基因工程-目的基因的獲取課件

1、1第四章 目的基因的獲取第一節(jié) 基因組DNA片斷化第二節(jié) 化學(xué)合成目的基因第三節(jié) 目的基因的保存和擴增第四節(jié) 目的基因的分離和擴增2第四章 目的基因的獲取目的基因： 研究某個基因，或者要克隆某個基因用于生產(chǎn)大量DNA和蛋白質(zhì)分子,首先都要把它從龐大的基因組中分離出來。 你所感興趣和想研究的基因，稱為目的基因。3目的基因需要克隆的DNA片段。編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系45第一節(jié) 基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法二、隨機片斷化7第一節(jié) 基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切8二、隨機片斷化1. 限制性內(nèi)切酶局

2、部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。 內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。限制性內(nèi)切酶的選用原則101）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個切點。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個切點。隨機程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。（Sau3ABamH I）112. 機械切割法（1）超聲波超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷。12第二節(jié) 化學(xué)合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷

3、酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。14 保護dNTP的5端-OH 或3端P 用酸或堿的脫保護（1）原理1. 磷酸二酯法 帶保護的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進行。帶5保護的單核苷酸與帶3保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。15原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先連接了一個保護基團。2. 磷酸三酯法17固相磷酸三酯合成過程固相支持物結(jié)果是全保護的DNA：5 DMT, 3固相支持物, 最后脫保護。固相支持物固相支持物C18化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。二、 化學(xué)合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個片段的5端帶上磷酸。1

4、. 互補連接法預(yù)先設(shè)計合成的片斷之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。（2）5端磷酸化（1）互補配對（合成的DNA單鏈的5端是-OH）19T4 DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈202. 互補延伸連接法預(yù)先設(shè)計的片斷之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。355353T4DNA連接酶Klenow片段引物211. 直接合成基因三、 寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點2. 合成引物3. 合成探針序列4. 定點突變合成合成帶有定點突變的基因片斷。2224DNA合成儀5. 合成人工接頭或銜接物

5、含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor25 將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細胞中保存和擴增。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。一、基因文庫的構(gòu)建1. 基因文庫（gene library）第三節(jié) 目的基因的保存和擴增27（2）目前常用的載體 2. 構(gòu)建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對

6、載體的要求載體系列： 容量為 24 kpcosmid載體： 容量為 50 kb YAC： 容量為 1 MbBAC: 容量為 300 kb28斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3. 基因文庫構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。 物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷。 酶切法：29（2）載體與基因組DNA大片段的連接 粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。人工接頭法（adapte

7、r）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。30各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端 同聚物加尾3132限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因組文庫33酵母人工染色體基因組文庫的構(gòu)建344. 基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文庫包含了整個

8、基因組DNA的概率（99%）f: 插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因 組DNA的百分數(shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）35例如：人的基因組是 3109 bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61Gf=4.6131091.7104= 8.1105361. cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2. cDNA library二、 cDNA文庫的構(gòu)建mRNAcDNA3355反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合

9、成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。37（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。3. cDNA文庫的特點384. 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 逆轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制394. 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（total RNA）提取提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。40分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、

10、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化 原理 mRNA的分離純化Column（柱）41Oligo dT纖維柱層析法AAAAAAAAAAAAOligo dTOligo dTOligo dT4243反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成 cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用Oligo dT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物44用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3355反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3355引物cD

11、NA第一鏈35引物 降解mRNA模板或RNaseH堿45剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈53 cDNA第二鏈合成46去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈53cDNA第一鏈cDNA第二鏈53534748這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合

12、成岡崎片斷。DNA Pol I除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。49mRNAcDNA35反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈35引物mRNAcDNA第一鏈35mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈35RNaseHDNA ligase去引物50在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶515253546. cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln

13、(1-p)ln (1- )p: 文庫包含了完整mRNA的概率（99%）: 某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n55 基因組DNA克隆 cDNA克隆56三、文庫的查詢（screening）用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southern blot雜交。文庫載體探針電泳后雜交放射自顯影測序分析57第四節(jié) 目的基因的分離和擴增二、PCR擴增獲得目的基因一、目的基因的分離58第四節(jié) 目的基因的分離和擴增一、目的基因的分離1. 探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因

14、的mRNA或cDNA模板。59纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotal mRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR602. mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatite column）61從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。將表達A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA

15、單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。62AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A 的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫633. mRNA差異顯示PCR（DD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR（1）3端的錨定引物Oligo(dT)引物的3端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTTM：A、G or CN: A、G、T or C536

16、4（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT53CGTTTTTTTT53GGTTTTTTTT53TGTTTTTTTT53AATTTTTTTT53CATTTTTTTT53GATTTTTTTT53TATTTTTTTT53ACTTTTTTTT53CCTTTTTTTT53GCTTTTTTTT53TCTTTTTTTT5365（3）5端的隨機引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NMTTTTTTTT53擴增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5cDNA3NNNNNNNNNN53NNNNNNNNNN53cDNA第二鏈，并PCR66（4）隨機引物與錨定引物成對擴增12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。引物組合：240組在能分出20000多條帶！實驗結(jié)果：如果每條帶相當(dāng)于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶。67（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因