基因工程專題1-2課件

1、選修3現(xiàn)代生物科技專題專題1 基因工程DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程應(yīng)用蛋白質(zhì)工程的崛起1.2 基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的獲取 目的基因主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因. 目前被較廣泛提取使用的目的基因有：生物抗逆性相關(guān)基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等。如蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因、生物各抗性基因等。目的基因的獲取1.從基因文庫中獲取目的基因基因文庫基因組文庫部分基因文庫目的基因的獲取2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因 PCR技術(shù)的名稱叫什么?其

2、原理是什么?其做法包括幾步?需要什么條件?3.化學方法人工合成(DNA合成儀)第三步:將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（Ti質(zhì)粒）(雙子葉、裸子植物常用）基因槍法(單子葉植物常用)花粉管通道法3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少，故早期常作為受體細胞。大腸桿菌細胞用Ca2+處理感受態(tài)細胞重組表達載體DNA溶于緩沖液混合轉(zhuǎn)入第四步：目的基因的檢測與鑒定1.檢測是否插入了目的基因(原理:DNA分子雜交技術(shù))2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA(原理:DNA-RNA雜交技術(shù))3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)(原理:抗原-抗體雜交技術(shù)

3、)4.個體生物學水平的鑒定32P標記的DNA分子探針雜交放射自顯影法 如何從基因文庫中獲取目的基因?qū)嶒炘O(shè)計: 請設(shè)計一個實驗鑒定某一轉(zhuǎn)入抗蟲基因的棉花是否具有抗蟲性。思考與探究P151.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？ 2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理，你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？若想將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物，如小麥，從理論上說，你應(yīng)該如何做？思考與探究P153.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？4.-珠蛋白是

4、動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進行設(shè)計？ 1.答：不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件

5、，如增強子等；（5） 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。 利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉(zhuǎn)化時，是需要加上述酚類物質(zhì)的。 如果想將一個抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點：要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。 3. 提示：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)

6、網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。 細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因組文庫的構(gòu)建 細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序苯酚沉淀蛋白質(zhì) 紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度 基因組DNA文庫的構(gòu)建 將總DNA經(jīng)過酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。cDNA文庫的構(gòu)建mRNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）第二條DNA鏈 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA, cDNA構(gòu)建基因文庫獲

7、取目的基因存在的問題費時費事內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補 DNA方法的優(yōu)勢 獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）PCR技術(shù)是聚合酶鏈式反應(yīng)的縮寫。是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。加入4種物質(zhì)： （1）作為模板的DNA序列； （2） DNA引物（20個左右堿基的短DNA單鏈，與被分離的目的基因兩條鏈各自5端序列相互補）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。 （5）能量ATP 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）變性、退火、延伸三步曲高溫變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA低溫退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補