中藥制劑檢測(cè)技術(shù)-第六章-中藥制劑的含量測(cè)定技術(shù)概要課件

1、第一節(jié) 紫外-可見(jiàn)分光光度法第二節(jié) 薄層色譜掃描法第三節(jié) 高效液相色譜法第四節(jié) 氣相色譜法第五節(jié) 浸出物測(cè)定法第六節(jié) 揮發(fā)油測(cè)定法第七節(jié) 容量分析法第六章 中藥制劑的含量測(cè)定技術(shù)高曉波、紀(jì)從蘭老師編寫(xiě)第一節(jié) 紫外-可見(jiàn)分光光度法第六章 中藥制劑的含量測(cè)定技術(shù)1. 定義 紫外-可見(jiàn)分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry）系指通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在紫外-可見(jiàn)光區(qū)(200760nm)對(duì)光的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，進(jìn)行物質(zhì)定性定量分析的方法。 2. 特點(diǎn) 設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏度和準(zhǔn)確度較高等。3. 適用范圍 中藥制劑定性鑒別、雜質(zhì)檢查及含量測(cè)定。1.

2、定義 紫外-可見(jiàn)分光光度法（Ultraviolet一、儀器工作原理 （一）紫外-可見(jiàn)分光光度儀的構(gòu)造光源單色器吸收池檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、儀器工作原理 光源單色器吸收池檢測(cè)器數(shù)據(jù) 1. 光源（輻射源) （1）可見(jiàn)光光源：為熱輻射光源，如鹵鎢燈、碘鎢燈、鎢絲燈 （白熾燈）。 （2）紫外光源：多為氣體放電光源，如氫、氘、氙放電燈及汞 燈等。 2. 單色器 是能從光源的復(fù)合光中分出測(cè)量所需波長(zhǎng)單色光的光學(xué)裝置。 （1）棱鏡單色器：有玻璃和石英兩種材料。是依據(jù)光的折射率不同，而將其分成不同波長(zhǎng)的單色光。 1. 光源（輻射源) （2）光柵單色器：是利用光的衍射和干涉作用制成的?？捎糜谧贤?、可見(jiàn)和近紅外光

3、譜區(qū)域，具有良好的、幾乎均勻一致的色散率，且具有適用波長(zhǎng)范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制作等優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的色散元件。缺點(diǎn)是各級(jí)光譜會(huì)重疊而產(chǎn)生干擾。3. 吸收池 又叫比色皿。是用于盛放分析試液并提供一定吸光厚度的器皿。一臺(tái)分光光度計(jì)配有幾組厚度不同的吸收池，吸收池的大小規(guī)格從幾毫米到幾厘米不等，最常用的是1厘米的吸收池。 （1）石英池：適用于可見(jiàn)光區(qū)及紫外光區(qū)。 （2）玻璃吸收池：只能用于可見(jiàn)光區(qū)。（2）光柵單色器：是利用光的衍射和干涉作用制成的?？捎糜谧贤?.檢測(cè)器 是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換元件檢測(cè)透過(guò)光的光通量大小，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)的裝置。 檢測(cè)器應(yīng)在測(cè)量的光譜范圍內(nèi)具有高的靈

4、敏度；線(xiàn)性關(guān)系好、線(xiàn)性范圍寬；對(duì)不同波長(zhǎng)的輻射響應(yīng)性能相同且可靠；有好的穩(wěn)定性和低的噪音水平等特點(diǎn)。 （1）光電池：常用的光電池有硒電池和硅光電池。 （2）光電管：它以一彎成半圓柱且內(nèi)表面涂上一層光敏材料的鎳片作為陰極，而置于圓柱形中心的一金屬絲作為陽(yáng)極，密封于高真空的玻璃或石英中構(gòu)成的，當(dāng)光照到陰極的光敏材料時(shí)，陰極發(fā)射出電子，被陽(yáng)極收集而產(chǎn)生光電流。真空光電二極管 4.檢測(cè)器 是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換元件檢測(cè)透過(guò)光的光通量大小，并將（3）光電倍增管：光電倍增管是一種加上多級(jí)倍增電極的光電管，其外殼由玻璃或石英制成，陰極表面涂上光敏物質(zhì)，在陰極、陽(yáng)極間裝有一系列次級(jí)電子發(fā)射極，D1、D2等。光電倍增管

5、工作原理圖 （3）光電倍增管：光電倍增管是一種加上多級(jí)倍增電極的光電管，5. 信號(hào)指示系統(tǒng) 是把檢測(cè)到的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來(lái)。常用的信號(hào)指示裝置有直讀檢流計(jì)、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動(dòng)記錄裝置等。常用的顯示方式有數(shù)字顯示、熒光屏顯示、曲線(xiàn)掃描及結(jié)果打印等多種。高性能的儀器還帶有數(shù)據(jù)站，即可對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行操作控制，又可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 5. 信號(hào)指示系統(tǒng) 是把檢測(cè)到的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或（二）紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的工作原理 1. 單光束分光光度計(jì)的工作原理 國(guó)產(chǎn)722型、751 型、724型、英國(guó)SP500型以及Backman DU-8型等均屬于此類(lèi)光度計(jì)。光學(xué)系統(tǒng)工作原理圖

6、 （二）紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的工作原理 1. 單光束分單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)原理圖 2. 單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)的工作原理 儀器有國(guó)產(chǎn)710型、730型、740型等。單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)原理圖 2. 單波長(zhǎng)雙光束 3. 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)的工作原理 紫外分光光度計(jì)（200400nm）、可見(jiàn)分光光度計(jì)（400800nm）和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（2001000nm）。雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)光路示意圖 3. 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)的工作原理雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)光 二、儀器操作通法（一）操作通法 1. 儀器接通電源，預(yù)熱。 2. 根據(jù)測(cè)定波長(zhǎng)，選擇相應(yīng)光源，繼續(xù)預(yù)熱（各型號(hào)儀器在操作順序上略有區(qū)別）。 3. 靈敏度鈕

7、置1檔。 4. 將盛有供試品溶液及空白（參比）溶液的吸收池放入吸收池架，使空白（參比）溶液置光路位置，蓋好供試品室蓋。 5. 量程選擇鈕置T位置。 二、儀器操作通法 1. 儀器接通電源，預(yù)熱。 6. 斷開(kāi)光路調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，使顯示為0。打開(kāi)光路調(diào)節(jié)儀器透光率，使顯示為100%。 7. 量程選擇鈕置A位置。 8. 將供試品置于光路中，讀取供試品的吸光度值。 9. 儀器使用完畢，取出吸收池，關(guān)機(jī)，登記。 10. 不同型號(hào)的紫外分光光度計(jì)其操作方法和要求亦有所不同，使用前應(yīng)詳細(xì)閱讀使用說(shuō)明書(shū)。 6. 斷開(kāi)光路調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，使顯示為0。打開(kāi)（二）注意事項(xiàng)1. 量瓶、移液管及吸收池 均應(yīng)經(jīng)洗凈、校正后使用

8、。2. 吸收池的校正 3. 吸收池使用方法 使用前的處理；吸收池使用；使用后的處理。4. 狹縫寬度的選擇 5. 吸光度的測(cè)定6. 制劑含量的測(cè)定（二）注意事項(xiàng)1. 量瓶、移液管及吸收池 均應(yīng)經(jīng)洗凈、校 三、含量測(cè)定（一）基本原理紫外-可見(jiàn)分光光度法的定量分析依據(jù)是朗伯-比爾定律。 數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=KCL A為吸光度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為液層厚度。吸收系數(shù)：百分吸收系數(shù)、摩爾吸收系數(shù)。中國(guó)藥典采用百分吸收系數(shù)。 三、含量測(cè)定紫外-可見(jiàn)分光光度法的定量分析依據(jù)是朗伯-（二）操作步驟 1. 對(duì)照溶液品與供試品溶液的制備 2. 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的校正 （1）波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的校正吸光度準(zhǔn)確度

9、的標(biāo)準(zhǔn)范圍波長(zhǎng)（nm）吸收強(qiáng)度百分吸收系數(shù)相對(duì)偏差范圍235257313350最小最大最小最大124.5 144.0 48.62 106.6 123.0126.0142.5146.047.050.3105.5108.5（二）操作步驟 1. 對(duì)照溶液品與供試品溶液的制備吸光度（2）吸光度的校正鉻酸鉀溶液的吸光度/nm吸光度A/nm吸光度A/nm吸光度A/nm吸光度A200.45593100.15183800.92814600.01732300.16753100.04583900.68414700.00832400.29333200.06204000.38724800.00352500.49623

10、300.14574100.19724900.00092600.63453400.31434200.12615000.00002700.74473500.55284300.08412800.72353600.82974400.5352900.42953700.99144500.0325（2）吸光度的校正鉻酸鉀溶液的吸光度/nm吸光度A/nm（3）雜散光的檢查 雜散光的檢查試劑名稱(chēng)試劑濃（g/100ml）測(cè)定用波長(zhǎng)（nm）透光率（%）碘化鈉亞硝酸鈉1.00 5.002203400.80.8（3）雜散光的檢查 雜散光的檢查試劑名稱(chēng)試劑濃（g/100m 3. 選擇測(cè)量條件 顯色反應(yīng)的條件、消除干擾物質(zhì)

11、的方法、測(cè)量波長(zhǎng)、參比溶液、及測(cè)量波長(zhǎng)、吸光度范圍及儀器狹縫寬度的選擇。 4. 進(jìn)樣測(cè)試 5. 含量計(jì)算 3. 選擇測(cè)量條件 顯色反應(yīng)的條件、消除干擾物質(zhì) （三）含量測(cè)定的方法 1. 單組分樣品的定量分析 （1）吸收系數(shù)法：按藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A），根據(jù)A=KCL與藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的被測(cè)物質(zhì)的百分吸收系數(shù)， 計(jì)算供試品溶液的濃度C供（g/100ml）。 含量（W/W）=C供D供V樣100W供 （三）含量測(cè)定的方法 1. 單組分樣品的定量分析 如中國(guó)藥典駐車(chē)丸中總生物堿的含量測(cè)定、前列舒丸中牡丹皮的含量測(cè)定等采用本法。先計(jì)算C供，再計(jì)算出藥品中被測(cè)成分的含

12、量（W/W）。含量計(jì)算公式有兩種：含量（mg/丸）=C供（mg/ml)D供V樣(ml)平均丸重（g/丸）W樣（g）含量（標(biāo)示量%）=C供（mg/ml)D供V樣(ml)平均丸重（g/丸）W樣（g)標(biāo)示含量（mg/丸）100% 如中國(guó)藥典駐車(chē)丸中總生物堿的含量測(cè)定、前列舒丸中 （2）對(duì)照品比較法：按藥品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，在相同條件下，在規(guī)定波長(zhǎng)處分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度，按 計(jì)算供試品溶液中待測(cè)組分的濃度。 式中：AR為對(duì)照品溶液的吸光度；AX為供試品溶液的吸光度；CR為對(duì)照品溶液的濃度；CX為供試品溶液的濃度。中國(guó)藥典華山參片中生物堿的含量測(cè)定、黃楊寧片中環(huán)維黃楊星D的含量測(cè)定均采用本法

13、。 （2）對(duì)照品比較法：按藥品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，在相同條件下，在規(guī)（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（工作曲線(xiàn)法）：配制一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，選擇合適的參比溶液，在相同條件下分別測(cè)定各對(duì)照品溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制A-C曲線(xiàn)，稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或工作曲線(xiàn)。然后在完全相同的條件下測(cè)定樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(或回歸直線(xiàn))上查出樣品溶液的對(duì)應(yīng)濃度，或代入回歸方程，求出樣品溶液的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（工作曲線(xiàn)法）：配制一系列不同濃度的對(duì)照品溶 在做精密測(cè)量時(shí)，用對(duì)照品溶液的濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求出回歸直線(xiàn)方程（相關(guān)系數(shù)r0.999），繪出回歸直線(xiàn)代替標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以盡量消除偶然誤差。 亦可

14、利用計(jì)算器將一系列對(duì)照品溶液的濃度與相應(yīng)的吸光度進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸，求出回歸方程（相關(guān)系數(shù)0.9990），將供試品溶液的吸光度代入回歸方程，算出供試品溶液的濃度。 回歸方程：A=a+bC 式中，A為被測(cè)溶液吸光度；C為被測(cè)溶液濃（g/ml）；a為截距；b為斜率。 中國(guó)藥典槐米中蘆丁及青黛中靛藍(lán)的含量測(cè)定，復(fù)方皂礬丸中的硫酸亞鐵，獨(dú)一味膠囊、益心酮片、消咳喘糖漿和排石顆粒中的總黃酮，桂林西瓜霜中的總生物堿的含量測(cè)定等均使用該法。 在做精密測(cè)量時(shí)，用對(duì)照品溶液的濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求出回 2. 混合物的測(cè)定方法 當(dāng)待測(cè)組分彼此不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)，根據(jù)吸收定律的加和性，不需化學(xué)分離，可同時(shí)測(cè)定樣品中兩種或

15、多種組分的含量。 當(dāng)溶液中同時(shí)存在兩組分a和b時(shí)，它們的吸收峰相互重疊的程度有三種情況，如圖所示?；旌辖M份吸收光譜重疊示意圖 2. 混合物的測(cè)定方法 混合組份吸收光譜重疊示意 （1）在最大吸收峰處互不重疊：如圖 (1)，可分別在1和2處用單組分樣品的測(cè)定方法，先后測(cè)定組分a和b的濃度。 （2）在最大吸收峰處部分重疊：如圖 (2)，在1處，組分b無(wú)吸收，在2處，組分a和b均有吸收。則可先在1處用單組分樣品的測(cè)量方法，測(cè)定樣品溶液中組分a的濃度；然后在2處測(cè)定樣品溶液的吸光度Aab2，根據(jù)吸光度的加和性原則，計(jì)算組分b的濃度。 （3）兩組分在最大吸收峰處相互重疊：如圖 (3)，常采用解線(xiàn)性方程組法

16、。選擇兩個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)1和2，首先測(cè)定兩組分在兩波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)的值，然后在兩波長(zhǎng)處測(cè)定樣品溶液的吸光度，最后用解線(xiàn)性方程組的方法求出兩組分的濃度。 （1）在最大吸收峰處互不重疊：如圖 (1)，可分別在1和（4）等吸收雙波長(zhǎng)測(cè)定法：對(duì)于圖 (3)的情況，可利用等吸收雙波長(zhǎng)測(cè)定法對(duì)其中一種組分或兩種組分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。操作步驟：選擇參比與測(cè)定波長(zhǎng)；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；含量測(cè)定等吸收雙波長(zhǎng)測(cè)定法示意圖 （4）等吸收雙波長(zhǎng)測(cè)定法：對(duì)于圖 (3)的情況，可利用等吸收 （5）導(dǎo)數(shù)光譜法：導(dǎo)數(shù)光譜法又稱(chēng)微分光譜法，是一種消除光譜干擾的方法。以吸光度A對(duì)波長(zhǎng)的吸收光譜稱(chēng)為零階光譜，對(duì)吸收光譜進(jìn)行一級(jí)微分，即可得到(dA

17、/d)-曲線(xiàn)，稱(chēng)為一階導(dǎo)數(shù)光譜，以同樣方法可得到二階導(dǎo)數(shù)光譜(d2A/d2)-曲線(xiàn)，三階導(dǎo)數(shù)光譜(d3A/d3)-曲線(xiàn)，四階導(dǎo)數(shù)光譜(d4A/d4)-曲線(xiàn)。各階倒數(shù)光譜的基本曲線(xiàn)圖1.零階 2.一階 3.二階 4.三階 5.四階 （5）導(dǎo)數(shù)光譜法：導(dǎo)數(shù)光譜法又稱(chēng)微分光譜法，是一種消除光 原理：在導(dǎo)數(shù)光譜中，導(dǎo)數(shù)信號(hào)與濃度成正比，即：dA/dC，d2A/d2C，d3A/d3C，d4A/d4C。信號(hào)對(duì)濃度的靈敏度取決于吸收系數(shù)在特定波長(zhǎng)下的變化率，即：d/d，d2/d2， d3/d3， d4/d4，導(dǎo)數(shù)光譜的測(cè)量法有幾何法和代數(shù)法。在幾何法中，導(dǎo)數(shù)光譜的定量參數(shù)是振幅。 導(dǎo)數(shù)光譜的微分階數(shù)n越大，

18、峰形越尖銳、分辨率越強(qiáng)，但信噪比將降低，通常不超過(guò)四階。 操作步驟：干擾情況考查；選擇測(cè)定條件；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；樣品測(cè)定。 原理：在導(dǎo)數(shù)光譜中，導(dǎo)數(shù)信號(hào)與濃度成正比，即：dA/ （6）差示光譜法(A)法：先選定一個(gè)理想的參比溶液，使待測(cè)組分發(fā)生特征光譜變化，而共存組分不發(fā)生光譜變化，由此消除其干擾。一般是取兩份相等的供試液，在一份中加酸或堿，形成不同的酸堿介質(zhì)環(huán)境；或加入能與待測(cè)組分發(fā)生反應(yīng)的試劑，使待測(cè)組分以不同的形式存在，吸收光譜發(fā)生顯著變化，將兩份供試液稀釋至同樣濃度，分別置于樣品池與參比池中，于選定波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度差值A(chǔ)，在一定濃度范圍內(nèi)，A與待測(cè)組分濃度C呈線(xiàn)性關(guān)系，可作為物質(zhì)定量分析

19、的依據(jù)。 （6）差示光譜法(A)法：先選定一個(gè)理想的參比溶液， 原理：導(dǎo)數(shù)光譜的微分階數(shù)n越大，峰形越尖銳、分辨率越強(qiáng)，但信噪比將降低，通常不超過(guò)四階。導(dǎo)數(shù)光譜的波長(zhǎng)間隔越大，靈敏度越高，但分辨率降低。一般選12nm為宜。導(dǎo)數(shù)光譜的中間波長(zhǎng)m的選擇原則是：干擾組分在此波長(zhǎng)處的導(dǎo)數(shù)值最好為零，而且通過(guò)選擇適宜的波長(zhǎng)和求導(dǎo)條件，可消除背景吸收、雜質(zhì)和共存物的干擾。 操作步驟：干擾情況考查；選擇測(cè)定條件；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；供試品測(cè)定； 原理：導(dǎo)數(shù)光譜的微分階數(shù)n越大，峰形越尖銳、分辨率越 四、案例（一）六味地黃顆粒中牡丹皮的含量測(cè)定供試品溶液的制備參比溶液的制備紫外分光光度計(jì)含量計(jì)算 取本品約2g，精密

20、稱(chēng)定，用水蒸氣蒸餾，收集餾出液約450ml，置500ml量瓶中，加水稀釋至刻度。照紫外分光光度法，在274nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按丹皮酚(C9H10O3)的吸收系數(shù)為862計(jì)算，即得。本品每袋含牡丹皮按丹皮酚(C9H10O3)計(jì)，不得少于6.0mg。 四、案例供試品溶液的制備參比溶液的制備紫外分光光度（二）獨(dú)一味膠囊中總黃酮的含量測(cè)定 本品每粒含總黃酮以無(wú)水蘆丁(C27H30O16)計(jì)，不得少于26mg。獨(dú)一味膠囊中總黃酮的含量測(cè)定采用的是何種方法 ？供試品溶液是如何制備的？對(duì)照品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的 制備吸光度的測(cè)定含量計(jì)算供試品溶液的制備課堂互動(dòng)（二）獨(dú)一味膠囊中總黃酮的含量測(cè)定 本品每粒

21、含總黃酮以無(wú)水 （三）黃楊寧片中黃楊寧的含量測(cè)定 藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每片含黃楊寧以環(huán)維黃楊星D（C26H46N2O）計(jì)算，應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%110.0%。供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備吸光度的測(cè)定含量計(jì)算黃楊寧片中黃楊寧的含量測(cè)定采用的是何種方法 ？供試品溶液是如何制備的？課堂互動(dòng) （三）黃楊寧片中黃楊寧的含量測(cè)定供試品溶對(duì)照品溶吸光 1.定義 薄層掃描法是供試品經(jīng)薄層分離后,用一束波長(zhǎng)、強(qiáng)度一定的紫外線(xiàn)或可見(jiàn)光對(duì)薄層板進(jìn)行掃描，通過(guò)測(cè)定薄層板上的斑點(diǎn)對(duì)光的吸收強(qiáng)度或斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行定量的方法。 2.特點(diǎn) 設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離快速、靈敏度及分辨率

22、高、顯色劑選擇范圍廣、適用于多組分及微量組分定量等。第二節(jié) 薄層掃描法 1.定義 薄層掃描法是供試品經(jīng)薄層分離后,用一 一、儀器工作原理 （一）薄層色譜掃描法的基本原理 薄層色譜掃描法的測(cè)定原理是用長(zhǎng)寬可以調(diào)整的一束波長(zhǎng)、強(qiáng)度固定的光，對(duì)薄層板上的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，通過(guò)測(cè)量斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束的強(qiáng)度變化，求出待測(cè)組分含量。薄層掃描法可分為吸收薄層掃描法和薄層熒光掃描法。第二節(jié) 薄層掃描法 一、儀器工作原理 薄層色譜掃描法的測(cè)定原 1. 吸收薄層掃描測(cè)定法 是用可見(jiàn)-紫外光的單色光對(duì)薄層板上色譜斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描獲得的吸光度隨展開(kāi)距離變化的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行定量的方法。根據(jù)測(cè)光的方式不同，吸收

23、掃描測(cè)定法又分為透射法和反射法兩種。 第二節(jié) 薄層掃描法 透射法是測(cè)定光透過(guò)供試品斑點(diǎn)后的吸收情況進(jìn)行的定量方法透射法掃描 L-光源 MC-單色器 P-薄層板 S-斑點(diǎn) PD-檢測(cè)器 1. 吸收薄層掃描測(cè)定法 是用可見(jiàn)- 反射法是測(cè)定供試品斑點(diǎn)對(duì)光的反射情況進(jìn)行的定量方法。 L-光源 MC-單色器 P-薄層板 S-斑點(diǎn) PD-檢測(cè)器反射法掃描 第二節(jié) 薄層掃描法 反射法是測(cè)定供試品斑點(diǎn)對(duì)光的反射情況進(jìn)行的定量方法。 第二節(jié) 薄層掃描法吸光度與物質(zhì)的濃度及液層厚度間不呈線(xiàn)性關(guān)系的解決方法選擇曲線(xiàn)中的直線(xiàn)部分進(jìn)行定量分析 采用Kubelka-Munk方程 利用非線(xiàn)性方程定量 第二節(jié) 薄層掃描法吸光

24、度與物質(zhì)的濃度及液層厚度間不呈線(xiàn)性關(guān)系 2. 薄層熒光掃描法 是通過(guò)儀器對(duì)供試品吸收可見(jiàn)-紫外光后發(fā)射的熒光強(qiáng)度掃描得到的吸收光譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)，求出供試品含量的方法 第二節(jié) 薄層掃描法熒光反射法掃描L-光源 MC-單色器 P-薄層板 S-斑點(diǎn) PD-檢測(cè)器 2. 薄層熒光掃描法 是通過(guò)儀器對(duì)供試第二節(jié) 薄層掃描法 當(dāng)樣品量很少時(shí)，斑點(diǎn)中組分的濃度與熒光強(qiáng)度呈線(xiàn)性關(guān)系，可按公式計(jì)算：F=2.3K/IoECL 或 F=KC 式F=2.3K/IoECL中：F為熒光強(qiáng)度；Io為入射光強(qiáng)度；C為濃度；E為吸收系數(shù)；K為常數(shù)（與熒光效率有關(guān)）；L為薄層厚度。 式F=KC 中： C為濃度； K為2.3K/Io

25、EL之積。 在薄層熒光掃描法中， 常用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的積分值（色譜峰面積）代替公式中的F，斑點(diǎn)中組份的含量代替公式中的C進(jìn)行計(jì)算。第二節(jié) 薄層掃描法 當(dāng)樣品量很少時(shí)，斑點(diǎn)中組分的濃度與熒（二）薄層掃描儀的構(gòu)造 薄層掃描儀主要由主機(jī)（光源、單色器、供試品室、薄層板臺(tái)架、檢測(cè)器）及工作站組成。 1.光源 光源室能提供穩(wěn)定的、具有一定強(qiáng)度的所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光源。包括紫外光源氘燈（200nm370nm）；可見(jiàn)光源鎢燈（370nm700nm）；熒光光源氙燈或汞燈（200nm700nm），其中汞燈為線(xiàn)光源，可提供特征輻射光譜。第二節(jié) 薄層掃描法（二）薄層掃描儀的構(gòu)造 薄層掃描儀主要由主機(jī)（光 2.單色光

26、器 單色光器可以將光源發(fā)出的連續(xù)光分解為單色光。其主要由入射狹縫、出射狹縫、色散元件、平行光裝置（準(zhǔn)直鏡）等部分構(gòu)成。薄層掃描儀多采用光柵為色散元件。 3.薄層板臺(tái) 包括薄層板臺(tái)架及驅(qū)動(dòng)裝置。 4.檢測(cè)器 檢測(cè)器是用來(lái)檢測(cè)和放大由供試品斑點(diǎn)透射、反射或發(fā)出熒光強(qiáng)度的裝置。 5.工作站 具有設(shè)定儀器參數(shù)、控制儀器工作條件和信號(hào)采集、處理計(jì)算和打印輸出等功能的裝置。第二節(jié) 薄層掃描法 2.單色光器 單色光器可以將光源發(fā)出的連（三）儀器性能的檢定 1.波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的檢查 一是利用汞燈的特征光譜線(xiàn)對(duì)儀器的波長(zhǎng)進(jìn)行準(zhǔn)確度檢查。二用氘燈以反射方式對(duì)硅膠G的薄層板上的10mg/ml的膦酸氯喹水溶液斑點(diǎn)做光譜掃

27、描，如在25710nm和34310nm有最大吸收峰，則準(zhǔn)確度符合要求。 2.重復(fù)性測(cè)定 系指同一薄層板上、同一供試品溶液相同濃度的數(shù)個(gè)斑點(diǎn)，掃描結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以峰面積的積分值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。鋸齒掃描的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)1.5%，線(xiàn)性?huà)呙璧南鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)2.0%.第二節(jié) 薄層掃描法（三）儀器性能的檢定 1.波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的檢查 （四）薄層掃描儀的工作流程 1.吸收薄層掃描法的薄層掃描儀工作原理 以CS-9301PC型雙波長(zhǎng)掃描儀為例。第二節(jié) 薄層掃描法薄層掃描儀的光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖 （四）薄層掃描儀的工作流程 1.吸收薄 2.薄層熒光掃描法的薄層掃描儀工作流程 以島津CS-9000型雙飛點(diǎn)掃描儀

28、為例。第二節(jié) 薄層掃描法 CS-9000型儀器的光學(xué)系統(tǒng) 2.薄層熒光掃描法的薄層掃描儀工作流程 三、含量測(cè)定（一）概述 1.原理 薄層掃描法含量測(cè)定有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種方法，中國(guó)藥典僅采用外標(biāo)法。 2.類(lèi)型 根據(jù)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)性質(zhì)的不同，外標(biāo)法又分為外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)兩點(diǎn)法。第二節(jié) 薄層掃描法 三、含量測(cè)定 1.原理 薄層掃描法供試品選擇檢測(cè)方法 含量計(jì)算薄層掃描發(fā)含量測(cè)定操作步驟溶液的制備薄層板點(diǎn)樣展開(kāi)掃描掃描波長(zhǎng)對(duì)照品系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 測(cè)定方式 掃描方 式 第二節(jié) 薄層掃描法供試品選擇檢含量計(jì)算薄層掃描發(fā)含量測(cè)定操作步驟溶液的制備薄層（二）操作步驟和方法 外表一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法的點(diǎn)樣操作。

29、（1）外標(biāo)一點(diǎn)法 （2）外標(biāo)兩點(diǎn)法外標(biāo)兩點(diǎn)法點(diǎn)樣方法 第二節(jié) 薄層掃描法（二）操作步驟和方法 外表一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法的點(diǎn)樣操作 4.系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) （1）靈敏度的檢測(cè)： （2）分離度： （3）重復(fù)性 5.上機(jī)掃描 （1）檢測(cè)方法選擇 （2）測(cè)定方式選擇:反射法和透射法 第二節(jié) 薄層掃描法 4.系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 第二節(jié) 薄層掃描法 （3）掃描波長(zhǎng)選擇：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)掃描法；雙波長(zhǎng)掃描法;薄層熒光掃描波長(zhǎng)的選擇第二節(jié) 薄層掃描法單波長(zhǎng)、單光束掃描儀光路圖單波長(zhǎng)、雙光束掃描儀光路圖 （3）掃描波長(zhǎng)選擇：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)掃描法；雙波長(zhǎng)掃描 （4）掃描方式的選擇：直式掃描（線(xiàn)性?huà)呙?；鋸齒掃描（飛點(diǎn)掃描）；圓形掃描；傾斜掃

30、描。 掃描時(shí)，應(yīng)自下而上掃描，不可橫向掃描。掃描光束（點(diǎn)）的形狀和大小，可通過(guò)調(diào)整狹縫的高度和寬度實(shí)現(xiàn)。第二節(jié) 薄層掃描法線(xiàn)性?huà)呙鑸D （4）掃描方式的選擇：直式掃描（線(xiàn)性?huà)呙?；鋸齒掃第二節(jié) 薄層掃描法鋸齒掃描 第二節(jié) 薄層掃描法鋸齒掃描 6.含量計(jì)算 （1）外標(biāo)一點(diǎn)法：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn)。 計(jì)算公式： C = F1A （2）外標(biāo)兩點(diǎn)法(隨行標(biāo)準(zhǔn)法)：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不通過(guò)原點(diǎn)。 計(jì)算公式：C = F1A + F2 由 C1 = F1A1 + F2 C2 = F1A2 + F2 得第二節(jié) 薄層掃描法 7. 結(jié)果判斷 將測(cè)定結(jié)果與2010年版中國(guó)藥典中的各品種項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，符合標(biāo)準(zhǔn)即為合格。 8.注意

31、事項(xiàng) 6.含量計(jì)算 第二節(jié) 薄層掃描法 四、案例（一）靈寶護(hù)心丹的含量測(cè)定供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備薄層掃描含量計(jì)算本品每1g含牛黃以膽酸（C24H40O5）計(jì)，不得少于2.5mg。靈寶護(hù)心丹的膽酸含量測(cè)定采用的是何種方法 ？供試品溶液是如何制備的？課堂互動(dòng)第二節(jié) 薄層掃描法 四、案例供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備薄層掃描含 1. 定義 高效液相色譜法是采用高壓輸液泵將流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離并測(cè)定含量的方法。 2. 特點(diǎn) 分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、適用范圍廣（供試品不需氣化，只需制成溶液即可）、流動(dòng)相選擇性大、流出組分易收集、色譜柱可反復(fù)使用等特點(diǎn) 。

32、3. 范圍 揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大、離子型化合物 。第三節(jié) 高效液相色譜法 1. 定義 高效液相色譜法是采用高壓輸 一、儀器工作原理（一）儀器的構(gòu)造第三節(jié) 高效液相色譜法高壓輸液系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)高效液相色譜儀的構(gòu)造 一、儀器工作原理第三節(jié) 高效液相色譜法高壓輸液系統(tǒng)數(shù)第三節(jié) 高效液相色譜法高效液相色譜儀1.貯液罐 2.脫氣裝置 3.梯度洗脫 4.高壓輸液泵 5.流動(dòng)相流量顯示6.柱前壓力表 7.輸液泵頭 8.過(guò)濾器 9.阻尼器 10.進(jìn)樣裝置11.色譜柱 12.檢測(cè)器 13.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 14.廢液貯罐第三節(jié) 高效液相色譜法高效液相色譜儀第三節(jié) 高效液相色譜

33、法 1. 高壓輸液系統(tǒng) 由貯液罐、脫氣裝置、高壓輸液泵、過(guò)濾器、梯度洗脫裝置等組成。 （1）貯液罐：由玻璃、不銹鋼或氟塑料等化學(xué)惰性、耐腐蝕材料制成，有無(wú)色及棕色兩種貯液罐。 （2）脫氣裝置：貯液瓶配有抽真空及吹入惰性氣體的脫氣裝置。 超聲波振動(dòng)脫氣；抽真空脫氣；加熱回流脫氣；吹氦脫氣；真空在線(xiàn)脫氣。第三節(jié) 高效液相色譜法 1. 高壓輸液系統(tǒng) 由貯液第三節(jié) 高效液相色譜法 （3）高壓輸液泵：完成流動(dòng)相的輸送任務(wù)。柱塞往復(fù)泵示意圖 兩種連接方式的柱塞往復(fù)泵 第三節(jié) 高效液相色譜法 （3）高壓輸液泵：完成流動(dòng)相的第三節(jié) 高效液相色譜法 （4）過(guò)濾器：在流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱之前，用于除去流動(dòng)相中固體顆粒

34、雜質(zhì)的直徑為0.45W濾膜裝置。 （5）梯度洗脫系統(tǒng)：可分為高壓與低壓兩種梯度洗脫裝置。 三元高壓梯度洗脫系統(tǒng)示意圖 1，2，3-閥門(mén)驅(qū)動(dòng)器；4，5，6-比例閥；7，8，9-溶劑貯罐；10-溶劑比例控制器；11-梯度洗脫程序；12-高壓泵；13-溶劑混合器第三節(jié) 高效液相色譜法 （4）過(guò)濾器：在流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱第三節(jié) 高效液相色譜法 2. 進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣器有高壓進(jìn)樣閥、六通手動(dòng)進(jìn)樣閥及自動(dòng)進(jìn)樣器等裝置。 （1）高壓進(jìn)樣閥 （2）六通閥進(jìn)樣器六通進(jìn)樣閥 1，4-定量管； 2-泵； 3-進(jìn)入色譜柱 5，6-排液口（a）取樣 （b）進(jìn)樣第三節(jié) 高效液相色譜法 2. 進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣器有高壓第三節(jié) 高效

35、液相色譜法（3）自動(dòng)進(jìn)樣裝置 自動(dòng)進(jìn)樣器 1-沖洗液管；2-沖洗泵；3-電磁閥；4-單向閥；5-注射器；6-三通閥；7-六通閥；8-沖洗液；9-空氣間隙；10-樣品；11-采樣針頭；12-空氣；13-供試品瓶；14-沖洗瓶第三節(jié) 高效液相色譜法（3）自動(dòng)進(jìn)樣裝置 自動(dòng)進(jìn)樣器 1-沖 3.色譜分離系統(tǒng) 色譜分離系統(tǒng)由保護(hù)柱、色譜柱、恒溫裝置和連接閥等組成。 （1）保護(hù)柱：具有防止供試品和進(jìn)樣閥墊圈中的固體顆粒的進(jìn)入分析柱作用。 （2）色譜柱：色譜柱是高效液相色譜儀的重要部件，由柱管、接頭和過(guò)濾片組成。 第三節(jié) 高效液相色譜法 3.色譜分離系統(tǒng) 色譜分離系統(tǒng)由保護(hù)柱、色第三節(jié) 高效液相色譜法帶保護(hù)

36、柱的PEEK色譜柱 1-柱接頭；2-PEEK保護(hù)柱；3-0.5m鈦金屬濾過(guò)片；4-電解鋁外殼；5-PEEK色譜分析柱；6-0.5m鈦金屬濾過(guò)片；7-柱接頭第三節(jié) 高效液相色譜法帶保護(hù)柱的PEEK色譜柱 1-柱接頭； 柱管、接頭、過(guò)濾片第三節(jié) 高效液相色譜法柱接頭的液流分配功能 內(nèi)接式柱結(jié)構(gòu)1-毛細(xì)連接管；2-壓緊螺絲；3，7-密封圈；4-濾過(guò)片；5-柱頭螺帽；6-鎖緊螺帽；8-柱管 柱管、接頭、過(guò)濾片第三節(jié) 高效液相色譜法柱接頭 （4）恒溫裝置：恒溫裝置(恒溫箱)精確控制色譜柱溫度的裝置，具有調(diào)節(jié)溫度的功能。 （5）色譜柱柱效的評(píng)價(jià)： 硅膠柱、反相色譜法的色譜柱（ODS柱等）、正相色譜法的色譜

37、柱（氰基或氨基柱） 測(cè)各組分的W1/2及tR，計(jì)算理論塔板數(shù)n及相鄰組分的分離度R（1.5）第三節(jié) 高效液相色譜法 （4）恒溫裝置：恒溫裝置(恒溫箱)精確控制色譜柱 4.檢測(cè)系統(tǒng) 高效液相色譜檢測(cè)器通常分為兩類(lèi)：通用性檢測(cè)器和選擇性檢測(cè)器。 （1）通用性檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器。 （2）選擇性檢測(cè)器：可見(jiàn)-紫外檢測(cè)器、二極管陳列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器及質(zhì)譜檢測(cè)器。第三節(jié) 高效液相色譜法 4.檢測(cè)系統(tǒng) 高效液相色譜檢測(cè)器通常分為兩紫外檢測(cè)器（Utraviolet detector，UV）：紫外檢測(cè)器是高效液相色譜法中使用最廣范的選擇性檢測(cè)器。分為固定波長(zhǎng)、可變波長(zhǎng)和二極

38、管陣列檢測(cè)器三種類(lèi)型。 固定波長(zhǎng)檢測(cè)器；可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；二極管陣列檢測(cè)器（Diode array detector）。第三節(jié) 高效液相色譜法熒光檢測(cè)器（Fluorophotometrie detector,FD電化學(xué)檢測(cè)器（Electrochemical detector,ECD）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative light scattering detector, ELSD）示差折光檢測(cè)器（Differential refractive index,RID）：紫外檢測(cè)器（Utraviolet detector，UV） 5.數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng) 是將色譜系統(tǒng)的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行記錄和處理成分析

39、結(jié)果的裝置。 6.儀器性能 衡量?jī)x器性能的指標(biāo)包括儀器的重復(fù)性、噪音、基線(xiàn)漂移、敏感度、線(xiàn)性、波長(zhǎng)精度等。第三節(jié) 高效液相色譜法 5.數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng) 是將色譜系統(tǒng)的 典型的高效液相色譜儀流程如圖所示 第三節(jié) 高效液相色譜法 （二）儀器工作原理1.貯液罐 2.脫氣裝置 3.梯度洗脫 4.高壓輸液泵 5.流動(dòng)相流量顯示 6.柱前壓力表 7.輸液泵頭 8.過(guò)濾器 9.阻尼器 10.進(jìn)樣裝置 11.色譜柱 12.檢測(cè)器 13.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 14.廢液貯罐 典型的高效液相色譜儀流程如圖所示 第三節(jié) 高效1.用流動(dòng)相沖洗濾器，再把濾器浸入流動(dòng)相中，啟動(dòng)泵。2.打開(kāi)泵的排放閥，用專(zhuān)用注射器從閥口抽出流動(dòng)

40、相約20ml，設(shè)置高流速（如9ml/min）或用沖洗鍵（PURGE）進(jìn)行泵排氣，出口處流動(dòng)相連續(xù)液流后，將流速逐步回零或停止沖洗，關(guān)閉排放閥。第三節(jié) 高效液相色譜法 二、儀器操作通法（一）泵的操作3.將流速調(diào)節(jié)至分析用流速，對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，同時(shí)觀察壓力指示應(yīng)穩(wěn)定，用干燥濾紙片的邊緣檢查柱管各連接處應(yīng)無(wú)滲漏。初始平衡時(shí)間一般需約30分鐘。如為梯度洗脫，應(yīng)在程序器上設(shè)置梯度狀態(tài)，用初始比例的流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。1.用流動(dòng)相沖洗濾器，再把濾器浸入流動(dòng)相中，啟動(dòng)泵。第三節(jié) 1.開(kāi)啟檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)，選擇光源（鎢燈或氘燈），選定檢測(cè)波長(zhǎng)，待穩(wěn)定后，測(cè)試參比和供試品光路的信號(hào)應(yīng)符合要求，設(shè)置吸收度方式

41、和檢測(cè)響應(yīng)時(shí)間（一般不大于1秒），設(shè)置滿(mǎn)刻度吸收值（適用于記錄儀）。2.開(kāi)啟色譜處理機(jī)，設(shè)定處理方法，初步設(shè)定衰減、紙速、記錄時(shí)間、最小峰面積等參數(shù)，或設(shè)定記錄儀的紙速或衰減。第三節(jié) 高效液相色譜法（二）紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)的操作3.進(jìn)行檢測(cè)器回零操作，檢查處理機(jī)的電平（LEVEL），應(yīng)符合要求，或檢查記錄儀的筆應(yīng)處在設(shè)定的起始位置，如有變動(dòng)，可繼續(xù)回零操作直至符合要求。4.記錄基線(xiàn)，待穩(wěn)定后，進(jìn)行處理機(jī)斜率測(cè)試，符合要求后方能進(jìn)行操作。1.開(kāi)啟檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)，選擇光源（鎢燈或氘燈），選定檢測(cè)波長(zhǎng) 1.六通閥式進(jìn)樣器 （1）進(jìn)樣手柄置采樣位置（LOAD）。 （2）用供試品溶液清洗配

42、套的注射器，再抽取適量，如用定量環(huán)（LOOP）載樣，則注射器抽取量應(yīng)不少于定量環(huán)容積的5倍，用微量注射器定容進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量不得多于環(huán)容積的50%。在排除氣泡后方能向進(jìn)樣器中注入供試品溶液。 （3）把注射器的平頭針直插至進(jìn)樣器底部，注入供試品溶液，除另有規(guī)定外，注射器不應(yīng)取下。 （4）將手柄轉(zhuǎn)至進(jìn)樣位置（INJECT），供試品被流動(dòng)相帶入色譜柱。第三節(jié) 高效液相色譜法 （三）進(jìn)樣操作 1.六通閥式進(jìn)樣器 第三節(jié) 高效液相色譜法 2. 自動(dòng)進(jìn)樣器：自動(dòng)進(jìn)樣裝置有圓盤(pán)式自動(dòng)進(jìn)樣器、鏈?zhǔn)阶詣?dòng)進(jìn)樣器、坐標(biāo)式自動(dòng)進(jìn)樣器等。 （1）將供試品溶液用0.45m濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液至進(jìn)樣瓶中，蓋上帶有墊片的瓶蓋，順

43、時(shí)針?lè)较蛐o。為避免堵塞進(jìn)樣器及損傷進(jìn)樣器，一般應(yīng)選擇與自動(dòng)進(jìn)樣器型號(hào)相配套的進(jìn)樣瓶。 （2）將進(jìn)樣瓶依次放入貯樣室內(nèi)，記錄瓶位置號(hào)（VIAL）。如果自動(dòng)進(jìn)樣器有控溫裝置，設(shè)置溫度參數(shù)。 （3）對(duì)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行校正，使自動(dòng)進(jìn)樣器為默認(rèn)位置、進(jìn)樣針沖洗系統(tǒng)正常、管內(nèi)無(wú)氣泡、有足夠的沖洗液和流動(dòng)相。 （4）設(shè)定自動(dòng)進(jìn)樣參數(shù)。即設(shè)定供試品溶液自動(dòng)進(jìn)樣的起始位置、進(jìn)樣體積、稀釋倍數(shù)、數(shù)據(jù)文件名等，用START進(jìn)樣。第三節(jié) 高效液相色譜法 2. 自動(dòng)進(jìn)樣器：自動(dòng)進(jìn)樣裝置有圓盤(pán)式自動(dòng)進(jìn)樣1. 注樣同時(shí)啟動(dòng)數(shù)據(jù)處理機(jī)，采集和處理色譜信息，如系記錄儀，則注樣同時(shí)按下記號(hào)鍵作起始記號(hào)。2. 最后一峰出完后應(yīng)繼續(xù)

44、走一段基線(xiàn)，確認(rèn)無(wú)組分流出后結(jié)束記錄。3. 根據(jù)第一張預(yù)試的色譜圖，調(diào)整衰減、紙速、記錄時(shí)間等參數(shù)，使色譜峰信號(hào)在色譜圖上有一定強(qiáng)度。定量時(shí)，一般峰頂不超過(guò)記錄滿(mǎn)量程。再按3.（1）4.（1）正式分析操作。 4.含量測(cè)定的對(duì)照品溶液和供試品溶液每份至少進(jìn)樣2次，由全部進(jìn)樣結(jié)果（n4）求得平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不應(yīng)大于1.5%。5.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)應(yīng)符合藥典規(guī)定。第三節(jié) 高效液相色譜法（四）色譜數(shù)據(jù)的收集和處理1. 注樣同時(shí)啟動(dòng)數(shù)據(jù)處理機(jī)，采集和處理色譜信息，如系記錄儀1.分析完畢，先關(guān)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用經(jīng)濾過(guò)和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱用正己烷，反相柱如使用過(guò)含鹽流動(dòng)相，則

45、先用水，然后用甲醇-水沖洗，沖洗前先按上述操作通法項(xiàng)下1（1）、1（2）操作，再用分析流速?zèng)_洗，各種沖洗劑一般沖洗15分鐘30分鐘，特殊情況可延長(zhǎng)沖洗時(shí)間，尤其是用過(guò)含鹽流動(dòng)相的柱子，有時(shí)需沖洗數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間。 2.沖洗完畢后逐步降低流速至0，關(guān)泵。進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可用進(jìn)樣閥所附專(zhuān)用沖洗接頭。 3.關(guān)閉電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、柱壓、使用時(shí)間（小時(shí)）及儀器使用前后的狀態(tài)等。第三節(jié) 高效液相色譜法（五）清洗和關(guān)機(jī)1.分析完畢，先關(guān)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用經(jīng)濾過(guò)和脫氣的適當(dāng) 外標(biāo)法可分為工作曲線(xiàn)法、外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)兩點(diǎn)法。 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法 2.外標(biāo)一點(diǎn)法 第三節(jié)

46、 高效液相色譜法 三、含量測(cè)定（一）原理(外標(biāo)法) 外標(biāo)法可分為工作曲線(xiàn)法、外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)兩點(diǎn)法。第三 3.峰面積歸一化法 按藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)項(xiàng)下進(jìn)行峰面積歸一化法求組分的含量，按下式計(jì)算 式中：Ai為待測(cè)組份峰面積；A未參與計(jì)算的全部峰面積（溶劑峰和其他干擾峰除外）之和。第三節(jié) 高效液相色譜法 3.峰面積歸一化法 按藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)項(xiàng)下進(jìn) 4.雜質(zhì)檢查法 （1）加校正因子的主成分自身對(duì)照法：測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，如在檢測(cè)波長(zhǎng)下，雜質(zhì)色譜峰位置與主成分色譜峰位置不同時(shí)，可將主成分作為內(nèi)標(biāo)物加到雜質(zhì)的對(duì)照品溶液中，求出雜質(zhì)相對(duì)于主成分的校正因子，然后根據(jù)供試品中主成分色譜峰和雜質(zhì)色譜峰的面積，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算

47、雜質(zhì)的含量。 （2）不加校正因子的主成分自身對(duì)照法：在雜質(zhì)未知或未建立雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)，可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)的含量或限量。第三節(jié) 高效液相色譜法 4.雜質(zhì)檢查法 第三節(jié) 高效液相色譜法 1.溶液的制備 2.系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) （1）色譜柱的理論塔板數(shù)（n）： （2）分離度（R）： 分離度應(yīng)大于1.5。 （3）重復(fù)性：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%。 （4）拖尾因子（T）： T應(yīng)在0.951.05之間。第三節(jié) 高效液相色譜法（二）操作步驟和方法 1.溶液的制備 第三節(jié) 高效液相色譜法（二）操作步 （5）色譜圖及其參數(shù) 保留時(shí)間tR；峰高h(yuǎn)；峰寬W；峰面積A。第三節(jié) 高效液相色譜法色譜

48、圖及其參數(shù) 3.進(jìn)樣測(cè)試 4.含量計(jì)算 （1）外標(biāo)法： 5.結(jié)果判斷 （5）色譜圖及其參數(shù)第三節(jié) 高效液相色譜法色譜圖及其 四、案例（一）固本咳喘片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備高校液相色譜儀含量計(jì)算第三節(jié) 高效液相色譜法【處方】黨參151g 白術(shù)(麩炒)151g 茯苓100g 麥冬151g 補(bǔ)骨脂（鹽炒） 151g 炙甘草75g 五味子75g 本品每片含補(bǔ)骨脂以補(bǔ)骨脂素（C11H6O3）和異補(bǔ)骨脂素（C11H6O3）的總量計(jì)，不得少于0.30mg。 為什么選擇補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為指標(biāo)性成分？ 四、案例供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備高校液含量計(jì)算（二）胃舒

49、寧顆粒中甘草酸含量的測(cè)定 【處方】甘草595g 海螵蛸595g 白芍464g 白術(shù)310g 延胡索310g 黨參119g第三節(jié) 高效液相色譜法為什么選擇甘草酸為指標(biāo)性成分？供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備高校液相色譜儀含量計(jì)算本品每袋含甘草以甘草酸（C42H62O16）計(jì)不得少于20mg。（二）胃舒寧顆粒中甘草酸含量的測(cè)定 【處方】甘草595g 1.定義 以氣體為流動(dòng)相（稱(chēng)載氣）流經(jīng)色譜柱，進(jìn)行分離定量的色譜分析法稱(chēng)氣相色譜法（GC）。 2.特點(diǎn) 分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn) 3.適用范圍 具有揮發(fā)性，在常溫下可氣化或加熱后可氣化的物質(zhì)的含量測(cè)定。第四節(jié) 氣相色譜法 1.定

50、義 以氣體為流動(dòng)相（稱(chēng)載氣）流經(jīng)色 一、儀器工作原理（一）儀器的組成第四節(jié) 氣相色譜法氣控系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)柱分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)信號(hào)處理系統(tǒng)溫控系統(tǒng) 一、儀器工作原理第四節(jié) 氣相色譜法氣進(jìn)柱檢信溫第四節(jié) 氣相色譜法氣相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖 1.載氣鋼瓶（N2） 2.氫氣鋼瓶 3.空氣鋼瓶 4.減壓閥 5.干燥器 6.穩(wěn)壓器 7.壓力表8.針形閥 9.轉(zhuǎn)子流量計(jì) 10.進(jìn)樣器及汽化室 11.色譜柱（虛線(xiàn)表示恒溫室） 12.氫火焰離子化檢測(cè)器（虛線(xiàn)表示恒溫室） 13.微電流放大器 14.記錄器第四節(jié) 氣相色譜法氣相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖 1.載氣鋼瓶（N2）第四節(jié) 氣相色譜法 1.氣流控制系統(tǒng) 包括氣源、氣體凈化裝

51、置、氣體流速控制和測(cè)量裝置。氣體流量調(diào)節(jié)閥高壓閥減壓閥壓力表凈化器檢測(cè)器轉(zhuǎn)子流量計(jì)色譜柱放空氣化室第四節(jié) 氣相色譜法 1.氣流控制系統(tǒng) 包括氣源、第四節(jié) 氣相色譜法 （1）氣源及凈化：氣源（載氣）：是氣相色譜儀載氣和輔助氣的來(lái)源，可以是高壓氣鋼瓶、氫氣發(fā)生器以及空氣壓縮機(jī)。 （2）減壓閥：是指聯(lián)接在高壓鋼瓶和氣體流路之間中減壓裝置，將由高壓鋼瓶供給的氣體壓力降至0.20.5mPa。 （3）穩(wěn)壓閥：又稱(chēng)壓力調(diào)節(jié)器，可以為針形閥提供穩(wěn)定的氣壓；為它后邊的穩(wěn)流閥提供恒定的參考?jí)毫?。第四?jié) 氣相色譜法 （1）氣源及凈化：氣源（載氣）：是氣第四節(jié) 氣相色譜法減壓閥結(jié)構(gòu)示意圖1-調(diào)節(jié)手柄；2-彈簧；3-隔

52、膜；4-提升針閥；5-出口腔；6-入口腔；7-氣體入口；8-高壓壓力表；9-氣體出口；10-低壓壓力表穩(wěn)壓閥示意圖 1-閥座；2-針形閥（或平面閥）；3-波紋閥；4-彈簧；5-手柄；6-閥桿第四節(jié) 氣相色譜法減壓閥結(jié)構(gòu)示意圖1-調(diào)節(jié)手柄；2-彈簧；3第四節(jié) 氣相色譜法（4）壓力表：壓力顯示器，指示和監(jiān)測(cè)載氣流量的儀器。（5）凈化裝置：聯(lián)接在氣源與儀器之間的凈化載氣中的雜質(zhì)和水分所用載氣的裝置。（6）氣體流量調(diào)節(jié)閥（穩(wěn)流閥）：調(diào)節(jié)載氣流量、穩(wěn)定氣體壓力的裝置。（7）轉(zhuǎn)子流量計(jì)：測(cè)定顯示載氣流速的儀器。穩(wěn)流閥示意圖 1-彈性膜片；2-上游反饋管；3-手柄；4-針閥第四節(jié) 氣相色譜法（4）壓力表：壓

53、力顯示器，指示和監(jiān)測(cè)載氣流第四節(jié) 氣相色譜法 2. 進(jìn)樣系統(tǒng) 供試品引入裝置（進(jìn)樣器）和氣化室（進(jìn)樣系統(tǒng)）溫度控制裝置組成。（1）進(jìn)樣器：將供試品加到氣相色譜儀中的裝置，主要有手動(dòng)微量注射器、自動(dòng)進(jìn)樣器及頂空進(jìn)樣器。 氣體進(jìn)樣器：六通閥或微量進(jìn)樣閥、注射器； 液體進(jìn)樣器：微量注射器或有分流裝置的氣化室。第四節(jié) 氣相色譜法 2. 進(jìn)樣系統(tǒng) 供試品引入裝置（第四節(jié) 氣相色譜法 （2）進(jìn)樣系統(tǒng)和進(jìn)樣模式：填充柱進(jìn)樣系統(tǒng)；分流進(jìn)樣系統(tǒng)；不分流進(jìn)樣系統(tǒng)；冷柱頭進(jìn)樣；程序升溫氣化進(jìn)樣；大體積進(jìn)樣；頂空進(jìn)樣技術(shù)；熱解進(jìn)樣。靜態(tài)頂空進(jìn)樣示意圖1-溫度計(jì)；2-注射器；3-恒溫浴；4-容器；5-樣品；6-隔膜；7

54、-螺母不分流進(jìn)樣示意圖1-載氣入口；2-清掃器入口；3-墊圈；4-分流閥；5-分流器出口；6-緩沖器；7-毛細(xì)管柱第四節(jié) 氣相色譜法 （2）進(jìn)樣系統(tǒng)和進(jìn)樣模式：填充第四節(jié) 氣相色譜法分流進(jìn)樣示意圖1-隔膜；2，4-針形閥；3-分流點(diǎn)； 5-毛細(xì)管；6-紅寶石；7-色譜柱1-錐形口；2-0.3mm通道；3-鋼杯；4-載氣入口；5-石墨墊；6-毛細(xì)管柱；7-冷卻空氣出口；8-冷卻空氣入口；9-停止閥冷柱頭進(jìn)樣器示意圖第四節(jié) 氣相色譜法分流進(jìn)樣示意圖1-隔膜；2，4-針形閥；3第四節(jié) 氣相色譜法 程序升溫進(jìn)樣器示意圖 1-注射器；2-裝有彈簧的O型密封圈；3-不銹鋼針管；4-轉(zhuǎn)動(dòng)閥；5-閥柄；6-散

55、熱片；7-載氣入口；8-玻璃插入管；9-外徑0.18mm內(nèi)徑0.1mm的彈性石英毛細(xì)管；10-冷卻劑；11-溫度敏感元件；12-針閥；13-進(jìn)樣器清洗器出口；14-柱箱；15-彈性石英毛細(xì)管；16-加熱器第四節(jié) 氣相色譜法 程序升溫進(jìn)樣器示意圖 1-注射器；2-裝第四節(jié) 氣相色譜法 （3）氣化室：氣化室是將液體或固體供試品進(jìn)行加熱氣化的裝置。 （4）溫度控制系統(tǒng)：設(shè)置、控制、測(cè)量氣化室溫度的裝置。第四節(jié) 氣相色譜法 （3）氣化室：氣化室是將液體或固體供試第四節(jié) 氣相色譜法 3. 分離系統(tǒng) 包括色譜柱、柱室和柱溫箱。（1）色譜柱：色譜柱按柱內(nèi)徑的大小和長(zhǎng)度，可分為填充柱和毛細(xì)管柱；柱形有螺旋形、

56、形。 填充柱；色譜柱填料；固定液；毛細(xì)管柱。 （2）柱室：是指色譜柱內(nèi)沒(méi)有被固定相填充的空間。 （3）柱溫箱：設(shè)置、控制、測(cè)量色譜柱溫度的裝置。第四節(jié) 氣相色譜法 3. 分離系統(tǒng) 包括色譜柱、柱室第四節(jié) 氣相色譜法 4. 檢測(cè)系統(tǒng) 由檢測(cè)器微電流放大器等部件組成。是指示和測(cè)量載氣中被測(cè)組分及其量變化的一種裝置。（1）檢測(cè)器：是將流出色譜柱的載氣中被測(cè)組分的濃度（或質(zhì)量）轉(zhuǎn)化為電信號(hào)變化的裝置。 積分型檢測(cè)器；微分型檢測(cè)器；濃度型檢測(cè)器；質(zhì)量型檢測(cè)器。 （2）溫控系統(tǒng)：設(shè)置、控制、測(cè)量檢測(cè)器溫度的裝置。 5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 由放大器、記錄儀、積分儀、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。 數(shù)據(jù)處理機(jī)或色譜工作站接收處

57、理經(jīng)放大的供試品濃度或質(zhì)量的信號(hào)（色譜圖信息），打印出操作條件，由積分儀給出定性和定量分析結(jié)果。第四節(jié) 氣相色譜法 4. 檢測(cè)系統(tǒng) 由檢測(cè)器微電 （二）儀器的工作流程第四節(jié) 氣相色譜法 由高壓瓶提供載氣，經(jīng)壓力調(diào)節(jié)器調(diào)壓后，進(jìn)入凈化干燥裝置除去載氣中的雜質(zhì)及水分，再由穩(wěn)壓閥調(diào)制適宜的流量和流速后進(jìn)入色譜柱。供試品（液體）用微量注射器或進(jìn)樣閥由進(jìn)樣器注入，進(jìn)樣后的供試品瞬間氣化為氣體，被載氣帶入色譜柱。各組分在色譜柱內(nèi)經(jīng)分離后依次流出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器將各組分的濃度或質(zhì)量信號(hào)轉(zhuǎn)變成電壓變化，經(jīng)放大器放大后記錄在記錄儀上，得到色譜圖，供試品經(jīng)檢測(cè)器后放空。 （二）儀器的工作流程第四節(jié) 氣相色

58、譜法 由高壓 二、儀器操作通法（一）開(kāi)機(jī)前的準(zhǔn)備第四節(jié) 氣相色譜法 1. 檢查儀器上電器開(kāi)關(guān)，均處于“關(guān)”位置。 2. 選擇好合適的色譜柱，柱的兩端應(yīng)有盲堵。 3. 取下盲堵，分清入口與出口端，套好石墨密封圈及固定螺母，小心裝于儀器上，擰緊固定螺絲，但也勿過(guò)緊，以不漏氣為度。換下的色譜柱，應(yīng)堵上盲堵保存。 4.開(kāi)啟載氣鋼瓶上總閥調(diào)節(jié)減壓閥至規(guī)定壓力。 5.用表面活性劑檢查柱連接處是否漏氣，如有漏氣應(yīng)檢查柱兩端的石墨密封圈或再略加緊固定螺母。 6.如果儀器有恒流和恒壓閥調(diào)節(jié)氣流量，換柱后可不再調(diào)節(jié)，若有疑點(diǎn)可用皂膜流量計(jì)檢查和調(diào)節(jié)流量。 二、儀器操作通法第四節(jié) 氣相色譜法 1. 檢查儀 （二）開(kāi)

59、機(jī)第四節(jié) 氣相色譜法 1.打開(kāi)各部分電路開(kāi)關(guān)及色譜站，設(shè)置進(jìn)樣系統(tǒng)、氣化室、柱溫箱及檢測(cè)器溫度和載氣流量等色譜參數(shù)，并開(kāi)始加熱。 2.待各部分溫度恒定后，打開(kāi)氫氣鋼瓶及空氣壓縮機(jī)總閥，同載氣操作。 3.按下點(diǎn)火按鈕（FID檢測(cè)器）（有些儀器在檢測(cè)器溫度達(dá)到一定溫度后有自動(dòng)點(diǎn)火功能），應(yīng)有“卟”的點(diǎn)火聲，用玻璃片置氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）氣體出口處，檢視玻璃片上如有水霧，表示已點(diǎn)著火，同時(shí)記錄器有響應(yīng)。注意：對(duì)于有自動(dòng)點(diǎn)火功能的儀器來(lái)說(shuō)，有時(shí)工作站已顯示點(diǎn)火成功，但實(shí)際上沒(méi)有點(diǎn)火，所以每次試驗(yàn)均應(yīng)用玻璃片檢視 4.調(diào)節(jié)儀器的放大器靈敏度等，走基線(xiàn)，待基線(xiàn)穩(wěn)定度達(dá)到可接受范圍內(nèi)，即可進(jìn)樣分析。

60、 （二）開(kāi)機(jī)第四節(jié) 氣相色譜法 1.打開(kāi)各部分電路開(kāi) （三）測(cè)定第四節(jié) 氣相色譜法 1.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 應(yīng)符合藥品標(biāo)準(zhǔn)各品種項(xiàng)下的要求。 2.預(yù)試驗(yàn) 初次測(cè)定藥品時(shí)，可先經(jīng)預(yù)試驗(yàn)以確定儀器參數(shù)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)情況，可適當(dāng)調(diào)節(jié)柱溫、載氣流速、進(jìn)樣量等，使色譜峰的保留時(shí)間、分離度、峰面積或峰高的測(cè)量符合要求。如果用積分儀作峰面積積分時(shí)，對(duì)含量測(cè)定的色譜峰面積不得小于10000Vs，否則應(yīng)調(diào)節(jié)進(jìn)樣量，也可調(diào)節(jié)FID的靈敏度，但應(yīng)注意信噪比是否達(dá)到。 （三）測(cè)定第四節(jié) 氣相色譜法 1.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 第四節(jié) 氣相色譜法 3. 正式進(jìn)樣測(cè)定 每份校正因子測(cè)定溶液（或?qū)φ掌啡芤海┘肮┰嚻啡芤焊鬟M(jìn)樣2次，2份共