第05章酶與其他生物催化劑二課件

1、第三節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué)The Kinetics of Enzymatic Reactions 第三節(jié) 概念研究各種因素對酶促反應(yīng)速率的影響，并加以定量的闡述。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。概念 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)；酶促反應(yīng)速率（velocity，V）一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示；反應(yīng)速率取其初速率，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?以內(nèi)）時的反應(yīng)速率；底物濃度遠遠大于酶濃度。研究前提單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)；研究前提一、采用酶促反應(yīng)初速率來研究酶促反應(yīng)動

2、力學(xué)（一）酶活性是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力衡量酶活性的尺度是酶促反應(yīng)速率的大小。酶促反應(yīng)速率可用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。由于底物的消耗量不易測定，所以實際工作中經(jīng)常是測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。一、采用酶促反應(yīng)初速率來研究酶促反應(yīng)動力學(xué)（一）酶活性是指酶酶的活性:以國際單位（international unit, IU）表示。在規(guī)定的實驗條件下（如溫度、pH的限定和足夠的底物濃度等），每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為1個國際單位（IU）。 酶的活性: 催量（Katal） 1IU16.67109 Kat 1催量是指在特定條件下，每秒鐘將1mol底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的

3、酶量 比活性（specific activity）：比較酶的純度 比活性單位是每mg蛋白質(zhì)所含酶的國際單位數(shù)，其單位是IU mg 蛋白1催量（Katal） 1IU16.67109 Kat （二）酶促反應(yīng)初速率是反應(yīng)剛剛開始時測得的反應(yīng)速率酶促反應(yīng)初速率是指反應(yīng)剛剛開始，各種影響因素尚未發(fā)揮作用時的酶促反應(yīng)速率，即反應(yīng)時間進程曲線為直線部分時的反應(yīng)速率。（二）酶促反應(yīng)初速率是反應(yīng)剛剛開始時測得的反應(yīng)速率酶促反應(yīng)初（二）有三類方法對底物和產(chǎn)物的變化量進行檢測 1直接測定法是對底物或產(chǎn)物的含量變化進行直接檢測 有些酶促反應(yīng)可在反應(yīng)進行一定時間后，不用任何輔助反應(yīng)便可直接測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的濃度。

4、這類測定方法稱為直接測定法（direct assay）。 還原型（Fe2+）細胞色素c在波長550nm處有明顯的吸收峰，而氧化型（Fe3+）則無；細胞色素c氧化酶對細胞色素c的氧化反應(yīng)，可以直接在波長550nm處檢測一定時間內(nèi)還原型細胞色素c的減少過程 。（二）有三類方法對底物和產(chǎn)物的變化量進行檢測 1直接測有些酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物不能直接進行檢測，必須增加一些輔助試劑來達到檢測的目的，這種方法稱為間接測定法（indirect assay） 2間接測定法利用非酶輔助反應(yīng)對底物或產(chǎn)物的變化進行間接檢測 有些酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物不能直接進行檢測，必須增加一些輔助試3偶聯(lián)測定法不直接涉及原始反應(yīng)的底

5、物或產(chǎn)物 許多酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物雖然不能直接檢測，但可以與另外的酶反應(yīng)相偶聯(lián)，偶聯(lián)的酶以第一個酶的產(chǎn)物為底物，或以此類推，以最后的酶反應(yīng)產(chǎn)物可以直接檢測為目的。這種通過偶聯(lián)其他酶并對此酶促產(chǎn)物進行直接檢測，間接地反映待測酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物變化量的方法稱為酶偶聯(lián)測定法（enzyme coupled assay） 外加的酶稱為工具酶或輔助酶（auxiliary enzyme） 產(chǎn)物可直接檢測的酶稱為指示酶（indicator enzyme） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶丙氨酸 + -酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸乳酸脫氫酶丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸 + NAD+ （在340nm處有吸收峰） （在340n

6、m處無吸收峰）3偶聯(lián)測定法不直接涉及原始反應(yīng)的底物或產(chǎn)物 許多酶促反應(yīng)的二、酶促反應(yīng)速率受底物濃度的影響（一）酶促反應(yīng)的底物濃度曲線是矩形雙曲線在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)速率V對底物濃度S作圖呈矩形雙曲線。 二、酶促反應(yīng)速率受底物濃度的影響（一）酶促反應(yīng)的底物濃度曲線當?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速率與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。SVVmax目 錄當?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速率與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。隨著底物濃度的增高反應(yīng)速率不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。SVVmax目 錄隨著底物濃度的增高反應(yīng)速率不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度酶被底物所飽和，反應(yīng)速

7、率不再增加，達最大速率；反應(yīng)為零級反應(yīng)。SVVmax目 錄當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度酶被底物所飽和，反應(yīng)速率不再增加，達最（二）底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系可用米氏方程式表示 1米氏方程式可以很好地解釋底物濃度曲線 中間產(chǎn)物 酶促反應(yīng)模式中間產(chǎn)物學(xué)說E + S k1k2k3ESE + P（二）底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系可用米氏方程式表示 1米氏方1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米-曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelis equation)。S：底物濃度V：不同S時的反應(yīng)速率Vmax：最大反應(yīng)速率(maximum velocity) m：米氏常數(shù)

8、(Michaelis constant) VmaxS Km + S 1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速率與底米-曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)：E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速率取決于慢反應(yīng)。即 Vk3ES (1)S的總濃度遠遠大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認為不變即SSt。 米-曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)：2穩(wěn)態(tài)的概念介入米氏方程式的推導(dǎo)過程 穩(wěn)態(tài)：是指ES的生成速率與分解速率相等，即 ES恒定。 k1 (EtES) Sk2 ES + k3 ESk2+k3 Km （米氏常數(shù)） k1令：則(2)變?yōu)? (EtES

9、) S Km ES(2)(EtES)Sk2+k3ES k1整理得：2穩(wěn)態(tài)的概念介入米氏方程式的推導(dǎo)過程 穩(wěn)態(tài)：是指ES的生成將(3)代入(1) 得k3EtS Km + S (4) V當?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時，即EtES，反應(yīng)達最大速率Vmaxk3ESk3Et (5)ES EtSKm + S(3) 整理得:將(5)代入(4)得米氏方程式：VmaxS Km + S V 將(3)代入(1) 得k3EtS Km + S KmS Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，單位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 （三）動力學(xué)參數(shù)可用來

10、比較酶的動力學(xué)性質(zhì)與活性 1Km值相當于V為Vmax一半時的S KmS Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時的2Km是酶的特征性常數(shù) 在酶的結(jié)構(gòu)、溶液pH、溫度等條件不變的情況下，酶促反應(yīng)底物的Km不因反應(yīng)中酶濃度的改變而不同。 同一酶對其所催化的不同底物有不同的Km；不同酶對同一底物也有其各自的Km 。Km的范圍多在10-610-2mol/L之間。 Km只與酶和底物的種類以及反應(yīng)環(huán)境（ pH、溫度、離子強度）有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。2Km是酶的特征性常數(shù) 在酶的結(jié)構(gòu)、溶液pH、溫度 6.0 103己-N-乙酰2葡萄糖胺溶菌酶 2.5 102H2O2過氧化氫酶 4.0 103D-乳糖-半乳

11、糖苷酶 2.5 103N-苯甲酰酪氨酰胺 1.08 101甘氨酰酪氨酰甘氨酸胰凝乳蛋白酶 2.6 102HCO3碳酸酐酶 1.5 103D-果糖 5 105D-葡萄糖 4 104ATP己糖激酶（腦） Km（mol/L） 底物 酶 一些酶對底物的Km 6.0 103己-N-乙酰2葡萄糖胺溶菌酶 2.3Km在一定條件下可表示酶對底物的親和力 k1Km =k2 + k3當k3 k2時，Km k2/k1。即相當于ES分解為E + S 的解離常數(shù)（dissociation constant, Ks）。此時，Km代表酶對底物的親和力。 Km越大，表示酶對底物的親和力越?。籏m越小，表示酶對底物的親和力越大

12、。 3Km在一定條件下可表示酶對底物的親和力 k1Km =k4kcat代表酶的轉(zhuǎn)換數(shù) kcat = Vmax /Et kcat表示酶被底物完全飽和時，單位時間內(nèi)每個酶分子（或活性中心）催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的分子數(shù)。 kcat也稱為酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover number)，單位是s1 。多數(shù)酶的轉(zhuǎn)換數(shù)在1104 s1之間 4kcat代表酶的轉(zhuǎn)換數(shù) kcat = Vmax /Et酶底 物轉(zhuǎn)換數(shù) （s1）過氧化氫酶H2O240 000 000碳酸酐酶HCO3400 000乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿14 000-內(nèi)酰胺酶芐青霉素2 000延胡索酸酶延胡索酸800Rec A蛋白ATP0.4一些酶的轉(zhuǎn)換數(shù) 酶

13、底 物轉(zhuǎn)換數(shù) （s1）過氧化氫酶H2O240 005在低底物濃度時，kcat/Km代表酶的催化效率 EtSKmV =kcat當S E2 E3。從圖中可知， E的變化不影響酶促反應(yīng)的Km。B：反應(yīng)速率對酶濃度作圖，V與E呈直線關(guān)系。 A：底物濃度曲線，其中，E1 E2 E3四、酶促反應(yīng)速率受反應(yīng)系統(tǒng)溫度的影響 雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速率升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速率降低 。最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應(yīng)速率最快時的環(huán)境溫度。四、酶促反應(yīng)速率受反應(yīng)系統(tǒng)溫度的影響 雙重影響最適溫度 (o哺乳動物組織中酶的最適溫度多在3540之間

14、 Taq DNA聚合酶最適溫度為72 * 低溫的應(yīng)用一般的酶在低溫下活性降低，但酶本身不被破壞，其活性可隨溫度的回升而恢復(fù)。 低溫保存酶和菌種等生物制品 低溫麻醉 哺乳動物組織中酶的最適溫度多在3540之間 Taq DN五、酶的活性依賴于反應(yīng)系統(tǒng)的pH 最適pH (optimum pH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。體內(nèi)酶的最適pH多在6.58之間。 胃蛋白酶的最適pH為1.8 精氨酸酶的最適pH為9.8 pH對幾種酶活性的影響 五、酶的活性依賴于反應(yīng)系統(tǒng)的pH 最適pH (optimum六、激活劑可加速酶促反應(yīng)速率 酶的激活劑（activator） 使酶從無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)

15、 必需激活劑（essential activator）為酶促反應(yīng)所必需，如缺乏則測不到酶的活性。 Mg2+為己糖激酶的必需激活劑 非必需激活劑（non-essential activator）可以提高酶的催化活性，但不是必需的。 Cl-對唾液淀粉酶的激活作用 六、激活劑可加速酶促反應(yīng)速率 酶的激活劑（activator七、酶活性可被許多抑制劑可逆地或不可逆地抑制 （一）可逆性抑制劑與酶非共價結(jié)合 酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 區(qū)別于酶的變性 抑制劑對酶有一定選擇性 引起變性的因素對酶沒有選擇性七、酶活性可被許多抑制劑可逆地或不可

16、逆地抑制 （一）可逆性抑可逆性抑制（reversible inhibition） 酶與抑制劑非共價結(jié)合，可以通過透析、超濾或稀釋等物理方法將抑制劑除去，恢復(fù)酶的催化活性。 不可逆性抑制（irreversible inhibition） 與酶共價結(jié)合，不能通過透析、超濾或稀釋等方法將其除去。 可逆性抑制（reversible inhibition） 酶可逆性抑制劑 抑制劑與酶的調(diào)節(jié)部位結(jié)合，使酶發(fā)生變構(gòu)，從而對酶發(fā)揮抑制作用（別構(gòu)抑制作用）。 抑制劑通過與游離酶或/和酶-底物復(fù)合物可逆地結(jié)合而影響酶的催化活性。 k1k2k3+kiEII+S+ESESE+PESI+Iki可逆性抑制作用的抑制劑可以

17、與游離酶結(jié)合，形成二元復(fù)合物EI；也可以與ES結(jié)合，形成三元復(fù)合物ESI。 可逆性抑制劑 抑制劑與酶的調(diào)節(jié)部位結(jié)合，使酶發(fā)生變構(gòu)，從而對1競爭性抑制劑與底物競爭酶的活性中心 定義：抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似或部分相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶-底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。 +EESIESEIE P1競爭性抑制劑與底物競爭酶的活性中心 定義：+EESI有競爭性抑制劑存在的米氏方程式 V =VmaxSKm+ S(1 +Iki)雙倒數(shù)方程式是 VmaxKmSV1=1Vmax1+(1 +Ik i)反應(yīng)模式+E + S ESE + PIEIkik1k2k3S

18、I有競爭性抑制劑存在的米氏方程式 V =VmaxSKm+競爭性抑制作用V對S的雙倒數(shù)作圖 * 特點抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及底物濃度；I與S結(jié)構(gòu)類似，或部分相似，競爭酶的活性中心；動力學(xué)特點：Vmax不變，表觀Km增大。 I1V1S0Km1Km1(1+ )IkiVmax1-競爭性抑制作用V對S的雙倒數(shù)作圖 * 特點抑制程度取決* 舉例 丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸* 舉例 丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫磺胺類藥物的抑菌機制與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶二氫蝶呤 對氨基苯甲酸 谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸磺胺類藥物的抑菌機

19、制二氫蝶呤 對氨基苯甲酸 谷氨酸二2非競爭性抑制劑不影響酶對底物的親和力 + S S+ S S+ESIEIEESEPk1k2k3+kiEII+ESESE+P+Iki+SESI* 反應(yīng)模式2非競爭性抑制劑不影響酶對底物的親和力 + S S+ S非競爭性抑制的米氏方程式的雙倒數(shù)形式 VmaxKmSV1=1Vmax1+(1 +Iki)(1 +Iki)* 特點抑制劑與酶活性中心外的必需基團結(jié)合，底物與抑制劑之間無競爭關(guān)系；抑制程度取決于抑制劑的濃度；動力學(xué)特點：Vmax降低，表觀Km不變。 I1V1SKm1(1+ )IkiVmax1Vmax0非競爭性抑制作用V對S的雙倒數(shù)作圖 非競爭性抑制的米氏方程式

20、的雙倒數(shù)形式 VmaxKmSV13反競爭性抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合 +ESESESIEPk1k2k3+ESESE+P+IkiESI* 反應(yīng)模式3反競爭性抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合 +ESESESI反競爭性抑制作用的米氏方程式的雙倒數(shù)形式 VmaxKmSV1=1Vmax1+(1 +Iki)I1V1SKm1(1+ )IkiVmax1Vmax0(1+ )IkiKm反競爭性抑制作用V對S的雙倒數(shù)作圖 * 特點：抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合；抑制程度取決于抑制劑的濃度及底物的濃度；動力學(xué)特點：Vmax降低，表觀Km降低。 反競爭性抑制作用的米氏方程式的雙倒數(shù)形式 VmaxKmS各種可逆性抑制作用的

21、比較 動力學(xué)參數(shù)表觀Km Km增大不變減小最大速度Vmax不變降低降低林-貝氏作圖斜率Km/Vmax增大增大不變縱軸截距1/Vmax不變增大增大橫軸截距-1/Km增大不變減小與I結(jié)合的組分EE、ESES作用特征無抑制劑競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制各種可逆性抑制作用的比較 動力學(xué)參數(shù)表觀Km （二）不可逆性抑制劑與酶共價結(jié)合不可逆性抑制作用的抑制劑 基團特異性抑制劑（group-specific inhibitor）底物類似物（substrate analog）自殺性抑制劑（suicide inhibitor） （二）不可逆性抑制劑與酶共價結(jié)合不可逆性抑制作用的抑制劑 基1基團特異性抑制劑

22、與酶分子中特異的基團共價結(jié)合 一些酶活性中心的催化基團是絲氨酸殘基上的羥基，這些酶稱為羥基酶。 如膽堿酯酶和絲氨酸蛋白酶 有機磷化合物羥基酶失活的酶酸CH3CHN+HONROPROOOE+NROPROOOCHCH3N+EOH 解磷定 失活的酶 有機磷-解磷定復(fù)合物 活化的酶 1基團特異性抑制劑與酶分子中特異的基團共價結(jié)合 一些酶活性半胱氨酸殘基上的巰基是許多酶的必需基團。低濃度的重金屬離子(Hg2+、Ag2+、Pb2+等)及As3+等可與巰基酶分子中的巰基結(jié)合，使酶失活。 路易士氣巰基酶失活的酶酸失活的酶BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物半胱氨酸殘基上的巰基是許多酶的必需基團。低濃度的重金屬離子(

23、2底物類似物可共價地修飾酶的活性中心 與基團特異性抑制劑不同，底物類似物與底物的結(jié)構(gòu)相似，可特異地與酶的活性中心共價結(jié)合，不可逆地抑制酶的活性。此類抑制劑可作為親和標記物，用來定性酶活性中心的功能基團。 TPCK對胰凝乳蛋白酶活性中心組氨酸咪唑環(huán)的親和標記 2底物類似物可共價地修飾酶的活性中心 與基團特異性抑制劑不 酶的自殺性抑制劑可以作為酶的底物與酶活性中心相結(jié)合，生成酶-底物復(fù)合物，并接受酶的催化作用。然而，經(jīng)催化后的中間產(chǎn)物不游離出產(chǎn)物，而是轉(zhuǎn)化為酶的抑制劑，進一步與酶活性中心共價結(jié)合，對酶產(chǎn)生抑制作用。 E + S ES EI E-I 3自殺性抑制劑是經(jīng)過修飾的酶的底物 酶的自殺性抑制

24、劑可以作為酶的底物與酶活性E + + 酶-底物復(fù)合物 無活性酶中 被修飾的FADN，N-二甲基丙炔酰胺自殺性抑制劑N,N-二甲基丙炔酰胺在被單胺氧化酶氧化后，由于填加1個質(zhì)子，使之與酶的輔基FAD結(jié)合生成穩(wěn)定的烷化物，從而酶被抑制。 單胺氧化酶通過其輔基FAD氧化N,N-二甲基丙炔酰胺(N,N-dimethylpropargyl amine)： + 酶-底物復(fù)合物 第四節(jié) 多底物反應(yīng)的動力學(xué)Kinetics of Multisubstrate Reactions第四節(jié)一、多底物反應(yīng)有其特定的表示法雙底物和多底物反應(yīng)的表示法與前述的單底物反應(yīng)不同，用A、B、C表示底物，用P、Q、R表示產(chǎn)物。雙底

25、物和多底物反應(yīng)用單(uni)、雙(bi)、三(ter)等表示底物和產(chǎn)物的數(shù)量。 反 應(yīng) 名 稱A B單單反應(yīng)（uni uni reaction）A + B P雙單反應(yīng)（bi uni reaction）A + B P + Q 雙雙反應(yīng)（bi bi reaction）A + B + C P + Q三雙反應(yīng)（ter bi reaction）A + B + C P + Q + R 三三反應(yīng)（ter ter reaction） 酶促反應(yīng)的一般名稱舉例 一、多底物反應(yīng)有其特定的表示法雙底物和多底物反應(yīng)的表示法與前二、雙雙反應(yīng)可按底物與酶結(jié)合和產(chǎn)物釋放的順序進行分類 （一）有序序列雙雙反應(yīng)中底物結(jié)合和產(chǎn)物釋

26、放有嚴格的先后次序 有些酶促雙雙反應(yīng)中，兩底物與酶的結(jié)合和兩產(chǎn)物從酶-底物復(fù)合物中的釋放有其嚴格次序，這類雙雙反應(yīng)稱為有序序列雙雙反應(yīng)(compulsory ordered bi bi reaction)，或稱有序序列機制(compulsory ordered mechanism)。 二、雙雙反應(yīng)可按底物與酶結(jié)合和產(chǎn)物釋放的順序進行分類 （一）乳酸脫氫酶催化的反應(yīng) 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸 + NAD+ 乳酸脫氫酶催化的反應(yīng) 丙酮酸 + NADH + H+ （二）隨機序列雙雙反應(yīng)的底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放沒有嚴格的先后次序 有些酶促雙雙反應(yīng)中，兩底物與酶結(jié)合和兩產(chǎn)物釋放的次序是隨機的，這

27、類雙雙反應(yīng)稱為隨機序列雙雙反應(yīng)(random ordered bi bi reaction)，或稱隨機序列機制(random ordered mechanism)。 （二）隨機序列雙雙反應(yīng)的底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放沒有嚴格的先后次序（三）乒-乓雙雙反應(yīng)的兩底物尚未全部與酶結(jié)合便有產(chǎn)物釋放 有些酶促雙雙反應(yīng)中，兩底物與酶的結(jié)合和兩產(chǎn)物從酶-底物復(fù)合物的釋放是交替進行的，這類雙雙反應(yīng)稱為乒-乓雙雙反應(yīng)(Ping-Pong bi bi reaction)，或雙置換機制(double displacement mechanism)。 （三）乒-乓雙雙反應(yīng)的兩底物尚未全部與酶結(jié)合便有產(chǎn)物釋放 有第五節(jié) 酶活性

28、的調(diào)節(jié)Regulation of Enzyme Activities 第五節(jié) 一、調(diào)節(jié)酶的催化活性隨著對環(huán)境信號的 反應(yīng)而變化 調(diào)節(jié)酶（regulatory enzyme） 對環(huán)境因素的作用表現(xiàn)出催化活性增高或降低、或酶量的增多或減少，進而能影響和調(diào)整反應(yīng)途徑反應(yīng)速率的酶。 機體通過改變調(diào)節(jié)酶的活性或誘導(dǎo)、阻遏酶的生物合成，可實現(xiàn)細胞代謝水平的調(diào)節(jié)；物質(zhì)代謝的整體調(diào)節(jié)和激素水平的調(diào)節(jié)最終也都是通過影響酶促反應(yīng)速率實現(xiàn)的。 一、調(diào)節(jié)酶的催化活性隨著對環(huán)境信號的調(diào)節(jié)酶（regulato酶的調(diào)節(jié)抑制 抑制劑激活 激活劑雙重調(diào)節(jié) 別構(gòu)調(diào)節(jié) 共價修飾多形性調(diào)節(jié) 酶原的激活 同工酶酶含量調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)合成：誘

29、導(dǎo)、阻遏調(diào)節(jié)降解酶活性調(diào)節(jié)： 酶的調(diào)節(jié)抑制 抑制劑酶含量調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)合成二、別構(gòu)酶通過構(gòu)象的改變影響酶促反應(yīng)速率 （一）別構(gòu)效應(yīng)劑與別構(gòu)酶結(jié)合引發(fā)酶的構(gòu)象改變別構(gòu)調(diào)節(jié) (allosteric regulation)一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。二、別構(gòu)酶通過構(gòu)象的改變影響酶促反應(yīng)速率 （一）別構(gòu)效應(yīng)劑與別構(gòu)酶（allosteric enzyme）：能發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶別構(gòu)效應(yīng)劑（allosteric effector） ：能引起酶發(fā)生構(gòu)象改變的化合物調(diào)節(jié)部位（regulatory site） ：別構(gòu)效應(yīng)劑與酶結(jié)合的

30、部位 別構(gòu)酶也有兩種構(gòu)象形式，緊縮態(tài)(tense state, T state)和松馳態(tài)(relaxed state, R state)。T態(tài)和R態(tài)對底物的親和力或催化活性不同，別構(gòu)效應(yīng)劑就是通過引起酶R態(tài)與T態(tài)的互變，改變酶的催化速率。 別構(gòu)酶（allosteric enzyme）：能發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)（二）別構(gòu)效應(yīng)劑可引起別構(gòu)酶分子中各亞基間的協(xié)同作用 亞基的構(gòu)象改變可以相互影響，發(fā)生協(xié)同效應(yīng)。（cooperativity） 正協(xié)同效應(yīng)（positive cooperativity） 后續(xù)亞基的構(gòu)象改變增加其對別構(gòu)效應(yīng)劑的親和力，使效應(yīng)劑與酶的結(jié)合越來越容易。 負協(xié)同效應(yīng)（negative co

31、operativity） 后續(xù)亞基的構(gòu)象改變降低酶對別構(gòu)效應(yīng)劑的親和力，使效應(yīng)劑與酶的結(jié)合越來越難。（二）別構(gòu)效應(yīng)劑可引起別構(gòu)酶分子中各亞基間的協(xié)同作用 亞基的同種協(xié)同效應(yīng)（homotropic cooperativity） 別構(gòu)效應(yīng)劑引起的構(gòu)象改變增加或降低后續(xù)亞基對同種別構(gòu)效應(yīng)劑的親和力。 異種協(xié)同效應(yīng)（heterotropic cooperativity） 別構(gòu)效應(yīng)劑引起的構(gòu)象改變增加或降低后續(xù)亞基對他種別構(gòu)效應(yīng)劑的親和力。 同種協(xié)同效應(yīng)（homotropic cooperativit別構(gòu)效應(yīng)劑引起的構(gòu)象改變增加酶對底物的親和力，這種現(xiàn)象（屬于異種正協(xié)同效應(yīng)）稱為別構(gòu)激活作用（allos

32、teric activation）。此別構(gòu)效應(yīng)劑稱為別構(gòu)激活劑（allosteric activator） 引起酶對底物親和力降低的現(xiàn)象（屬于異種負協(xié)同效應(yīng)）稱為別構(gòu)抑制作用（allosteric inhibition）。此別構(gòu)效應(yīng)劑稱為別構(gòu)抑制劑（allosteric inhibitor）別構(gòu)效應(yīng)劑引起的構(gòu)象改變增加酶對底物的親和力，這種現(xiàn)象（屬于（三）別構(gòu)酶的動力學(xué)特性不遵守米-曼氏動力學(xué) 正協(xié)同效應(yīng)的底物濃度-反應(yīng)速率曲線為S形曲線 負協(xié)同效應(yīng)的底物-速率曲線外形類似矩形雙曲線，但不是矩形雙曲線 （三）別構(gòu)酶的動力學(xué)特性不遵守米-曼氏動力學(xué) 正協(xié)同效應(yīng)的底三、一些調(diào)節(jié)酶可在催化方向相反的

33、兩種酶的作用下發(fā)生共價修飾 （一）磷酸化與去磷酸化是最多見的共價修飾方式 共價修飾(covalent modification)或化學(xué)修飾(chemical modification) 酶分子中的某些基團可在其他酶的催化下，共價結(jié)合某些化學(xué)基團；同時又可在另一種酶的催化下，將此結(jié)合上的化學(xué)基團去掉，從而影響酶的活性。 三、一些調(diào)節(jié)酶可在催化方向相反的兩種酶的作用下發(fā)生共價修飾 酶的共價修飾種類： 1. 磷酸化（phosphorylation） 和去磷酸化（dephosphorylation） 2. 甲基化（methylation） 和去甲基化（demethylation） 3. 腺苷化（ade

34、nylation） 和去腺苷化（deadenylation） 4. 尿苷化(uridylation) 和去尿苷化（deuridylation） 磷酸化和去磷酸化修飾是最常見的共價修飾 酶的共價修飾種類： 1. 磷酸化（phosphorylati 酶的磷酸化與脫磷酸化 -OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶 ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白 酶的磷酸化與脫磷酸化 -OHThr酶蛋白H2O（二）共價修飾可引起級聯(lián)放大效應(yīng) 在一個連鎖反應(yīng)中，一個酶被磷酸化或去磷酸化激活后，后續(xù)的其他酶可同樣的依次被其上游的酶共價修飾而激活，引起原始信號的放大，這種多重共價修

35、飾的連鎖反應(yīng)稱為級聯(lián)反應(yīng)（cascade reaction）。 級聯(lián)反應(yīng)的主要作用是產(chǎn)生快速、高效的放大效應(yīng)。 （二）共價修飾可引起級聯(lián)放大效應(yīng) 在一個連鎖反應(yīng)中，一個酶被四、一些酶只有通過對其前體剪切后才有活性酶原 (zymogen)有些酶在細胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，此前體物質(zhì)稱為酶原。 酶原的激活在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過程。四、一些酶只有通過對其前體剪切后才有活性酶原 (zymoge 酶原激活的原理酶 原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心 一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽在特定條件下 酶原激活的原理酶 原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中賴

36、纈天天天天甘異賴纈天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活過程賴纈天天天天甘異賴纈天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組酶原激活因子激活途徑胃蛋白酶原H+或胃蛋白酶胃蛋白酶 + 六肽胰蛋白酶原腸激酶、胰蛋白酶胰蛋白酶 + 六肽胰凝乳蛋白酶原胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶 + 2個二肽彈性蛋白酶原胰蛋白酶彈性蛋白酶 + 幾個肽段羧基肽酶原胰蛋白酶羧基肽酶 + 幾個肽段消化蛋白酶原的激活 酶原激活因子激活途徑胃蛋白酶原H+或胃蛋白酶胃蛋白酶 + 六胰腺1 245S S S S胰蛋白酶1 15 16 245S S S S1 13 16 245S S S SSe

37、r14-Arg15，Thr147-Asn148酶原-胰凝乳蛋白酶 -胰凝乳蛋白酶-胰凝乳蛋白酶 -胰凝乳蛋白酶194Ile16轉(zhuǎn)180Asp194Met192內(nèi)表，Gly193伸長Ser195，His57移位Asp192146 149-胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶胰腺1 245S S Asp102 C-C=O H2 O H- N N H-O-CH2Ser195Asp102 C-C=O H2 O H- N N H- O-CH2Ser195His57CH2His57CH2His57 Ser195 親核攻擊Asp102 穩(wěn)定His57 -胰凝乳蛋白酶活性中心Asp102Ser195Asp102Ser195H

38、is57專一性：-胰凝乳蛋白酶：Leu13-Ser14,Tyr146-Thr147,Asn148-Ala149-胰凝乳蛋白酶：芳香族：Phe，Tyr，Trp專一性： 酶原激活的生理意義避免細胞產(chǎn)生的酶對細胞進行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進行。有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。 酶原激活的生理意義避免細胞產(chǎn)生的酶對細胞進行自身消化，并使第五節(jié)酶與醫(yī)學(xué) Enzymes and Medical Sciences 第五節(jié)一、酶與疾病的發(fā)生、臨床診斷與治療密切相關(guān) （一）許多疾病與酶的質(zhì)和量的異常相關(guān)1酶的先天性缺陷是

39、先天性疾病的重要病因之一 酪氨酸酶缺乏引起白化?。槐奖彼崃u化酶缺乏引起苯丙酮酸尿癥。 2酶活性改變可引起疾病 胰腺炎因胰蛋白酶在胰腺中被激活。 3一些疾病可以引起酶活性的改變 嚴重肝病時可因肝合成的凝血因子減少而影響血液凝固。 一、酶與疾病的發(fā)生、臨床診斷與治療密切相關(guān) （一）許多疾病與（二）體液中酶的活性可作為疾病的診斷指標 2. 惡性腫瘤可因腫瘤組織的增殖加快，其標志酶釋放入血增多，有助于對該組織腫瘤的診斷。 前列腺癌病人血清酸性磷酸酶含量增高。 組織器官損傷可使其組織特異性的酶釋放入血，有助于對此組織器官疾病的診斷。 急性肝炎時，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高。 3. 有些酶的清除和排泄障

40、礙也可造成血清含量升高。 肝硬化時血清堿性磷酸酶活性升高。 4. 酶的誘導(dǎo)合成增多也可以從血清中檢測出來，用于協(xié)助診斷和預(yù)后判斷。 膽管阻塞時膽汁返流可刺激肝合成堿性磷酸酶增多。 （二）體液中酶的活性可作為疾病的診斷指標 2. 惡性腫瘤可因（三）酶作為藥物可用于疾病的治療 1有些酶作為助消化的藥物 消化腺分泌功能不良所致的消化不良可服用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等予以糾正。 3有些酶具有溶解血栓的療效 鏈激酶、尿激酶及纖溶酶等溶解血栓，用于治療心、腦血管栓塞等。 胰蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等可加強傷口的凈化、抗炎和防止?jié){膜粘連等。在某些外敷藥中加入透明質(zhì)酸酶可以增強藥

41、物的擴散作用。 2.有些酶用于清潔傷口和抗炎（三）酶作為藥物可用于疾病的治療 1有些酶作為助消化的藥（四）有些藥物通過抑制或激活體內(nèi)某種酶的活性起治療作用 一些藥物通過抑制某些酶的活性，糾正體內(nèi)代謝紊亂。如抗抑郁藥通過抑制單胺氧化酶而減少兒茶酚胺的滅活，治療抑郁癥。洛伐他汀通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶的活性，抑制膽固醇的生物合成，降低血膽固醇。給新生兒服用苯巴比妥可誘導(dǎo)肝細胞UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的生物合成，減輕新生兒黃疸，防止出現(xiàn)膽紅素腦病。 （四）有些藥物通過抑制或激活體內(nèi)某種酶的活性起治療作用 一些二、酶作為試劑可用于生物化學(xué)分析 （一）有些酶可作為酶偶聯(lián)測定法中的指示酶或輔助

42、酶 當有些酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物不能被直接測定時，可偶聯(lián)另一種或兩種酶，使初始反應(yīng)產(chǎn)物定量地轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y量的某種產(chǎn)物，從而測定初始反應(yīng)的底物、產(chǎn)物或初始酶活性。這種方法稱為酶偶聯(lián)測定法。 若偶聯(lián)一種酶，這個酶即為指示酶（indicator enzyme）；若偶聯(lián)兩種酶，則前一種酶為輔助酶（auxiliary enzyme），后一種酶為指示酶。 二、酶作為試劑可用于生物化學(xué)分析 （一）有些酶可作為酶偶聯(lián)測葡糖氧化酶法測定血糖時，過氧化物酶為指示酶。葡糖氧化酶法測定血糖時，過氧化物酶為指示酶。酶聯(lián)免疫分析又稱酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme-linked immunosorbent assays, E

43、LISA） 是利用酶的快速、靈敏、可定量檢測的優(yōu)點和免疫學(xué)方法中抗原-抗體特異性結(jié)合的優(yōu)點，將指示酶與抗體偶連，對抗原進行檢測的一種方法 。（二）有些酶可作為酶標記測定法中的標記酶 酶聯(lián)免疫分析又稱酶聯(lián)免疫吸附測定 是利用酶的快速、靈敏、可定常用的標記酶：辣根過氧化物酶堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶-半乳糖苷酶常用的方法 將辣根過氧化物酶與抗體偶聯(lián)，通過顯色測定酶的活性，進而計算出與酶偶聯(lián)抗體所結(jié)合的抗原的量。 常用的標記酶：辣根過氧化物酶堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶-半（三）多種酶成為基因工程常用的工具酶 多種酶已常規(guī)用于基因工程操作過程中。例如，型限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶等。 （三）多種酶成為基因工程常用的工具酶 多種酶已常規(guī)用于基因工三