高效液相色譜法測(cè)定火腿腸食品中防腐劑含量的方法

1、超聲提取-固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定火腿腸防腐劑含量的方法摘要:針對(duì)火腿腸食品特點(diǎn)，對(duì)液相色譜法測(cè)定火腿腸中苯甲酸、山梨酸的樣品 處理方法進(jìn)行研究，建立了有效的高效液相色譜法測(cè)定火腿腸食品中防腐劑含量 的樣品處理方法。關(guān)鍵詞：火腿腸食品特點(diǎn);高效液相色譜法;測(cè)定；防腐劑含量1、引言火腿腸是深受廣大消費(fèi)者歡迎的肉類食品，為防止食品變質(zhì)，生產(chǎn)廠家常在火腿 腸中加入防腐劑。我國(guó)目前常用食品防腐劑主要有苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其 鉀鹽為主?；鹜饶c中苯甲酸和山梨酸的測(cè)定樣品處理方法，在國(guó)標(biāo)GB/T5009. 29 -2003中苯甲酸、山梨酸測(cè)定的液相色譜法中，只規(guī)定了飲料和配制酒樣品處 理方法，其它樣

2、品處理沒有提及。火腿腸食品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基質(zhì) 成份較多，并且苯甲酸、山梨酸具有脂溶性的性質(zhì)決定了樣品處理的復(fù)雜性。本 文針對(duì)火腿腸食品特點(diǎn)，對(duì)液相色譜法測(cè)定火腿腸中苯甲酸、山梨酸的樣品處理 方法進(jìn)行研究，建立有效的高效液相色譜法測(cè)定火腿腸食品中防腐劑含量的樣品 處理方法。2、實(shí)驗(yàn)2.1儀器與試劑2.11儀器2臺(tái)LC-10Tvp梯度高效液相色譜儀（配置LC-10Tvp高壓恒流泵）；一臺(tái)SPD-10Tvp 紫外檢測(cè)器；一臺(tái)SCL-10Tvp系統(tǒng)控制器；一套7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥；一套色譜 工作站（VI2010，N2000，N3000 選用）；液相色譜柱：1 支 （C18 4.6*250m

3、n， 5um）；微量進(jìn)樣器：1支（50ul/100ul）；進(jìn)樣支架：1只（進(jìn)樣閥用） 2.12試劑火腿腸市售。苯甲酸（分析純，99.5%）、山梨酸（化學(xué)純，99.0%）、乙酸銨（分析 純，98.0%）、乙酸鉛（分析純，99.5%）溶液（379.33g/L）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 甲醇（色譜純，99.9%）、三次去離子水。2.2方法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制分別稱取山梨酸0.1000g，苯甲酸0.1000g，加入8ml20g/L NaHCO3溶液，定容 于100ml容量瓶，配成1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)貯備液。2.2.2色譜參數(shù)和條件島津色譜柱 VP-ODS（250mmx4.6mm，5pm）；進(jìn)樣

4、量：201 ；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm； 靈敏度0.02AUFS。2.2.3樣品制備超聲提取稱取2.0g火腿腸，經(jīng)研缽研碎后置于25ml比色管，加5ml水，經(jīng)80。水浴加熱 30min后，超聲提取30min，以10000r/min高速離心5min，取上清液至25ml容 量瓶，定容至刻度。固相萃取凈化：取C18 SPE固相萃取小柱依次用5ml甲醇 和3ml水活化后，再通過5ml樣液，用5ml甲醇淋洗，棄去淋洗液，再用5ml 水以一定的速度洗脫，收集洗脫液2.5ml容量瓶，經(jīng)過0.45pm濾膜過濾后，用 HPLC分析。3結(jié)果與分析3.1色譜條件的優(yōu)化3.1.1流動(dòng)相的組成及配比的選擇流動(dòng)相是色譜分離中

5、十分重要的影響因素，直接關(guān)系到分析的靈敏度、檢出限， 決定著能否將樣品的組分洗脫分離。苯甲酸、山梨酸在不同的組成及不同的比例 時(shí)的分離效果，由表1可見，流動(dòng)相為0.02mol/L乙酸銨：甲醇體積比為95:5時(shí)的分離效果好。表1不同組成和配比的流動(dòng)相的分籬效果Tabls 1 Effectivensss of different fiubils ptiaEBS for His separation of subic acid and benzoic acid流動(dòng)相水:甲醇 *H)2h：ioV.WEi卻兒召酸毆甲醇甑比，VVi陽頂乙酸鉉:甲醇I歸亍I禎)，3出2流速的選擇，二-三1- -本實(shí)驗(yàn)分別選

6、擇鼠8、us態(tài)孫命射肺組 作為流動(dòng)相的流速，結(jié)果顯示，流速為 1.0ml/min時(shí)洗脫的山梨酸和苯甲酸的量，比1.2ml/min時(shí)的多，并已能較為完全的洗脫， 分離效果理想，不干擾測(cè)定；而選擇0.8ml/min作為流速，則分析時(shí)間過長(zhǎng)。綜 上述情況，選擇1.0ml/min作為流動(dòng)相的流速。3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及相關(guān)系數(shù)測(cè)定分別移取1.0、2。0、3.0、4.0、5.0ml 1.0mg/ml的苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液于 50ml容量瓶，用水定容至刻度，配成濃度分別是20、40、60、80、100mg/L的 標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45pm濾膜過濾后，取20pl注入色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)濃度(mg/

7、L)作標(biāo)準(zhǔn) 曲線。苯甲酸線性方程為y=2867x+876.78，相關(guān)系數(shù)0.9986；山梨酸線性方程 為y=4469.9x+1928.6，相關(guān)系數(shù)0.9989。本法苯甲酸和山梨酸在20100mg/L 范圍線性很好。3.3樣品前處理方法的優(yōu)化3.3.1樣品凈化方法的選擇用水提取的樣品液中雜質(zhì)非常多，含有較多的水溶性蛋白質(zhì)，如果不進(jìn)行凈化而 直接進(jìn)行液相色譜分析，將嚴(yán)重影響色譜柱的使用壽命。殷茂榮等8采用添加 蛋白質(zhì)沉淀劑的方法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。分別采用以C18 SPE小柱和加入乙酸鉛 (379.33g/L)作為蛋白質(zhì)沉淀劑兩種方法凈化樣品，乙酸鉛的加入量為3ml。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，經(jīng)過C18 SPE

8、小柱凈化山梨酸提取量為22.706mg/L，乙酸鉛作為蛋 白質(zhì)沉淀劑凈化山梨酸提取量為17.202mg/L。采用乙酸鉛作為蛋白質(zhì)沉淀劑， 會(huì)對(duì)山梨酸造成損失。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇固相萃取方法凈化樣品。3.3.2洗脫流速由于C18 SPE小柱對(duì)目標(biāo)物有吸附作用，因此洗脫液的流速對(duì)洗脫量也有影響， 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)減慢流速可增加洗脫量，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，選擇以1.0ml/min的洗脫速度洗脫。 3.3.3防腐劑提取方法的選擇方法加熱山梨酸峰面租貝996.406K7219.00（1平均值K942CL234含9374RSDi：%3項(xiàng)）實(shí)驗(yàn)號(hào)提取時(shí)間 提取崖1W2(HHH2202O.K2333仆22.70644022.702

9、楠舊5.297102626.000超聲叩州切3WK79.I02K5536.594KB33K.36K22.6K73.74振蕩WH9HRJDOOKK273.2O3SS265.93219.3153.09表2不同提取方法對(duì)比Table 2 Comparison of subic acid extraction by different methods表3超聲時(shí)間對(duì)提取量的影響Table 3 Effects of ultrasonic treatment time o(i extraction uf sobic acid分別稱取3份2.0g火腿腸與25ml比色管，加5ml水于80C水浴30min,標(biāo)號(hào)1

10、、 2、3將1號(hào)比色管置于80C恒溫水浴中，加熱30min, 2號(hào)比色管超聲30min, 3號(hào)比色管于水浴恒溫振蕩器中振蕩30min，按2.2節(jié)所述色譜條件進(jìn)行分析， 每種提取方法平行測(cè)定3次。表2結(jié)果顯示，超聲提取的提取量高于加熱和振蕩 提取。3.3.4超聲提取時(shí)間取4份2.0g火腿腸于25ml比色管，分別標(biāo)號(hào)1、2、3、4.各加5ml水，于80C 水浴加熱30min，1號(hào)超聲10min，2號(hào)超聲20min，3號(hào)超聲30min，4號(hào)超聲 40min，按照2.2.3方法進(jìn)行分析，結(jié)果見表3,顯示超聲提取30分鐘效果較好。 3.4.檢出限以樣品被測(cè)組分峰高為基線噪音3倍時(shí)的濃度為最低檢出濃度，苯

11、甲酸的檢出限 為1.47p g/kg，山梨酸的檢出限為0.86p g/kg。3.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)不同加標(biāo)水平的苯甲酸、山梨酸的回收率為101.79%105.28%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差小于等于1.84%。表5二梨酸卻蕓甲酸的回收率和用對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏恙表5二梨酸卻蕓甲酸的回收率和用對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏恙（.3）本底值坦）加標(biāo)值刪里值頃回吸率,RSD%)0.1141.0191.167103.31mw山梨酸fl.1141.5221.716J05J2H0.79fl.1142.0312.24KHH.410.72OUOOO0.WK1.016101.79“.46苯甲酸OUOOO1.521J76fk67(IW02,0362.mi102701.S4Table 5 Recuveries uf subic acid and benzoic acid at three spiked levels (f?=3)時(shí)間mill |圖1火龐腸硅呂液相色i普?qǐng)DFig.1 HPLC cfirornatcgrarn of extra-ut of harn sausage sarnple3.6樣品測(cè)定由圖1可見，市售火腿腸中山梨酸（SA）的含量為22.7