植物細胞工程版

1、 5/5植物細胞工程版 植物細胞工程 （名詞解釋2*5=10 填空10 簡答20 論述10） 名詞解釋 1.細胞工程(cell engineering)：應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的實驗方法或技術(shù)，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細胞、細胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。 2.細胞全能性（cell totipotency）：一個生活細胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的潛在能力。 動植物細胞都有全能性。 3.脫分化（dedifferentiation)：培養(yǎng)條件下使一個已分化的細胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細胞狀態(tài)的過程。 4.細胞分化（differ

2、entiation）：導(dǎo)致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。 5.再分化（redifferentiation）：離體條件下，細胞脫分化后，無序生長的細胞及其愈傷組織重新進入有序生長再生為個體的過程。 6.體細胞胚somatic embryo（胚狀體embryoid）：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物。 7.體細胞無性系變異（Somaclonal variation）：經(jīng)過組織培養(yǎng)循環(huán)出現(xiàn)的再生植株變異。 8.嵌合體(mosaic)：同一有機體中同時存在有遺傳組成不同的細胞。 9.快繁（rapid propagation）或微繁（micro

3、propagation）技術(shù)：利用組培進行快速營養(yǎng)繁殖的技術(shù)。 10.游離小孢子培養(yǎng)（isolated microspore culture），又花粉培養(yǎng)（pollen culture）：把小孢子從花藥中分離出來，進行人工培養(yǎng)。 11.胚胎拯救（embryo rescue)：種間或?qū)匍g雜交時，兩個基因組表達不協(xié)調(diào)，多數(shù)情況下胚乳最先敗育，胚仍然健康，可通過離體胚培養(yǎng)將雜種幼胚培養(yǎng)成植株，稱為胚胎拯救。 12.細胞懸浮培養(yǎng)（cell suspension culture）：將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 13.次生代謝產(chǎn)物（secondary metabolito）：

4、由初生代謝產(chǎn)物經(jīng)過一些獨特的代謝途徑派生出來的小分子化合物，在保持植物抗逆性、抗病性和抗蟲性及擔當信號分子方面起重要作用。 14.原生質(zhì)體（protoplast）：植物細胞中，除細胞壁以外的成分。 15.FDA（Fluorescein diacetate，熒光素雙醋酸鹽） 活體染色：FDA 能透過原生質(zhì)體膜，在內(nèi)酯酶作用下水解為不能排出的，累積在質(zhì)膜內(nèi)的熒光素。在熒光顯微鏡下觀察時，凡發(fā)淡綠熒光的都是活的原生質(zhì)體。 16.滋養(yǎng)培養(yǎng)/看護培養(yǎng)（nurse culture):利用能分泌生物活性物質(zhì)的細胞或組織培養(yǎng)物作為滋養(yǎng)者，促進原生質(zhì)體的分裂和生長。 17.植物體細胞雜交（somatic hyb

5、ridization）：完全不經(jīng)過有性過程，只通過體細胞融合制造雜種的方法。又稱為原生質(zhì)體融合（protoplast fusion），是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。 18.異核體（hetrokaryon）：不同來源原生質(zhì)體融合形成的雜種原生質(zhì)體。 19.胞質(zhì)雜種（cybrid）：利用不對稱細胞融合技術(shù)，有可能使一個親本的原生質(zhì)體和另一個親本的細胞質(zhì)結(jié)合在一起，這種具有一個親本的細胞核和兩個親本的細胞質(zhì)的體細胞雜種叫做胞質(zhì)雜種。 填空 1.植物細胞工程發(fā)展： 1839，Schwann、Schleiden細胞學(xué)說 1902，

6、Haberlandt植物細胞離體培養(yǎng)實驗 WhiteB族維生素的應(yīng)用 Skoog 和Tsui（崔澂）腺嘌呤的發(fā)現(xiàn) Miller激動素的發(fā)現(xiàn) 1958，Steward單個胡蘿卜細胞形成體細胞胚 中國羅士韋最早研究莖尖培養(yǎng) Morel and Martin將莖尖培養(yǎng)應(yīng)用于脫毒，形成最早的植物細胞工程產(chǎn)業(yè) 2. 合子及早期胚胎細胞均為胚性細胞。 3. 激素是離體培養(yǎng)的必須條件，與植物激素相關(guān)的基因表達是啟動細胞脫分化的關(guān)鍵。 4. 先生長素后分裂素，利于細胞分裂；反之，利于分化。 5. 植物細胞離體培養(yǎng)再生兩條途徑:器官發(fā)生、體細胞胚胎發(fā)生 6. IAA與KT比例高時利于根的形成，低時利于芽的形成；

7、 植物多肽PSK可極大加強基本激素的作用效果。 7. 外源2,4-D效果好：細胞內(nèi)高濃度的游離形式，對內(nèi)源激素沒有反饋抑制。 8. 分化水平高的組織產(chǎn)生的無性系比分生組織產(chǎn)生的更易變異。 9.清洗器皿的酸液（洗液）：濃硫酸加重鉻酸鉀 10.母液配制：配制時加一個溶解一個，最后加鈣。 11. 螯合鐵使得培養(yǎng)基pH升高至68時，鐵離子仍保持二價，可被很好地吸收利用。 12.過濾消毒：0.45或0.22m微孔濾膜進行過濾。 13.滅菌sterilization方法：高壓滅菌、干熱滅菌、過濾滅菌、藥劑滅菌（0.1%升汞）、火焰滅菌、熏蒸滅菌、紫外滅菌 14. 生長素：組培中生長素添加為了促進離體細胞分

8、裂形成愈傷組織，或誘導(dǎo)試管苗生根。 15.細胞分裂素：赤霉素、乙烯、脫落酸 脫落酸: 組培中主要用于胚胎或胚狀體發(fā)育的后期，抑制胚胎的過早萌發(fā)，促進胚胎成熟，使胚胎長成形態(tài)正常的植株。 16. 20世紀40年代，中國羅士韋世界上最早研究莖尖培養(yǎng) 1952，Morel和Martin 通過莖尖培養(yǎng)獲得無病毒大麗花 17.我國花藥研究： a.朱至清：低銨離子濃度和過濾消毒的單糖顯著促進禾谷類花粉胚的發(fā)育 b.歐陽俊聞：確立單核中期的小麥花粉最適于產(chǎn)生花粉植株 c.衛(wèi)志明：碳饑餓可大幅度提高花粉胚的產(chǎn)率。 d.孫敬三：發(fā)現(xiàn)花粉中質(zhì)體DNA降解引起的質(zhì)體RNA和蛋白質(zhì)的匱乏是白化苗形成的原因。 18.花

9、粉的發(fā)育時期：單核中晚期至雙核早期的花粉最易形成花粉胚或花粉愈傷。 19.1934，清華的李繼侗和沈同發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳提取物可刺激離體胚生長。 20.ABA可抑制幼胚吸水，使其脫水干燥，發(fā)育成熟。 21.懸浮細胞的同步化：分選法、饑餓法、抑制劑法、低溫處理法。 22.80年代末，日本實現(xiàn)紫草和人參的大規(guī)模細胞培養(yǎng)，以獲得紫草素和人參皂苷。 23.分離原生質(zhì)體的方法：機械法、酶法。 24.雙子葉植物的幼葉、子葉、根和下胚軸的切段通常被用來制備原生質(zhì)體。 禾谷類植物，疏松易碎的愈傷或懸浮培養(yǎng)的細胞是制備原生質(zhì)體的理想材料。 25.原生質(zhì)體融合的種類:對稱融合、非對稱融合。 簡答與論述 1.細胞脫分化過

10、程中的生理活動與細胞結(jié)構(gòu)變化： （1）細胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失 （2）核體積增加并逐漸移位至細胞中央 （3）細胞器增加 2.細胞脫分化的3個階段： （1）啟動階段：細胞質(zhì)增生，開始向細胞中央伸出細胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)。 （2）演變階段：細胞核向中央移動，質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體。 （3）脫分化終結(jié)期：回復(fù)到分生細胞狀態(tài)，細胞分裂即將開始。 3. 體細胞無性系變異的特點： （1）體細胞無性系變異是組培中較普遍現(xiàn)象 （2）體細胞無性系變異可遺傳 （3）體細胞無性系變異頻率顯著高于自然突變 （4）體細胞無性系變異與外植體來源及培養(yǎng)時間有關(guān) 4.獲得較高頻率的體細胞無性系變異： 以分化程度高的組織或細胞為

11、外植體，在一定植物激素濃度下誘導(dǎo)愈傷，并經(jīng)較長時間的繼代培養(yǎng)，然后誘導(dǎo)分化再生植株，有可能得到較高頻率的體細胞無性系變異。 5. 染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異： （1）染色體斷裂、缺失、易位、基因重復(fù)和突變 植物組織和細胞進入離體培養(yǎng)環(huán)境后，細胞分裂的不規(guī)則性顯著增加，導(dǎo)致染色體和分子水平的變異。最常見是染色體數(shù)目變化。 （2）染色體結(jié)構(gòu)變異 結(jié)構(gòu)變異根本原因在于染色體斷裂，斷裂會造成染色體缺失及重接后重復(fù)、倒位、易位。 在農(nóng)作物和近緣屬的遠緣雜種中異源染色體之間的易位系利用價值最大，因為可以引入有用的外源基因。 6.離體培養(yǎng)細胞染色體易于斷裂原因： 細胞離體培養(yǎng)時分裂周期縮短，分裂速度加快，異染色質(zhì)

12、復(fù)制落后于真染色質(zhì)，形成染色體橋，造成染色體斷裂。 7.離體培養(yǎng)細胞異常有絲分裂類型： 培養(yǎng)細胞染色體數(shù)目變化由異常有絲分裂產(chǎn)生，異常有絲分裂有以下類型： （1）有絲分裂失敗或進行無絲分裂（2）核內(nèi)有絲分裂（3）核內(nèi)再復(fù)制（4）有絲分裂時形成多極紡錘體 8.轉(zhuǎn)座子活化可解釋無性系變異的一些特點： （1）轉(zhuǎn)座子活化可造成基因表達的廣泛變化，因此無性系變異頻率才如此之高； （2）轉(zhuǎn)座子具有使不活動的結(jié)構(gòu)基因活化特點，因此會有顯性基因；（3）轉(zhuǎn)座子可使多拷貝基因中那些不表達的拷貝活化，提高基因表達的強度，即基因放大。 9. 生長素和細胞分裂素的協(xié)同作用: 較高濃度的生長素單獨或與細胞分裂素結(jié)合使用可

13、有效刺激培養(yǎng)細胞的增殖和連續(xù)生長，形成愈傷組織。 培養(yǎng)基中KT濃度高于IAA濃度時，培養(yǎng)物形成芽，不形成根；兩者濃度大致相等時，只誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，基本沒有器官發(fā)生；當IAA濃度高于KT時，培養(yǎng)物分化出根，不形成芽。 10.外植體褐變 （1）褐變原因:植物中含有多酚，創(chuàng)傷會激活多酚氧化酶，將多酚氧化為棕褐色的醌類，使得外植體切口發(fā)生褐變，并滲透入培養(yǎng)基，嚴重影響培養(yǎng)物的生長和分化，甚至致其死亡。 （2）影響褐變因素：木本植物外植體易褐化，尤其成年樹；培養(yǎng)基中過高濃度的無機鹽和肌醇會加劇褐變；6-BA和KT有誘導(dǎo)褐化作用；強光和高溫會促進褐化。 （3）外植體褐變防治：a.選取酚類含量低的實驗材料

14、b.選擇無機鹽含量低，不加肌醇的培養(yǎng)基c.在弱光線或黑暗條件下培養(yǎng)d.培養(yǎng)基中加入抗氧化劑e.在培養(yǎng)基中加入0.5%1%活性炭，吸附醌類，注意同時提高培養(yǎng)基中激素濃度f.不斷地更換新培養(yǎng)基 11. 莖尖脫毒原理： 病毒通過植物的維管束和細胞壁上的胞間連絲擴散到所有的組織和器官，但植物莖尖分生組織由分生細胞構(gòu)成，分生區(qū)域內(nèi)無維管束，細胞壁的胞間連絲也不發(fā)達，病毒很難進入，所以生長點往往不含病毒或含極少量病毒，因此采用莖尖可進行脫毒快繁。 12. 與植物花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)的優(yōu)點： （1）排除了花藥壁和絨氈層的影響，便于分析研究結(jié)果（2）需要的器皿和培養(yǎng)空間較小，大大提高了生產(chǎn)單倍體的效率（3

15、）小孢子本身也可能成為基因工程的受體 13.成功的懸浮細胞系條件： （1）懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較?。?（2）均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同； （3）細胞生長迅速。 14.植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)需滿足的條件： （1）培養(yǎng)的細胞遺傳上穩(wěn)定，得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物； （2）細胞生長及生物合成的速度快，短時間內(nèi)得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物； （3）代謝產(chǎn)物要在細胞內(nèi)積累而不被迅速分解，最好釋放到培養(yǎng)基中。 13.酶溶液的配制：為保持釋放出的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性，要求酶液滿足以下條件： （1）酶液滲透壓必須與處理細胞的滲透壓相似 同一種植物，子葉和下胚軸游離原生質(zhì)體時需要的滲透壓最高，愈傷次之，胚性

16、懸浮細胞要求最低?？捎迷|(zhì)體培養(yǎng)基做溶劑，其滲透壓合適。 （2）酶液添加CaCl2 2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸鉀以提高原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性。還可加入AgNO3減少酶解產(chǎn)生的乙烯，加入過氧化物歧化酶減輕O2自由基對細胞膜損傷，從而提高原生質(zhì)體植板率。 （3）MES（嗎啉乙基磺酸）作為pH緩沖調(diào)節(jié)劑對于保持酶解物的酸堿環(huán)境起緩沖作用，增加原生質(zhì)體的釋放量和穩(wěn)定性。 （4）酶溶液最適pH范圍為5.45.8。酶液配好后，過濾滅菌備用。14. 原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)基： 無機鹽：大幅度降低銨離子濃度，可以只用硝態(tài)氮，同時附加有機氮源。 碳源和滲透壓：葡萄糖最適合。 有機附加物和激素：VB1、VB6、

17、煙酸是必需的。很多時候，只需要生長素，尤其2,4-D 常用基本培養(yǎng)基：KM8p和NT。 15. 精細胞分離： （1）三細胞花粉：禾本科與十字花科植物，花粉中含有一個營養(yǎng)細胞和兩個游離在營養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中的精細胞，為三細胞花粉. （2）二細胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一個營養(yǎng)細胞和一個生殖細胞，為二細胞花粉?；ǚ勖劝l(fā)后，生殖細胞在花粉管中分裂形成兩個精子。 （3）三細胞花粉，可以直接從成熟花粉中分離精子；二細胞花粉，需要先進行花粉的離體培養(yǎng)，待精子形成后，再從花粉管中分離精子。16.原生質(zhì)體融合：首選電融合，其次PEG法 （1）NaNO3處理：異核體形成的頻率不高 （2）高pH-高濃度鈣離子處理