修飾標(biāo)記引物的介紹課件

1、 修飾引物的介紹 修飾引物的介紹儲存條件凍干引物和稀釋成儲液的引物建議儲存在-20C.HEX,、TET和FAM對光敏感。應(yīng)儲存在黑暗處或用琥珀色管子儲存。推薦放入黑色盒子中。染料 暴露在光下半衰期(大約)HEX 4.5 hoursTET 2.25 hoursFAM 1.125 hoursHEX和TET標(biāo)記的寡核苷酸在PCR 30個循環(huán)內(nèi)都是穩(wěn)定的；但是在不利的環(huán)境中（高PH，高溫），TET比HEX穩(wěn)定。儲存條件凍干引物和稀釋成儲液的引物建議儲存在-20C.稀釋方法對于非Cy類的熒光標(biāo)記引物，建議用TE稀釋，濃度高于10uM。Cy3和Cy5標(biāo)記的引物在堿性條件下易降解，用中性溶液溶解。稀釋方法對

2、于非Cy類的熒光標(biāo)記引物，建議用TE稀釋，濃度高于穩(wěn)定性凍干的引物在-20C能夠穩(wěn)定一年。在4度能夠穩(wěn)定幾個月。儲液在-20C能夠穩(wěn)定至少六個月，在4度能夠穩(wěn)定幾個星期。AP偶聯(lián)引物- 放在AP儲存液中運(yùn)輸，儲存在4度，能夠穩(wěn)定12個月。HRP偶聯(lián)引物-放在HRP儲存液中運(yùn)輸，儲存在4度，能夠穩(wěn)定12個月。穩(wěn)定性凍干的引物在-20C能夠穩(wěn)定一年。在4度能夠穩(wěn)定幾修飾對OD值的影響有些熒光基團(tuán)在260 nm處也有吸收光: 這些修飾包括： FAM, Fluorescein, HEX, TAMRA, and TET。其它在260 nm處可能也有吸收值，但是數(shù)據(jù)沒有公布，因此計(jì)算時不包括在里面。AP

3、and HRP偶聯(lián)的寡核苷酸: 蛋白和核苷酸都有OD值，但是可能不會影響寡核苷酸的真實(shí)OD值。修飾對OD值的影響有些熒光基團(tuán)在260 nm處也有吸收光:合成規(guī)模和純化方式Mod Synth Purification Purification Purification Purification Scale Desalted Cartridge HPLC Gel Purified 5 Biotin 5 Phosphate 5 Primary Amine 25 N Yes (10-50 bases) NO NO NO 50 N Yes (10-50 bases) NO NO NO 200 N Yes

4、 (10-50 bases) NO Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 1 U Yes (10-50 bases) NO Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 25 U Yes (10-50 bases) NO Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 5 Rhodamine 25 N NO NO NO NO 50 N Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 200 N Yes (5-100 bases

5、) Yes (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 1 U Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 25 U Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 5 HEX/ TET/FAM 5 Fluorescein 5 GATEWAY 25 N Yes (10-50 bases) NO NO NO 50 N Yes (5-100 bases) Yes

6、 (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 200 N NO NO Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 1 U Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 25 U Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) AP Conjugate HRP Conjugate* 25 N NO NO NO NO 50 N NO NO

7、 NO NO 200 N NO NO NO NO 1 U NO NO Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) 25 U NO NO Yes (7 60 bases) Yes (7-100 bases) Phosphorothioates 25 N NO NO NO NO 50 N Yes (5-100 bases) Yes 7 60 bases) YES (7 60 bases) YES (7-100 bases) 200 N Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) YES (7 60 bases) YES (7-100 bases)

8、 1 U Yes (5-100 bases) Yes (7 60 bases) YES (7 60 bases) YES (7-100 bases) 25 U Yes NO YES (7 60 bases) YES (7-100 bases) 合成規(guī)模是25nnol時，合成的寡核苷酸不能小于10bp。問題：此表和網(wǎng)站上的不一致，是不是現(xiàn)在在中國不論合成規(guī)模大小，都能合成小于10bp的寡核苷酸呢？合成規(guī)模和純化方式Mod Synth Purificatio生物素 生物素修飾能夠耐受熱和pH（它能被加熱到100度并暴露在pH2-10）。其它極端的環(huán)境可能也能耐受，但是還沒有被檢測。還原劑可能不會影

9、響生物素修飾，但是沒有精確的數(shù)據(jù)。生物素寡核苷酸通過OD260進(jìn)行定量（生物素在260沒有吸收光）。 生物素化的DNA能夠成功的轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌，如DH5 alpha。 5-生物素沒有相鄰烴基，所以它比3-生物素穩(wěn)定。 3-生物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以預(yù)測3-Biotin可能會在兩種情況下脫離或降解：1過期，2寡核苷酸暴露在堿性環(huán)境中如溶解在堿性緩沖液中。原因是3-Biotin有類似于RNA結(jié)構(gòu)的相鄰的烴基。5生物素3生物素生物素 生物素修飾能夠耐受熱和pH（它能被加熱到100度并暴 穩(wěn)定性依次是：3-NH23-PO43-BIO。 3生物素修飾的引物長度不能大于99個核苷酸。因?yàn)?生物素是以CPG修飾的形

10、式提供的（連接到固體支持物上），這個體系把3生物素連接到序列的最后一個核苷酸上。 生物素dT：生物素dT是dT堿基上連有生物素，所以只有在5堿基是T時才能用生物素dT。生物素 穩(wěn)定性依次是：3-NH23-PO43-BIO。問題：生物素dT的分子式？5和3生物素修飾的合成過程（合成后、合成前）？通過什么連接鍵連接到寡核苷酸上？連接到寡核苷酸的什么位置（戊糖、堿基）？最終連接到寡核酸上的形式生物素問題：生物素羅丹明羅丹明溶解在水或TE中的顏色為粉紅色，略成紫色。?羅丹明修飾不受合成規(guī)模的限制，它是合成后修飾。需要額外的純化。?注：這個數(shù)據(jù)時染料溶解在甲醇中測定得到的。溶解在水或TE中以及與寡核苷酸

11、連接后的值是會變化的。羅丹明羅丹明溶解在水或TE中的顏色為粉紅色，略成紫色。?注羅丹明問題：現(xiàn)在中國地區(qū)能合成的羅丹明修飾有：5Rhodamine Green 、5Rhodamine Red 、5Rhodamine Red 、3Rhodamine Red 。Rhodamine Red 、Rhodamine Green溶解在水中或TE中的顏色？5和3修飾時Rhodamine Green 、Rhodamine Red的分子結(jié)構(gòu)式？5和3修飾的方法：連接到戊糖還是堿基上？通過什么化學(xué)鍵連接？都是合成后修飾嗎？合成后修飾：引物從固體介質(zhì)上解離之后經(jīng)過純化再進(jìn)行修飾的？還是引物合成之后在固體介質(zhì)上直接進(jìn)

12、行修飾？修飾之前需要純化嗎？修飾之后需要純化嗎？最終連接到寡核酸上的形式羅丹明問題：5 HEX, TET or 6-FAMHEX is 4,7,2457 hexachlorofluoresceinTET is 274,7, tetrachlorofluoresceinFAM is 6-carboxyfluorescein FAM, HEX and TET是在合成循環(huán)結(jié)束時以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學(xué)作用添加上的，因此是添加到引物的5末端的糖上而非引物的末端堿基。它們通過磷酸二酯鍵共價連接到5端最末的糖環(huán)上。 在液體中的顏色：HEX是粉紅色，F(xiàn)AM是黃色，TET是橙色 經(jīng)過這些修飾的寡核苷

13、酸不能進(jìn)行硫代磷酸化修飾。5 HEX, TET or 6-FAMHEX is 4,7HEX, TET or 6-FAM注：摩爾消光系數(shù)是在最大nm處的激發(fā)光下測得的。因?yàn)閜H或成分的微小變化可能會影響以上的數(shù)據(jù)， 染料的顏色取決于ABI儀器上的“濾光片設(shè)備”：Dyes Filter A Filter BHEX Green (560nm) Yellow (560nm)6-FAM Blue (531nm) Blue (531nm)TET - Green (545)HEX, TET or 6-FAM注：摩爾消光系數(shù)是在最大n問題:3 HEX, TET or 6-FAM修飾的結(jié)構(gòu)式？3HEX, TET

14、 or 6-FAM修飾時是連接到戊糖還是堿基上？連接鍵是什么？3HEX, TET or 6-FAM是合成后修飾嗎？3HEX, TET or 6-FAM能否進(jìn)行硫代磷酸化修飾？5和3 修飾的區(qū)別，如穩(wěn)定性等 ？最終連接到寡核酸上的形式HEX, TET or 6-FAM問題:HEX, TET or 6-FAM磷酸化5磷酸化作用是通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引 物5端的糖環(huán)上，而不是最后一個堿基上。？3磷酸鹽被連接到固體支持介質(zhì)上，所以在合成的第一個循環(huán)，堿基就與它偶聯(lián)。它能夠阻止聚合酶的延伸。穩(wěn)定性：假設(shè)是DNA：3-PO4比3-BIO穩(wěn)定。3-BIO在堿性環(huán)境下會脫落，而3-PO4不會。用膠純化

15、磷酸化引物時，不能區(qū)分全長引物和n-1引物，因?yàn)榱姿峄鶊F(tuán)帶陰性電荷，會影響電泳。有些經(jīng)HPLC純化后的磷酸化寡核苷酸在真空離心蒸發(fā)濃縮后有些“臟”，或微黃。這可能是因?yàn)樵摦a(chǎn)物為綜合產(chǎn)物。在做QC時，通過乙醇沉淀可以去除。磷酸化5磷酸化作用是通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引問題：3磷酸化的結(jié)構(gòu)式？連接鍵是什么？5磷酸化和3磷酸化的穩(wěn)定性差異？5修飾的連接鍵？最終連接到寡核苷酸上的形式？磷酸化問題：磷酸化Aminolinker5Aminolinker(C6)是在合成循環(huán)的最后一步以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5糖環(huán)上的，而不是添加到最后一個堿基上。5氨基標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)效率是95%,氨基

16、基團(tuán)在260nm處是沒有吸光值的；它在210nm處有吸光值。不能通過電泳檢測它的存在（瓊脂糖或丙烯酰胺）。3Aminolinker(C7)只與一些5修飾兼容，如FAM, HEX, TET, Fluorescein, Biotin, Amine, and phosphate。其它的5修飾(如Alexa dyes)需要氨基才能與寡核苷酸相連，這就無法避免該染料與3氨基相連。阻止連接或聚合酶延伸的一般想法是末端雙脫氧法，但是這種方法昂貴或者不可用。因?yàn)橹灰鶕?jù)應(yīng)用去除3或者5，所以只需用3或5氨基修飾即可滿足需要。另外氨基修飾是最簡單最便宜的方法。任意一種氨基修飾都可以。5末端C6類型效果很好。用化

17、學(xué)交聯(lián)劑可以把雙鏈DNA與肽連接。可以嘗試用5伯胺修飾的DNA與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。Aminolinker5Aminolinker(C6)是在問題：5Aminolinker(C12) 、5Aminolinker(C6) 、3Aminolinker(C7) 、dT C6-Aminolinker 、 3Amino /Amine的分子式？3Aminolinker(C7)、 3Amino /Amine的修飾過程？連接在核苷酸的什么位置？dT C6-Aminolinker的修飾過程？是不是只能在5端用這種修飾？這幾種氨基修飾的區(qū)別？Aminolinker問題：AminolinkerAlexa 它們都是通過C

18、6連接臂與寡核苷酸連接的。3端通過氨基把Alexa連接到引物的3端。Alexa fluor染料是在合成后添加到寡核苷酸鏈上的。？Alexa 它們都是通過C6連接臂與寡核苷酸連接的。問題：5和3 Alexa Fluor的結(jié)構(gòu)式？5和3 Alexa Fluor通過什么鍵和寡核苷酸連接？連接到戊糖還是堿基上？5和3 Alexa Fluor合成過程：合成前修飾還是合成后修飾？5和3 Alexa Fluor的區(qū)別？Alexa Fluor問題：Alexa Fluor Texas Red-X修飾基團(tuán)是怎樣被添加到寡核苷酸上的？首先在DNA的5末端的磷酸基團(tuán)上加一個氨基，然后在氨基上連接一個帶有羧基的基團(tuán)。

19、5-COOH-NH2-PO3-DNA問題：5Texas Red-X、 3Texas Red-X 的結(jié)構(gòu)式？合成過程？合成前修飾還是合成后修飾？5Texas Red-X、 3Texas Red-X通過什么鍵和寡核苷酸連接？連接到戊糖還是堿基上？水溶液的顏色？5Texas Red-X、 3Texas Red-X的區(qū)別 Texas Red-X修飾基團(tuán)是怎樣被添加到寡核苷酸上的？Phospothioate(S-oligos) S-oligos 是寡核苷酸中的單核苷酸之間的磷酸二酯鍵中的一個氧被硫代替后形成的。這種修飾是在連接的時候進(jìn)行的（不是在合成后進(jìn)行的）。堿基被添加上后，再進(jìn)行連接修飾。在兩個堿基

20、之間的磷酸可以轉(zhuǎn)換成雙鍵“S”（用Beaucage試劑）代替普通的雙鍵“O”（用碘溶液）。最終合成的寡核苷酸不是立體結(jié)構(gòu)單一的形式，它們是R和S立體異構(gòu)體的混合物。 和磷酸二酯鍵相連的堿基都可以進(jìn)行這種修飾。因?yàn)閺墓腆w支持物上解離下來時，3末端堿基是OH，不能進(jìn)行硫代磷酸化。 我們可以提供對S-oligo進(jìn)行5修飾，如客戶可以定制S-oligo的熒光素標(biāo)記。我們不能提供在保存其它堿基“正?！钡那闆r下使某些位置的堿基硫代磷酸化。這是由于法定原因而不是化學(xué)合成的問題。S-oligo和普通的寡核苷酸在膠上的位置是一樣的。用HPLC純化方法純化硫代磷酸化修飾的寡核苷酸時，帶形雙峰或者帶形很寬。Phos

21、pothioate(S-oligos) S-oligPhospothioate(S-oligos)Phospothioate的特性：化學(xué)穩(wěn)定、在水溶液中穩(wěn)定、能夠抵抗核酸酶應(yīng)用：磷酸硫代的反義引物在體內(nèi)通過很多不同的機(jī)制起作用。它們可以通過RNA水平抑制逆轉(zhuǎn)錄活性（抑制RNA病毒復(fù)制）。形成激活RNase H活性的底物S-ODNs和RNA形成雙鏈，使RNA更容易被RNase H切斷。反義寡核苷酸還能夠直接干擾轉(zhuǎn)錄或抑制翻譯。存在于胞內(nèi)和血液/培養(yǎng)基中的核酸酶對S-Oligos的影響不大。因?yàn)镾-ODNs保持了寡核苷酸的帶電狀態(tài)，它們能夠通過和陽離子脂類形成復(fù)合體而進(jìn)入細(xì)胞。它們也存在轉(zhuǎn)染率低的

22、問題。反義引物在mRNA中的作用位點(diǎn)不同時，反義引物起的作用也不同（如寡核苷酸和mRNA上的轉(zhuǎn)錄起始密碼子互補(bǔ)，敲降效果就很好）。 Phospothioate(S-oligos)PhospotPhospothioate(S-oligos)反義S-ODNS的概述/設(shè)計(jì)建議:典型的大小范圍：14-30 mers. (很多文獻(xiàn)是用20 mers的S-ODNs。質(zhì)量范圍是5000-11000。濃度范圍（在培養(yǎng)基中）: 15-25 uM (如果濃度大于這個范圍會引起S-ODNS的非特異性毒性)。脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時的濃度范圍：0.1-5 uM。(寡核苷酸的最適濃度應(yīng)該由每個細(xì)胞系和每個靶點(diǎn)分子決定)微注射時

23、S-ODN的量: 0.03-1 ug/ul 體內(nèi)注射時S-ODN的量: 0.05-1 mg S-ODN/Kg體重。磷酸硫代的鍵的數(shù)量：通常很多文獻(xiàn)用的是每個堿基都做磷酸硫代連接。推薦的純化方式:脫鹽或HPLC或多重HPLC (反相和陰離子交換HPLC)。很多參考資料用HPLC純化引物用于反義引物的研究。有一個參考文獻(xiàn)比較了HPLC和脫鹽純化的寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)沒有區(qū)別。Phospothioate(S-oligos)反義S-ODN問題：Phosphorthioate (A/C/G/T) Phospothioate(S-oligos)問題：Phospothioate(S-oligos)5Aldehyd

24、e5醛修飾用的化學(xué)試劑屬于芳香族。它包含苯環(huán)。分子量是245。問題：合成過程？合成前修飾還是合成后修飾？連接在寡核苷酸的什么基團(tuán)上？連接鍵是什么？5Aldehyde5醛修飾用的化學(xué)試劑屬于芳香族。它包含5Acrydite 5-Acryl 修飾的寡核苷酸能夠使寡核苷酸和聚丙烯凝膠發(fā)生共聚反應(yīng)。這個膠有一個或多個區(qū)域含有能夠和特異序列互補(bǔ)的寡核苷酸。當(dāng)含有互補(bǔ)序列的片段經(jīng)過這些區(qū)域時，就會被捕獲。這種修飾的寡核苷酸應(yīng)用在突變檢測、克隆篩選、樣品制備和濃縮以及診斷。問題：5Acrydite分子結(jié)構(gòu)？5Acrydite合成過程？連接在寡核苷酸的什么基團(tuán)上？連接鍵是什么？5Acrydite 5-Acryl 修飾的寡核苷5-Thio-MODifier C6 S-S 巰基修飾的結(jié)構(gòu)是：: HO-C6-S-S-C6-PO3-oligo在用之前要用DTT使二巰基斷裂，然后脫鹽之后在進(jìn)行連接。把寡核苷酸溶解