微生物分子生態(tài)報告課件

1、微生物分子生態(tài)學(xué)的部分研究方法報告 分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)的原理和方法來研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的生態(tài)機(jī)理及其分子機(jī)制的科學(xué)。它是生態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相互滲透的形成的一門新興交叉學(xué)科，其研究內(nèi)容包括種群在分子水平的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，生物器官變異的分子機(jī)制，生物體內(nèi)有機(jī)大分子對環(huán)境因子變化的響應(yīng)，生物大分子結(jié)構(gòu)、功能演變與環(huán)境長期變化的關(guān)系以及其他生命層次生態(tài)現(xiàn)象的分子機(jī)理等。 微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是微生物生態(tài)學(xué) 研究的熱點(diǎn)內(nèi)容群落結(jié)構(gòu)決定了生態(tài)功能的特性和強(qiáng)弱。群落結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。群落結(jié)構(gòu)變化是標(biāo)記環(huán)境變化的重要方面。通過對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解

2、析并研究其動態(tài)變化，可以為調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠的依據(jù)。 20世紀(jì)70年代以前：傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，依靠形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較進(jìn)行分類鑒定和計數(shù)，認(rèn)識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法：在70和80年代：對微生物化學(xué)成分的分析，建立了一些微生物分類和定量的方法（生物標(biāo)記物方法），對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的認(rèn)識進(jìn)入到較客觀的層次上。在80和90年代：現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以DNA為目標(biāo)物，通過rRNA基因測序技術(shù)和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，并給出了關(guān)于群落結(jié)構(gòu)的直觀信息?？梢詸z測環(huán)境中

3、的活細(xì)胞，并且對微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展起了很重要的作用。采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少 （不到1 % ）。Amann 等人報道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從0.001%（海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時。1、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法2、群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關(guān)的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標(biāo)記分子之一。由Garlan和Mills于1

4、991年提出的群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)，通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源的利用能力，來確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對基質(zhì)利用的生理代謝指紋。 3、生物標(biāo)記物法（Biomakers ）生物標(biāo)記物通常是微生物細(xì)胞的生化組成成分，其總量通常與相應(yīng)生物量呈正相關(guān)。 特定的標(biāo)記物標(biāo)志著特定的微生物，一些生物標(biāo)記物的組成模式(種類、數(shù)量和相對比例)可作為指紋估價微生物群落結(jié)構(gòu)。 首先使用一種合適的提取劑直接把生物標(biāo)記物從環(huán)境中提取出來，然后對提取物進(jìn)行純化，后用合適的儀器加以定量測定。優(yōu)點(diǎn)：不需要

5、把微生物的細(xì)胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于培養(yǎng)而導(dǎo)致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的5%。在細(xì)胞死亡時，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細(xì)胞中存在，十分適合于微生物群落的動態(tài)監(jiān)測。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。甲基脂肪酸酯是細(xì)胞膜磷脂水解產(chǎn)物，氣相色譜分析系統(tǒng)分析出全細(xì)胞的FAME譜圖。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來

6、，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。 PLFA方法適合跟蹤研究微生物群落的動態(tài)變化,能夠快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂肪酸,但是也有其局限性。 第一,他不能從種的水品上鑒定微生物,只能鑒定到屬; 第二,這種方法強(qiáng)烈的依賴于標(biāo)記脂肪酸,標(biāo)記脂肪酸變化導(dǎo)致錯誤的群落變化估計,因此操作過程需要十分謹(jǐn)慎,防止人為因素的干擾。 第三,細(xì)菌和真菌在不同的生長時期以及環(huán)境壓力下的脂肪酸含量有所變化,給監(jiān)測帶來困難。 另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重疊，外來生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對種群結(jié)構(gòu)解析的可靠性。4. ERIC (腸桿菌基因間保守重復(fù)序列) -PCR指紋圖譜技術(shù)在微生物群落中，各細(xì)菌

7、數(shù)量占1-10%時，其特征性ERIC-PCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來。ERIC-PCR指紋圖中，每一條帶可以是來自若干種不同微生物的基因組DNA片段，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個群落在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化。ARDRA分型與測序變性梯度凝膠電泳（DGGE）變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世紀(jì)80 年代初期發(fā)明的，起初主要用

8、來檢測DNA 片段中的點(diǎn)突變。Muyzer 等人在1993 年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究 。后來又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一 。原理雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑

9、（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來。一個特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個幾百個堿基對的DNA 片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。顯示的是一個234bp 長的DNA 片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DNA 片段的序列，依次從第一個堿基到第234 個堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA 片段共有3 個解鏈區(qū)域。MD1 是解鏈溫度最低的一個解鏈區(qū)域，MD3 是溫度最高的一

10、個解鏈區(qū)域。不同的雙鏈DNA 片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。一旦DNA 片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，不同的DNA 片段會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。然而，當(dāng)變性劑濃度達(dá)到DNA 片段最高的解鏈區(qū)域溫度時，DNA 片段會完全解鏈，此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段

11、就不能被區(qū)分開來。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個堿基對）可以解決這個問題。含有GC 夾子的DNA 片段解鏈溫度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC 夾子后，DNA 片段中每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。當(dāng)用DGGE/TGGE 技術(shù)來研究微生物群落結(jié)構(gòu)時，要結(jié)合PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增技術(shù)，用PCR 擴(kuò)增的16S rDNA 產(chǎn)物來反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。通常根據(jù)16S rRNA 基因中比較保守的堿基序列設(shè)計通用引物，其中一個引物的5-端含有一段GC 夾子，用來擴(kuò)增微生物群落基

12、因組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE 分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片斷，所以一般選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。40%60%DenaturantCABCBADenaturing Gradient Gel ElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fgc16S rDNA 環(huán)境樣品的核酸提取在土壤微生物生態(tài)中非常重要。最初采用的方法主要是劇烈的機(jī)械打碎以及超聲波破碎細(xì)胞。但是這種方法得到的DNA片斷一般在5K10K大小,不適合作微生物的群落分析。微生物細(xì)胞與環(huán)境中的土壤顆粒、粘土以及有機(jī)物接合緊密,這對高效

13、率提取核酸造成了很大的困難。同時,腐植酸對DNA的檢測和定量也有很大的影響,主要表現(xiàn)在抑制DNA高溫聚合酶的活性,干擾限制酶的位點(diǎn)識別,降低轉(zhuǎn)化效率以及DNA雜交的特異性。Jizhong Zhou等人研究了各種提取方法,他們將土壤樣品DNA提取分為細(xì)胞裂解粗提DNA和純化兩個步驟,并將幾種方法進(jìn)行比較,建立了一種對大多數(shù)土壤樣品簡單、快速、高效的基于SDS的提取方法。很多實(shí)驗(yàn)表明,現(xiàn)在能夠從土壤樣品中提取出超過90%的rDNA基于PCR技術(shù)的方法也存在著不足:環(huán)境樣品在提取核酸前的厭氧或室溫存放不可避免的導(dǎo)致其樣品中微生物的變化,冷凍可以減緩變化,但是不能存放時間過長,真菌在04攝氏度仍可以觀

14、察到明顯的生長現(xiàn)象。每次提取DNA的效率不同,造成結(jié)果重復(fù)性差。某些原核生物細(xì)胞比其他細(xì)胞容易裂解,引起裂解程度不均一,使得不易裂解的細(xì)胞的豐度估計過低。引物對不同樣品的擴(kuò)增效率不同,引起豐度估計偏差。理論上,對真核生物的分析應(yīng)該象原核生物一樣進(jìn)行,但是由于真核生物的核糖體的編碼基因以及調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜,對其的研究還不夠透徹,現(xiàn)今應(yīng)用在真核微生物生態(tài)學(xué)的分析上還是比較少?；?PCR技術(shù)的幾種主要方法 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法(RAPD) 限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP) 變性梯度凝膠電泳與溫度梯度凝膠電泳技術(shù) 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 PCR技術(shù)(SSCD)限制性片斷

15、長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP) DNA限制性內(nèi)切酶具有識別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能，DNA 分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識別序列，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DNA 片段切斷，電泳檢測時，存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段變成短片段；不存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段長度將不發(fā)生變化。 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法(RAPD) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD）亦稱隨機(jī)引物PCR（Arbitrarily Prim

16、ed PCR, AP-PCR），是Willam和Welsh于1990年建立的基因分型方法。該方法是建立在PCR基礎(chǔ)上的新的檢測基因組多態(tài)性的基因分型技術(shù)，它利用采用隨機(jī)選擇的單條或多條8-12mer引物經(jīng)PCR擴(kuò)增基因組DNA片段，然后通過凝膠電泳分析其DNA指紋圖譜，其結(jié)果既表現(xiàn)種系發(fā)育過程的相互聯(lián)系，也反映了不同克隆之間存在的差異，從而可鑒定不同菌株在基因水平上的差異。變性梯度凝膠電泳與溫度梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE/TGGE） 雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能

17、被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP) AFLP 是 RFLP 與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA 產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板 DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加 13個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。單鏈

18、構(gòu)象多態(tài)性 PCR技術(shù)(SSCD) 單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開.稱該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。在隨后的研究中，科學(xué)家又 將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術(shù)，進(jìn)一步提高了 檢

19、測突變方法的簡便性和靈敏性. 基本過程是: PCR擴(kuò)增靶DNA; 將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子; 將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳; 最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果. 若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.末端限制性片段長度多態(tài)性 末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)的擴(kuò)展,它集RFLP、PC

20、R和核酸電泳技術(shù)于一體9210。該方法依據(jù)微生物的比較基因組學(xué)信息,選取一段具有系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記特征的DNA序列為目的分析序列,并據(jù)此設(shè)計出理想引物,用熒光物質(zhì)標(biāo)記出1個或2個引物的5端(2個引物同時標(biāo)記時,要用不同的熒光物質(zhì)標(biāo)記)。常用的熒光物質(zhì)有四氯熒光素TET (52tetrachloro fluorescein) 11、綠色的六氯熒光素HEX (52hexachloro 2fluorescein)9以及藍(lán)色的六羧基熒光素62FAM 等。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用四堿基限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化,熒光標(biāo)記末端片段可被測序儀識別,得到不同的末端片段峰,每一個峰就可至少代表一種類型的微生物,通常用系統(tǒng)分類操

21、作單元(OTU)來表示。故根據(jù)片段峰的大小和數(shù)量可以檢測和分析環(huán)境樣品中微生物的末端限制性片段圖譜,進(jìn)而可分析出微生物群體的組成和動態(tài)變化等生態(tài)信息新一代測序技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀 高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencin）高通量測序技術(shù)堪稱測序技術(shù)發(fā)展歷程的一個里程碑，該技術(shù)可以對數(shù)百萬個 DNA 分子進(jìn)行同時測序。這使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，因此也稱其為深度測序 ( deep sequencing) 或 下一代測序技術(shù)( next generation sequencing， NGS)2005 年，454 Life Sciences 公司(

22、 現(xiàn)已被 Roche 公司收購) 首先推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)， 開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河。該技術(shù)的原理是酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng): 首先將 PCR 擴(kuò)增的單鏈 DNA 與引物雜交， 并與 DNA 聚合酶、 ATP 硫酸化酶、 熒光素酶、 三磷酸腺苷雙磷酸酶、 底物熒光素酶和 5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一輪測序反應(yīng)中只加入一種 dNTP，若該 dNTP 與模板配對， 聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為 ATP， ATP 就會促使氧合熒光素的合成并釋放可見光。CCD 檢測后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個峰值， 峰值與反應(yīng)中摻入的核苷

23、酸數(shù)目成正比 。高通量測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 高通量測序技術(shù)有三大優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng) Sanger測序法所不具備的第一，它利用芯片進(jìn)行測序， 可以在數(shù)百萬個點(diǎn)上同時閱讀測序。第二，高通量測序技術(shù)有完美的定量功能， 這是因?yàn)闃悠分心撤N DNA 被測序的次數(shù)反映了樣品中這種 DNA的豐度。第三，成本低廉。參考文獻(xiàn)Mardis E R Next-generation DNA sequencing methods Annu Rev Genomics Hum Genet， 2008， 9: 387-402Sultan M， Schulz M H， Richard H， et al A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome Science，