定性免疫學(xué)檢驗(yàn)的性能驗(yàn)證與質(zhì)量控制

1、 楊方華 定性免疫學(xué)檢驗(yàn)的性能驗(yàn)證與質(zhì)量控制CNAS-CL39：2012醫(yī)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室質(zhì)量量和能力力認(rèn)可準(zhǔn)準(zhǔn)則在在臨床免免疫學(xué)檢檢驗(yàn)領(lǐng)域域的應(yīng)用用說(shuō)明：檢驗(yàn)方法法和程序序的分析析性能驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)容容應(yīng)參考試試劑盒說(shuō)說(shuō)明書上上明確標(biāo)標(biāo)示的性性能參數(shù)數(shù)進(jìn)行驗(yàn)驗(yàn)證，至少應(yīng)應(yīng)包括：檢出限、符合率（采用國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)血清盤盤或臨床床診斷明明確的陰陰陽(yáng)性樣樣品各20份或或與其他他分析方方法比對(duì)對(duì)），精密度（包括重重復(fù)性和和批間精精密度）；并應(yīng)應(yīng)明確檢檢驗(yàn)項(xiàng)目目的預(yù)期期用途，如篩查、診斷、確認(rèn)。一、定性性免疫試試驗(yàn)的性性能驗(yàn)證證篩查試驗(yàn)驗(yàn)診斷試驗(yàn)驗(yàn)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)C50C5C95性能驗(yàn)證證相關(guān)概概念一份樣本本，在多多次

2、重復(fù)復(fù)實(shí)驗(yàn)中中各有50%的的幾率獲獲得陽(yáng)性性或陰性性的結(jié)果果時(shí)該分分析物的的濃度。對(duì)特定定試劑， C50一旦旦確定，是恒定定不變的的。臨界點(diǎn)（C50）濃度度的定義義C50一份樣本本，在多多次重復(fù)復(fù)實(shí)驗(yàn)中中有95%的幾幾率獲得得陰性結(jié)結(jié)果時(shí)該該分析物物的濃度度。C5濃濃度的定定義C5一份樣本本，在多多次重復(fù)復(fù)實(shí)驗(yàn)中中有95%的幾幾率獲得得陽(yáng)性結(jié)結(jié)果時(shí)該該分析物物的濃度度。C95濃濃度的的定義C95質(zhì)控品：商用或或自備，含陽(yáng)性性和陰性性。C50和和C5（C50-20%）及及C95（C50+20%）濃度樣樣本：用用于重復(fù)性及及最低檢檢出限驗(yàn)證，不不少于40次檢檢測(cè)量。臨床樣本本或血清清盤：用用于準(zhǔn)確

3、性驗(yàn)證，不不少于50份陽(yáng)陽(yáng)性和陰陰性樣本本。性能驗(yàn)證證的樣本本準(zhǔn)備純定性試試驗(yàn)：采用濃度度接近臨臨界值的的分析物物作為檢檢測(cè)材料料，不宜采用用陰性低低值或強(qiáng)強(qiáng)陽(yáng)性樣樣本來(lái)評(píng)評(píng)價(jià)定性性檢測(cè)方方法的不不精密度度。量值化定定性試驗(yàn)驗(yàn)：以COI（cut-off Index）或S/CO比值作作為分析析方法的的精密度度評(píng)價(jià)指指標(biāo)。（一）不不精密度度的驗(yàn)證證定性測(cè)定定精密度度分析質(zhì)質(zhì)量指標(biāo)標(biāo)為C5-C95濃度度區(qū)間（亦即“灰區(qū)”），這一區(qū)間間范圍C5020%。純定性測(cè)測(cè)定不精精密度的的評(píng)估方方法分析物濃濃度接近近臨界值值時(shí)的不不精密度度曲線兩種不同同方法的的不精密密度曲線線比較檢測(cè)試劑劑或系統(tǒng)統(tǒng)的說(shuō)明書可能

4、會(huì)注注明分析析物的臨臨界濃度度，但需需驗(yàn)證。如果臨界界濃度未未知，則則可以將將陽(yáng)性樣樣本進(jìn)行行一系列列稀釋，然后將將他們進(jìn)進(jìn)行重復(fù)復(fù)檢測(cè)以以確定能能夠獲得得50%陽(yáng)性和和50%陰性結(jié)結(jié)果的那那個(gè)稀釋釋度，這這一稀釋釋度的分分析物濃濃度即為為臨界點(diǎn)點(diǎn)（C50）。如何獲得得 “臨臨界點(diǎn)（C50）”制備評(píng)價(jià)價(jià)用樣本本制制備備3份樣樣本：一一份濃度度為C50，一一份為C50+20%，一份份為C50-20%。每份樣本本的體積積需保證證40次次或更多多次重復(fù)復(fù)檢測(cè)的的需要。評(píng)價(jià)方法法每每份樣本本檢測(cè)40次，確定每每一份樣樣本結(jié)果果為陽(yáng)性性和陰性性的百分分比。純定性試試驗(yàn)不精精密度評(píng)評(píng)價(jià)步驟驟-20%+20

5、%濃濃度范圍圍在C5-C95區(qū)間間之內(nèi)；用該方方法檢測(cè)測(cè)，濃度度超過(guò)C5020%的樣本本檢測(cè)結(jié)結(jié)果不一一致；此此結(jié)論錯(cuò)錯(cuò)誤率5%，需使用用更寬濃濃度范圍圍的樣本本（如30%）進(jìn)行行另外的的試驗(yàn)。不精密度度評(píng)價(jià)結(jié)結(jié)果判斷斷-1-20%+20%濃濃度范圍圍包含了了C5-C95區(qū)間；用該方方法檢測(cè)測(cè)，濃度度超過(guò)C5020%的樣本本檢測(cè)結(jié)結(jié)果一致致不精密度度評(píng)價(jià)結(jié)結(jié)果判斷斷-2用該方法法檢測(cè)，C50+20%的樣樣本檢測(cè)測(cè)結(jié)果一一致，C50-20%的樣本本不一定定能得到到一致結(jié)結(jié)果；需需要用低低于C50更大大百分率率濃度的的樣本（如-30%）進(jìn)行補(bǔ)補(bǔ)充試驗(yàn)驗(yàn)。不精密度度評(píng)價(jià)結(jié)結(jié)果判斷斷-3用該方法法檢測(cè)

6、，C50-20%的樣樣本檢測(cè)測(cè)結(jié)果一一致，C50+20%的樣本本不一定定能得到到一致結(jié)結(jié)果；需需要用高高于C50更大大百分率率濃度的的樣本（如+30%）進(jìn)行補(bǔ)補(bǔ)充試驗(yàn)驗(yàn)。不精密度度評(píng)價(jià)結(jié)結(jié)果判斷斷-4有些定性性免疫測(cè)測(cè)定，如如ELISA等等，樣本本的測(cè)定定結(jié)果可可以COI（cut-off Index）或S/CO比值來(lái)來(lái)表示，檢測(cè)系系統(tǒng)或試試劑廠家家會(huì)在其其試劑說(shuō)說(shuō)明書中中給出試試劑的批批內(nèi)和批批間變異異，這對(duì)對(duì)于對(duì)實(shí)實(shí)驗(yàn)室評(píng)評(píng)價(jià)試劑劑的精密密度以及及評(píng)估其其室內(nèi)質(zhì)質(zhì)控的批批間變異異結(jié)果有有參考價(jià)價(jià)值。分為批內(nèi)內(nèi)精密度度評(píng)估和和批間精精密度評(píng)評(píng)估數(shù)值化定定性免疫疫測(cè)定的的精密度度評(píng)價(jià)方方法操作者

7、必必須熟悉悉檢測(cè)系系統(tǒng)工作作原理，了解并并掌握儀儀器的操操作步驟驟和各項(xiàng)項(xiàng)注意事事項(xiàng)，應(yīng)應(yīng)在評(píng)估估階段維維持儀器器的可靠靠和穩(wěn)定定。用于評(píng)估估試驗(yàn)的的樣本一一般常采采用臨床床實(shí)驗(yàn)室室收集的的血清(漿)樣樣本；當(dāng)當(dāng)實(shí)驗(yàn)室室收集的的樣本不不穩(wěn)定或或不易得得到時(shí)，也可考考慮使用用穩(wěn)定的的、以蛋蛋白質(zhì)為為基質(zhì)的的商品物物質(zhì)，如如校準(zhǔn)品或或質(zhì)控品品。精密度評(píng)評(píng)估的基基本原則則（1）評(píng)估精密密度時(shí)，應(yīng)至少少評(píng)估兩兩個(gè)濃度度水平樣樣本的精精密度。所選樣本本濃度應(yīng)應(yīng)在測(cè)量量范圍內(nèi)內(nèi)有醫(yī)學(xué)學(xué)意義，即至少少有一個(gè)濃度度在醫(yī)學(xué)學(xué)決定水水平左右，在在定性測(cè)測(cè)定，即為接近近臨界水水平的濃濃度。精密度評(píng)評(píng)估的基基本原則則

8、（2）評(píng)估方法法：三個(gè)個(gè)不同濃濃度的樣樣本，在在一個(gè)測(cè)測(cè)試批內(nèi)內(nèi)重復(fù)進(jìn)進(jìn)行至少少20次次檢測(cè)，計(jì)算所所得S/CO值值的均值值和SD，計(jì)算算批內(nèi)CV%。質(zhì)量控制制：檢驗(yàn)驗(yàn)時(shí)應(yīng)同同時(shí)至少少測(cè)一個(gè)個(gè)質(zhì)控品品。判斷結(jié)論論：應(yīng)試劑說(shuō)說(shuō)明書所所標(biāo)明的的批內(nèi)變變異。ELISA的批批內(nèi)變異異CV%應(yīng)10%。批內(nèi)精密密度的評(píng)評(píng)估評(píng)估方法法：三個(gè)個(gè)不同濃濃度的樣樣本，在在10天天以上時(shí)時(shí)間內(nèi)單單次重復(fù)復(fù)進(jìn)行至至少20批檢測(cè)測(cè)，計(jì)算算所得S/CO值的均均值和SD，計(jì)計(jì)算批間間CV%。質(zhì)量控制制：判斷結(jié)論論：應(yīng)試劑說(shuō)說(shuō)明書所所標(biāo)明的的批間變變異。ELISA的的批間變變異CV%應(yīng)15%。批間精密密度的評(píng)評(píng)估檢測(cè)限（li

9、mitofdetection）是指指檢測(cè)方方法可檢檢測(cè)出的的最低被被測(cè)量濃濃度，也也稱檢測(cè)測(cè)低限（lowerlimitofdetection）或最最小檢出出濃度（minimumdetectable concentration），有時(shí)也稱稱為分析析靈敏度度（analyticalsensitivity）。如前所述述，分析析物濃度度位于C5-C95區(qū)區(qū)間之外外（小于于C5或或大于C95）時(shí)，候候選方法法對(duì)同一一樣本的的重復(fù)性性檢測(cè)將將得到相相同結(jié)果果。因此此，C95代代表了某某一試劑劑可以測(cè)測(cè)出的最最低被測(cè)測(cè)量濃度度。（二）檢檢出限的的驗(yàn)證樣本選擇擇：評(píng)估估試劑分分析靈敏敏度所使使用的樣樣本，如如檢

10、測(cè)項(xiàng)項(xiàng)目有國(guó)家參考考品，則可使使用國(guó)家家參考品品或經(jīng)國(guó)國(guó)家參考考品標(biāo)化化的參考考品進(jìn)行行檢測(cè)，如沒(méi)有有國(guó)家參參考品，則使用用可以溯源源或量化化的樣本，如國(guó)際際標(biāo)準(zhǔn)物物質(zhì)，或或與國(guó)際際標(biāo)準(zhǔn)物物質(zhì)溯源源的樣本本。驗(yàn)證方法法：處于于測(cè)定下下限濃度度（C95）的的樣本，重復(fù)檢檢測(cè)20次，應(yīng)應(yīng)至少有有18次次以上為為陽(yáng)性反反應(yīng)。檢出限的的驗(yàn)證方方法驗(yàn)證方法法及指標(biāo)標(biāo)：以與臨床診斷斷、金標(biāo)準(zhǔn)方方法和標(biāo)準(zhǔn)血清清盤的檢檢測(cè)比較來(lái)評(píng)評(píng)價(jià)，常常以敏感性（包括臨臨床敏感感性）/特異性（包括臨臨床特異異性）和和陽(yáng)性符合合率/陰陰性符合合率來(lái)表示。（三）準(zhǔn)準(zhǔn)確度驗(yàn)驗(yàn)證臨床敏感感性：在在患有明明確臨床床疾病的的患者中中，

11、其檢檢測(cè)結(jié)果果呈陽(yáng)性性或者超超過(guò)正常常值范圍圍的比率率 （即即出現(xiàn)陽(yáng)陽(yáng)性結(jié)果果和確定定患者患患病）。臨床特異異性：在在沒(méi)有特特定臨床床疾病的的患者中中，其檢檢測(cè)結(jié)果果呈陰性性或者在在正常值值范圍內(nèi)內(nèi)的比率率。臨床特異異性和臨臨床敏感感性陽(yáng)性預(yù)測(cè)測(cè)值：即即測(cè)定為為陽(yáng)性的的標(biāo)本實(shí)實(shí)際上為為陽(yáng)性的的可能性性。=真陽(yáng)陽(yáng)性/（真陽(yáng)性性+假陽(yáng)陽(yáng)性）100%陰性預(yù)測(cè)測(cè)值:則則為一份份給出陰陰性結(jié)果果的樣本本實(shí)際上上為陰性性的可靠靠性。= 真真陰性/（真陰陰性+假假陰性）100%陽(yáng)性預(yù)測(cè)測(cè)值和陰陰性預(yù)測(cè)測(cè)值試劑的檢測(cè)結(jié)果共計(jì)分析物陽(yáng)性分析物陰性陽(yáng)性結(jié)果數(shù)TPFPTP+FP陰性結(jié)果數(shù)FNTNFN+TN共計(jì)TP+

12、FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性100%特異性100%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%陰性預(yù)測(cè)值100%符合率100%TP分析物存在時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的數(shù)量。FP分析物不存在時(shí)結(jié)果為陽(yáng)性的數(shù)量。TN分析物不存在時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性的數(shù)量。FN分析物存在時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性的數(shù)量。 敏感性、特異性性和陽(yáng)性性預(yù)測(cè)值值、陰性性預(yù)測(cè)值值的計(jì)算算作為篩查查試驗(yàn)，檢測(cè)的的敏感性應(yīng)95%；作作為診斷斷試驗(yàn)，檢測(cè)敏感性和和特異性性均應(yīng)95%；作為確確認(rèn)試驗(yàn)驗(yàn)特異性性應(yīng)98%-99%。定性免疫疫檢驗(yàn)項(xiàng)項(xiàng)目敏感感性、特特異性要要求如果沒(méi)有可用用的診斷斷標(biāo)準(zhǔn)，那么需需提供待待評(píng)價(jià)試試劑與某一已已驗(yàn)證方方法進(jìn)行行比較的結(jié)果，在這種

13、種情況下下，則不不能夠計(jì)計(jì)算敏感感性和特特異性，而是計(jì)計(jì)算陽(yáng)性性符合率率和陰性性符合率率。這種計(jì)算算反映的的并非方方法的準(zhǔn)準(zhǔn)確度，而是待評(píng)價(jià)試試劑和已已驗(yàn)證方方法的一一致性程程度。陽(yáng)性符合合率和陰陰性符合合率待評(píng)價(jià)試試劑與已已驗(yàn)證方方法相比比較進(jìn)行行陽(yáng)性符符合率和和陰性符符合率的的計(jì)算陽(yáng)性符合合率和陰陰性符合合率的計(jì)計(jì)算待評(píng)價(jià)試劑的檢測(cè)結(jié)果已驗(yàn)證方法+-+ab- cd共計(jì)a+cb+d陽(yáng)性符合合率=a/(a+c)100%。陰性符合合率=d/(b+d)100%。總符合率率=(a+d)/(a+b+c+d)100%。第三方質(zhì)質(zhì)控品檢測(cè)系統(tǒng)統(tǒng)配套質(zhì)質(zhì)控品自制質(zhì)控控品質(zhì)控品的的來(lái)源二、檢驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)質(zhì)量的保

14、保證-室內(nèi)質(zhì)質(zhì)控基質(zhì)：應(yīng)應(yīng)盡量選選擇人血清基基質(zhì)，動(dòng)物源源性的基基質(zhì)由于于人體內(nèi)內(nèi)有大量量的異嗜嗜性抗體體的存在在引起假假失控。稀釋液液也應(yīng)用用人血清清，凍干干品復(fù)溶溶可以使使用生理理鹽水。穩(wěn)定性：有效期期為6個(gè)月以以上,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)應(yīng)對(duì)有效效期進(jìn)行行驗(yàn)證。質(zhì)控物的的選擇質(zhì)控物數(shù)數(shù)量、實(shí)實(shí)驗(yàn)位置置和頻次次：質(zhì)控控物數(shù)量量應(yīng)滿足足一個(gè)批批號(hào)至少少半年的實(shí)驗(yàn)量量。每分分析批至至少安排排一個(gè)弱陽(yáng)性和一個(gè)陰性質(zhì)控(高值陽(yáng)性性血清只只用于監(jiān)監(jiān)控“HOOK效應(yīng)”)。檢測(cè)位置置不能固固定而應(yīng)應(yīng)隨機(jī)放放置。試劑盒所所設(shè)的陰、陽(yáng)性性內(nèi)對(duì)照是用來(lái)計(jì)計(jì)算CUTOFF值及有效性性判斷標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，只能在在同批號(hào)號(hào)試劑內(nèi)內(nèi)使用，

15、不能作為為質(zhì)控指指標(biāo)，質(zhì)控必須須是可以以監(jiān)控到到不同批批號(hào)試劑劑間的變變化的外對(duì)照。質(zhì)控物的的選擇陰性質(zhì)控控品：特定項(xiàng)項(xiàng)目人陰陰性血清清混合物物（若為為ELISA質(zhì)質(zhì)控品濃濃度宜0.5倍倍臨界值值左右）陽(yáng)性質(zhì)控控品：特定項(xiàng)項(xiàng)目人陽(yáng)陽(yáng)性血清清混合物物ANA1:1000anti-dsDNA1:100或以以上anti-ENA中中強(qiáng)度陽(yáng)陽(yáng)性：若若組合式式檢測(cè)，至少有有2個(gè)項(xiàng)項(xiàng)目為陽(yáng)陽(yáng)性質(zhì)控物的的選擇弱陽(yáng)性質(zhì)質(zhì)控品：ELISA：臨臨界值24倍倍的樣本本IIF:比臨界界值高1個(gè)滴度度。特定定項(xiàng)目人人陽(yáng)性血血清或陰陰陽(yáng)性血血清混合合物。ANA：1：1001:320 ，ANA熒熒光模型型：均質(zhì)質(zhì)型，顆顆粒型，

16、核仁型型，或胞胞漿型等等（可以以每6個(gè)個(gè)月變換換，存儲(chǔ)儲(chǔ)質(zhì)控品品至少有有2個(gè)模模型）anti-dsDNA：1:101:32anti-ENA：低低度陽(yáng)性性或臨界值24倍倍的樣本本（若組合合式檢測(cè)測(cè)，至少少有2個(gè)個(gè)項(xiàng)目為為弱陽(yáng)性性）質(zhì)控物的的選擇1 收集集陽(yáng)性血血清(無(wú)無(wú)明顯溶溶血、黃黃疸、脂脂血及污污染血清清)到一一定量（至少夠夠本室使使用6個(gè)個(gè)月以上上）；2 傳染染性病原原體需經(jīng)經(jīng)56、10小時(shí)滅滅活后使使用；3 0.2m生物濾濾膜過(guò)濾濾，去除除纖維沉沉淀物和和細(xì)菌；4 稀釋釋：用正正常人血血清稀釋釋；5 定值值：與定定值參考考品進(jìn)行行對(duì)比、求值，無(wú)參考考品時(shí)選選擇在2-4倍CutOff值值附

17、近的陽(yáng)陽(yáng)性值；6 分裝裝小瓶（每日用用量），加蓋、貼簽，-20凍存存?zhèn)溆茫? 穩(wěn)定定性及瓶瓶間差評(píng)評(píng)價(jià)。自制質(zhì)控控品不同保存存條件下下：2-8：CV值值（滴度度符合率率）、累累計(jì)CV值（符符合率），穩(wěn)定定期-70：CV值、累計(jì)CV值，穩(wěn)定期期室溫：CV值值、累計(jì)計(jì)CV值值，穩(wěn)定定期1）均一一性評(píng)估估：同批批號(hào)質(zhì)控控品隨機(jī)機(jī)抽取5支（瓶），80%符合為合合格。2）穩(wěn)定定性評(píng)估估：評(píng)估估1周，1月，3月，6月，1年。有效期期一般可可標(biāo)定為為1年。質(zhì)控品穩(wěn)穩(wěn)定性的的評(píng)價(jià)純定性試試驗(yàn)：如免疫印印跡、免免疫金標(biāo)標(biāo)等，除除膜條本本身的內(nèi)內(nèi)對(duì)照外外：每檢測(cè)日日或分析析批，應(yīng)應(yīng)使用弱弱陽(yáng)性和和陰性質(zhì)質(zhì)控品兩兩

18、個(gè)水平平進(jìn)行質(zhì)質(zhì)控。質(zhì)控判定定規(guī)則陰性質(zhì)控控品的檢檢測(cè)結(jié)果果為陰性性弱陽(yáng)性質(zhì)質(zhì)控品的的檢測(cè)結(jié)結(jié)果為弱弱陽(yáng)性純定性試試驗(yàn)的質(zhì)質(zhì)控要求求如：抗ENA抗抗體譜檢檢測(cè)以滴度或或稀釋度度判定的的試驗(yàn)：如間接接免疫熒熒光法、凝集試試驗(yàn)等。每檢測(cè)日日或分析析批，應(yīng)應(yīng)使用弱弱陽(yáng)性和和陰性質(zhì)質(zhì)控品兩兩個(gè)水平平進(jìn)行質(zhì)質(zhì)控。質(zhì)控判定定規(guī)則：陰性質(zhì)控控結(jié)果為為陰性弱陽(yáng)性質(zhì)質(zhì)控結(jié)果果在靶值上下下一個(gè)滴滴度或稀稀釋度純定性試試驗(yàn)的質(zhì)質(zhì)控要求求如：ANA、ANCA等用數(shù)值判判定結(jié)果果的試驗(yàn)驗(yàn)：如ELISA等。濃度：弱弱陽(yáng)性質(zhì)質(zhì)控品濃濃度宜在在24倍臨界界值左右右，陰性性質(zhì)控品品濃度宜宜0.5倍臨界界值左右右（兩個(gè)個(gè)水平）。頻次：ELISA應(yīng)每每板做質(zhì)質(zhì)控。質(zhì)控判定定規(guī)則：至少利利用其多多規(guī)則中中一個(gè)偶偶然誤差差及一個(gè)個(gè)系統(tǒng)誤誤差規(guī)則則。12s警告，13s和22s失控。數(shù)值化定定性試驗(yàn)驗(yàn)的質(zhì)控控要求發(fā)現(xiàn)問(wèn)題題分析問(wèn)題題產(chǎn)生的的原因采取糾正正措施加加以改進(jìn)進(jìn)，進(jìn)而而預(yù)防驗(yàn)證和追追蹤避免同樣樣的問(wèn)題題出現(xiàn)第第二次！失控原因因分析及及處理陽(yáng)性質(zhì)控控品失控的常常見(jiàn)原因因:加加樣不準(zhǔn)準(zhǔn)、溫育育時(shí)間不不穩(wěn)定、偶然誤誤差。陰性質(zhì)控控品的常見(jiàn)失失控原因因：污染染、洗板板不干凈凈