàn)數(shù)量不等的棕褐色凋亡細(xì)胞，凋亡率分別為(10.47 1.08)%、 (39.90 1.48)%和(60.73 1.80)%，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(p0.005 )。細(xì)胞周期分析20、40、80 p mol/L大黃素作用HL 60/ADR 48小時(shí)后，各組均可檢測(cè)到亞二倍體峰(凋 亡峰)

25、,隨藥物濃度增加,細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增高, 3 個(gè)加藥組凋亡率分別為(8.050.45) %、(31.332.32)%和(48.576.43)%,80 p mol/L作用組48小時(shí)最高凋亡率可達(dá)到55.72%(圖 5)。與未加藥對(duì)照組比較，40、80 p mol/L藥物作用組G0/G1期細(xì)胞增多(p0.01) , G2/M 期細(xì)胞減少(p 0.05 ) (表 2)。大黃素對(duì)bcl2、c myc mRNA和Bel 2、c Myc、caspase 3前體蛋白表達(dá)的影響大黃素對(duì) HL 60/ADR bcl 2、 c myc mRNA 和 Bcl2、 c myc、 caspase3前體蛋白表達(dá)的影響呈時(shí)

26、間依賴性， bcl2 mRNA、 Bcl 2蛋白表達(dá)水平在藥物作用12小時(shí)后即明顯低于對(duì)照組(pv0.01 )，作用時(shí)間越長(zhǎng)，降低水平越顯著；而c myc mRNA 和蛋白表達(dá)12小時(shí)作用組與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(p 0.05),作用24小時(shí)后表達(dá)水平開(kāi) 始明顯降低(pv0.01 )， 48小時(shí)作用組降低更明顯。caspase3前體蛋白表達(dá)水平在大黃素作用24小時(shí)后明顯低于對(duì)照組(pv0.01)(圖6、圖7)。討論白血病多藥耐藥(multidrug resistence,MDR)是指白血病細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)、功能和殺傷機(jī)制 不同的不同種藥物產(chǎn)生耐受，一旦細(xì)胞對(duì)某種藥物產(chǎn)生耐受，即可以對(duì)多種其它藥物耐

27、受， 是造成臨床白血病患者化療失敗的主要原因之一。目前應(yīng)用藥物進(jìn)行白血病MDR的研究報(bào) 道較常見(jiàn)，如環(huán)抱素A、維拉帕米、蛋白激酶C類抑制劑、氯丙嗪等，由于存在價(jià)格昂貴、 毒副作用大、不宜長(zhǎng)期應(yīng)用等缺點(diǎn)限制了在臨床上的廣泛使用。我國(guó)學(xué)者應(yīng)用浙貝母堿7、 漢防己甲素8、三氧化二砷9等傳統(tǒng)中藥進(jìn)行抗白血病 MDR 的研究已取得了可喜成 績(jī)。大黃素是從多種中藥中提取的一種蒽醌類單體化合物，其抗腫瘤活性已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所 證實(shí)，Pecere等1通過(guò)體內(nèi)外研究表明，大黃素能夠?qū)ι窠?jīng)外胚層腫瘤選擇性地產(chǎn)生毒 性作用，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Wang等2研究發(fā)現(xiàn)，大黃素是人肺腺癌細(xì)胞系CL5 Cyt P450 1A1

28、 和 1B1 mRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)劑，而 Cyt P450 表達(dá)上調(diào)，提示線粒體 PT 通道開(kāi) 放，可導(dǎo)致 CytC 釋放，引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)。將大黃素作用于白血病 MDR 細(xì)胞及相應(yīng) 分子機(jī)理研究卻未見(jiàn)報(bào)道，針對(duì)凋亡抑制是 MDR 發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)重要原因，本研究選擇 阿霉素誘導(dǎo)的多藥耐藥相關(guān)蛋白(m ultidrug resistence associated protein ,MRP )高表達(dá)的 人白血病細(xì)胞株HL 60/ADR作為研究對(duì)象，探討大黃素對(duì)HL 60/ADR細(xì)胞增殖及凋 亡的影響，并分析其中可能涉及的作用機(jī)制，為該藥今后臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，大黃素

29、能夠明顯抑制HL60/ADR細(xì)胞增殖，呈時(shí)效和量效關(guān)系，較低濃度大黃素即可以抑制HL60/ADR細(xì)胞集落形成，IC50值為5.79 “mol/L。大黃素作用 48 小時(shí)后，細(xì)胞周期分析可見(jiàn)典型的亞二倍體峰(凋亡峰)， G0/G1 期細(xì)胞比例明顯高 于對(duì)照組。以上結(jié)果提示，大黃素抑制HL 60/ADR細(xì)胞增殖可能是通過(guò)抑制DNA合成， 主要作用于HL60/ADR細(xì)胞的G0/G1 期,從而阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。集落形成試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示大黃素的細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)，同時(shí)也表明其對(duì)HL60/ADR細(xì)胞可能具有較強(qiáng)的抑制作用，提示該藥具備較好的臨床抗腫瘤應(yīng)用前景。通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大 黃素作用 1

30、2 小時(shí)，線粒體跨膜電位降低的細(xì)胞數(shù)明顯增加； Annexin V FITC/PI 法證實(shí)， 大黃素可以誘導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡，作用24小時(shí)后caspase 3酶活性升高的細(xì)胞數(shù)顯著增多； 作用 48 小時(shí)， TUNEL 法從形態(tài)學(xué)觀察到典型的晚期凋亡細(xì)胞，并且細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)明顯 劑量依賴性，藥物濃度越高，細(xì)胞凋亡率也越高，這說(shuō)明大黃素能夠有效誘導(dǎo) HL 60/ADR 細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由多因素引起、多分子參與的復(fù)雜過(guò)程。 c myc 是一個(gè)重要的細(xì)胞原癌基 因，主要通過(guò)基因擴(kuò)增和染色體易位重排激活，表達(dá)產(chǎn)物為分子量約 67 kD 的序列特異性 DNA 結(jié)合蛋白，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，在

31、髓性白血病細(xì)胞中存在高表達(dá)，本 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， c myc 在大黃素誘導(dǎo) HL 60 細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用5。 bcl 2 是一個(gè)重要的抗凋亡基因，又是目前已知的與腫瘤耐藥密切相關(guān)的耐藥基因，臨床 上大部分血液系統(tǒng)腫瘤存在 bcl 2 的高表達(dá)，從而導(dǎo)致患者對(duì)放療和化療產(chǎn)生耐受。 bcl 2 位于線粒體內(nèi)膜，在維持線粒體跨膜電位中發(fā)揮重要作用，可通過(guò)干擾 Cyt C 的釋放， 阻止 caspase 的激活。線粒體依賴性凋亡通路是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，而細(xì)胞凋亡主要 途徑的中心環(huán)節(jié)就是 caspase 的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)，其中 caspase 3 是該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng) 分子10。 A

32、sakura 等11認(rèn)為 MDR 細(xì)胞具有對(duì)線粒體損傷的敏感性，直接損傷線粒體 將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，c myc和bcl 2均高表達(dá)的HL 60/ADR細(xì)胞在 大黃素作用后，兩種基因的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均有明顯的下降，呈時(shí)間依賴性，作用 12 小時(shí)即可觀察到線粒體跨膜電位下降細(xì)胞數(shù)明顯增加， bcl 2 表達(dá)水平開(kāi)始下調(diào)，作用 24 小時(shí) cmyc、caspase3 前體表達(dá)下調(diào)，作用時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)水平越低，這表明大黃素可通過(guò)抑制bcl 2、 myc的表達(dá)，促進(jìn)caspase 3的剪切活化，從而誘導(dǎo)HL 60/ADR 細(xì)胞凋亡，線粒體途徑可能參與了該過(guò)程。參考文獻(xiàn)：1金倩;氯地酊聯(lián)合激光治療座瘡158例療效觀察J;廣東醫(yī)學(xué);1997年10期2董新亭，李衛(wèi)莉，張隨學(xué);自擬粉刺消治療座瘡126例J沖國(guó)中醫(yī)藥科技;1999年06期3查旭山,陳修飏;尋常座瘡治療體會(huì)J;江西中醫(yī)藥; HYPERLINK http:/www.yixue68.eom/xyfm/class/.2002 http:/www.yixue68.eom/xyfm/class/.2002 年 05 期4張隨學(xué)，譚正輝，孫葉梅，李梅，俞玉芳，韓峰;3003例座瘡患者特征分析與控制對(duì)策J;中 華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志; H