種質(zhì)資源保存課件

1、項(xiàng)目十三植物種質(zhì)資源的保存1.掌握種質(zhì)資源長期保存與中短期保存的方法。2.掌握超低溫保存的基本流程。 3.能夠根據(jù)離體材料的特點(diǎn)，離體保存種質(zhì)材料。教學(xué)目標(biāo) 種質(zhì)是親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。 植物種質(zhì)資源即為攜帶各種不同遺傳物質(zhì)的植物總稱，又稱遺傳資源或品種資源，包括栽培，野生及人工創(chuàng)造的各種植物的品種或品系。 種質(zhì)資源保存是指在天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境條件下，貯存植物種質(zhì)，使其保持生命力與遺傳性的技術(shù)。 項(xiàng)目介紹原地保存異地保存原地保存主要通過建立自然保護(hù)區(qū)、天然公園來實(shí)現(xiàn)種質(zhì)保存的目的；異地保存則通過建立植物園、種質(zhì)資源圃、種子庫以及離體保存等方法來實(shí)現(xiàn)。 種質(zhì)保存的方

2、式:一、超低溫保存技術(shù)（以玉米為例）（1）新建玉米懸浮培養(yǎng)體系。（2）新鮮培養(yǎng)基洗滌懸浮細(xì)胞。（3）加入等量的冷凍保護(hù)劑脯氨酸。（4）冰上保存1h。（5）冷凍保存，先降溫至-30，停留半小時(shí)， 再投入液氮。（6）以40水浴解凍，然后培養(yǎng)。工作任務(wù)珍寶島國家級自然保護(hù)區(qū)華南植物園西雙版納植物園（二）34d后用不含脯氨酸的新鮮培養(yǎng)基將上述預(yù)處理過的懸浮細(xì)胞洗凈、重新懸浮培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基中。（三）將含有20%脯氨酸的冷培養(yǎng)基分成4份并在1h內(nèi)逐漸加入到等量的冷細(xì)胞懸浮液中。（四）將混合液在冰上保存1h后，轉(zhuǎn)移到滅過菌的聚丙烯安剖瓶中，蓋好螺帽（每兩個(gè)安剖瓶中用移液槍接入1mL混合液）。相關(guān)實(shí)踐知識（

3、五）用可控降溫儀以1/min的速度將按剖瓶冷卻到-30，并停留3040min后投入到液氮冰箱中進(jìn)行貯存。（六）解凍時(shí)，從液氮冰箱中取出安剖瓶，直接放到40水浴鍋中，停留12min.（七）將混合液涂在瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行重新培養(yǎng)。（八）細(xì)胞生活力檢查 相關(guān)實(shí)踐知識超低溫庫馬鈴薯限制生長離體試管苗保存技術(shù)（一）試管苗培養(yǎng) （二）延長試管苗保存期 1.培養(yǎng)基中添加脫落酸和甘露醇 2.用塑料薄膜封閉試管口 3.加入適當(dāng)多量的培養(yǎng)基種質(zhì)資源離體保存離體保存方法：低溫保存超低溫保存生長抑制劑保存相關(guān)閱讀（一）低溫保存 一種緩慢生長保存方法，是通過控制培養(yǎng)溫度來限制培養(yǎng)物各種生長因子的作用，使培養(yǎng)物生長減少

4、到最低限度。 相關(guān)閱讀低溫保存的基本特征是保存材料的定期繼代培養(yǎng)，不斷繁殖更新；基本措施是控制保存材料所處的溫度和光照。延緩保存材料生長速度的另一項(xiàng)措施是改變培養(yǎng)基的成分。 種質(zhì)庫要定期檢查，保持清潔，及時(shí)清除污染材料，并注意積累資料。（二）超低溫保存 一般以液N2為冷源 超低溫保存：也叫冷凍保存，指在-196的液氮超低溫下使細(xì)胞代謝和生長處于基本停止的狀態(tài)，在適宜條件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原來的遺傳特性。相關(guān)閱讀 植物細(xì)胞含水量大，冰凍保存難度大，投放液N2中易引起組織和細(xì)胞死亡，故須借助于冷凍防護(hù)劑，防止細(xì)胞冰凍或解凍時(shí)引起過度脫水而遭到破壞，保護(hù)細(xì)胞。超低溫冰箱冷凍的4種方法快

5、速冷凍法慢速冷凍法分步冷凍法干燥冷凍法（2）冷凍處理a、快速冷凍法 指將植物材料從0或者其他預(yù)處理溫度直接投入液氮中保存的方法，降溫速度為1000/min。 要求細(xì)胞體積小、細(xì)胞質(zhì)濃厚、含水量低、液泡化程度低的材料。b、慢速冷凍法 將處于0或其他預(yù)處理溫度的材料以1-2/min的降溫速度從起始溫度降到-100，穩(wěn)定1h后，投入到液氮保存或以此降溫速度連續(xù)降溫至-196的方法。適宜保存的材料有成熟的、含有大液泡和含水量高的細(xì)胞，對于保存在懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞特別有效。c、預(yù)冷凍法 指將植物保存材料放入液氮前，需經(jīng)過短暫時(shí)間的低溫鍛煉的方法?？煞譃閮刹嚼鋬龇ê椭鸺壚鋬龇??？墒贡４娌牧霞?xì)胞內(nèi)充分脫水，避

6、免因細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰而導(dǎo)致不可逆?zhèn)Φ某霈F(xiàn)。d、干燥冷凍法 將材料置于27-29烘箱內(nèi)降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。 可防止材料凍死。（3）冷凍貯存 適宜溫度下貯存冷凍材料也很重要。長期內(nèi)貯存在液氮內(nèi)的材料，需合適的液氮容器。冷凍貯存的莖尖隨保存時(shí)間的延長，其生活力可能下降。華南植物園解凍方法快速解凍法慢速解凍法（4）解凍 植物材料在超低溫貯存過程中所發(fā)生的凍害是在冷凍和解凍過程中產(chǎn)生的。解凍過程中發(fā)生的凍害是由細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰造成的。解凍過程中水的滲透沖擊對細(xì)胞膜體系造成破壞。a、快速解凍法 是指將液氮中保存的材料直接投入到37-40溫水浴中進(jìn)行解凍的方法。解凍的升溫速度為500-750/

7、min，大多數(shù)植物材料可采用此種方法。b、慢速解凍法 將液氮中保存的材料先置于0低溫下解凍，再逐漸升至室溫下進(jìn)行解凍的方法。適宜細(xì)胞含水量較低的材料。 如木本植物的冬芽。（5）再培養(yǎng)指將已解凍的材料重新置于培養(yǎng)基上使其恢復(fù)生長的過程。再培養(yǎng)是檢驗(yàn)冷凍保存效果或確定保存方法是否合適的最根本方法。再培養(yǎng)法組織材料預(yù)處理加冷凍防護(hù)劑0慢凍法-40或-100預(yù)凍法-70-20快凍法種質(zhì)庫（-196）迅速解凍（3440）再培養(yǎng)細(xì)胞生長、植株再生超低溫保存的程序3、影響因素 預(yù)處理 冷凍 解凍方法 植物材料的性質(zhì) 冷凍保護(hù)劑的使用所使用的冷凍保護(hù)劑應(yīng)具有以下特性： 分子質(zhì)量較小 易于與溶劑混合 快速滲入細(xì)

8、胞 無毒或毒性小 易洗脫 常用的是DMSO。冷凍保護(hù)劑的作用： 降低冰點(diǎn)，促進(jìn)過冷卻和“玻璃化”狀態(tài)形成 提高溶液黏滯性，阻止冰晶形成 增加細(xì)胞膜透性，加速胞內(nèi)水分向外滲出 穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)大分子正常結(jié)構(gòu)，阻止低溫對膜的傷害4、超低溫保存后細(xì)胞或組織活力檢測根本方法是再培養(yǎng)染色法：FDA、伊凡藍(lán)法、TTC等存活率公式：存活率（%）= 100%重新生長的細(xì)胞（組織）數(shù) 解凍的細(xì)胞（組織）數(shù)（三）生長抑制劑保存 高滲保存法 生長抑制劑保存法 饑餓法 礦物油覆蓋法 低光照培養(yǎng)法 低壓保存法。1、高滲保存法 利用培養(yǎng)基的高滲透壓來抑制離體培養(yǎng)材料生長的種質(zhì)保存方法。 高滲物質(zhì)：甘露醇、蔗糖、PEG等 高滲保存配合低溫效果更明顯如：610低溫下，培養(yǎng)基中加4%甘露醇，可保存馬鈴薯1 2年，存活率最高可達(dá)90%以上。2、生長抑制劑保存法 在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的生長，達(dá)到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。生長調(diào)節(jié)劑： ABA、青鮮素、CCC、多效唑、B9等使試管苗生長緩慢，生長健壯、葉色濃綠、移栽成活率高。3、饑餓法 從培養(yǎng)基中減去12種營養(yǎng)元素，使植株缺乏相關(guān)營養(yǎng)而處于最小生長量4、礦物油覆蓋法 使培養(yǎng)材料與空氣隔絕，延緩生長5、低光照培養(yǎng) 適當(dāng)減弱光照強(qiáng)度，縮短光照時(shí)間，進(jìn)而減緩試管苗生長6、低壓保存 降低培養(yǎng)材料周圍氣壓，達(dá)到抑制生長的目的分為低氣壓與低氧壓兩種，保存原理