弧菌和氣單胞菌的檢驗

1、弧菌和氣單胞菌的檢驗一、弧菌屬（Vibrio pacini, 1854）1、菌體大小與形態(tài):G-，菌體短小，直或彎桿菌（0.5-0.8m 1.4-2.6m），以1根或幾根極生鞭毛運動，無莢膜，無芽孢。2、培養(yǎng)特性與代謝特征:多數(shù)在普通培養(yǎng)基上生長良好；兼性厭氧，具呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型。所有的種可在25生長，多數(shù)在30生長。pH值6.0-9.0。Na+刺激所有種生長，并且為多數(shù)種所必需。氧化酶陽性。不產色或產黃色?？纱xD-葡萄糖和其他碳水化合物，產酸不產氣。還原硝酸鹽(產氣弧菌、梅氏弧菌和病海魚弧菌除外)。多數(shù)種發(fā)酵麥芽糖、甘露糖和海藻糖。多數(shù)對弧菌抑制劑O/129敏感。生態(tài)特性:發(fā)現(xiàn)于各種

2、鹽度的水生生境，最常見于海、海岸、海面和海生動物的消化道，有的在淡水中也有發(fā)現(xiàn)。有的是人病原菌，有的對海洋脊椎和無脊椎動物致病。 最重要的人病原菌：霍亂弧菌（V.cholerea）可引起霍亂；副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）污染過的魚和貝類引起人食物中毒；創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）可引起高致死性的敗血癥。弧菌檢驗方法：（一）霍亂弧菌 (V. cholerae)分型：霍亂弧菌血清學分型生物學性狀：革蘭陰性 彎曲弧形或逗點狀，首尾相接魚群樣平行排列單端極鞭毛，有普通菌毛和性菌毛懸滴觀察：細菌運動，非常活潑，呈穿梭樣或流星狀。培養(yǎng)特性：霍亂弧菌檢驗方法：鑒別試驗;霍亂紅

3、試驗、粘絲試驗、O/129敏感試驗、雞紅細胞凝集試驗、多粘菌素B敏感試驗、噬菌體裂解試驗、耐鹽培養(yǎng)試驗霍亂紅試驗：粘絲試驗：、O/129敏感試驗雞紅細胞凝集試驗多粘菌素B敏感試驗噬菌體裂解試驗V-P試驗耐鹽試驗（二）副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）具嗜鹽性，為海產魚弧菌病的病原菌，一般在20-28引起魚發(fā)病。人類食用或接觸污染本菌的魚、器具類等引致食物中毒。1、形態(tài)特征培養(yǎng)特性：系革蘭陰性菌 呈弧狀、桿狀、絲狀等形態(tài)。菌體一端有單鞭毛、運動活潑、無莢膜、無芽孢2、培養(yǎng)特性兼性厭氧,菌落中等大小，培養(yǎng)24h時直徑約2mm。最適生長溫度是30-37，42仍可生長。生長pH 5.

4、6-9.6(8.0)。代時10-20 min，增殖速度是大腸桿菌和志賀氏菌的2倍。多數(shù)菌株對弧菌抑制劑O/129不敏感，是弧菌屬中少有的例外。生長繁殖時必須有鈉離子。在含2.5% NaCl培養(yǎng)基上生長良好，不含NaCl的培養(yǎng)基不能生長，具嗜鹽性。培養(yǎng)特征：綿羊血平板不溶血， TCBS瓊脂上的菌落發(fā)綠, 利用甘露醇。臨床意義：鑒定依據(jù)：致病性與毒力因子致病菌株多數(shù)能裂解人、兔等紅細胞，可用溶血反應區(qū)分致病與非致病株，稱為神奈川(Kanagawa)試驗。溶血性菌株：產生耐熱直接溶血素(Thermostable Direct Haemolysin, TDH)，屬穿孔毒素，為不含糖或脂的蛋白質，MW3

5、2-44kD，與霍亂弧菌非01群及擬態(tài)弧菌產生的TDH相似。在神奈川試驗陰性的菌株中，還發(fā)現(xiàn)一種不耐熱的毒素磷酸脂酶A2，是本菌的毒力因子。人食用本菌污染的海魚、貝類等常引致食物中毒，潛伏期2-36h，表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐及發(fā)熱，一般能很快康復。4、微生物學診斷取病變組織接種嗜鹽菌選擇培養(yǎng)基或SS平板。挑取可疑菌落進一步作生化試驗，神奈川試驗檢測其毒素，也可用PCR技術檢測毒素基因。由副溶血弧菌引起的對蝦紅腿病，可取病變組織50g，剪碎后加入50ml滅菌的氯化鈉慶大霉素增菌液，增菌18 h，在液面下無菌吸取3ml菌液放入滅菌的試管，120,30min后進行斑點ELISA法快速檢測，24 h內可

6、檢出結果。疾病較嚴重時不經(jīng)增菌也可檢出。與鰻弧菌、溶藻弧菌等無交叉反應。二、氣單胞菌屬 (Aeromonas, Kluyver and van Niel, 1936)氣單胞菌可分為運動性（motile）或嗜溫性（mesophilic）及非運動性或嗜冷性兩大類，前者以嗜水氣單菌為代表，包括溫和、豚鼠、凡隆、舒伯特、簡達及易損氣單胞菌等，其致病作用無明顯區(qū)別。臨床意義：氣單胞菌為水中常居菌 可引起哺乳動物（如人、鳥類等）和冷血動物（如鮭、魚、蛇等）的感染 在人類主要引起腸道內感染和腸道外感染氣單胞菌常引起5歲以下兒童和成人的腸道內感染，是夏季腹瀉的常見病原菌之一，其主要的致病物質為溶血毒素和細胞毒

7、素等。腸道外感染主要為皮膚和軟組織感染，與外傷后傷口接觸污染的水有關。2、形態(tài)及培養(yǎng)特性G-，從直桿菌到接近球狀。單個，成對或短鏈。通常以一根極生鞭毛運動（固體培養(yǎng)幼齡時具周生鞭毛）。兼性厭氧。具呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型。最適生長溫度22-28；多數(shù)種可在37生長，其它種最高生長溫度38-41，最低0-5，pH5.5-9.0。氣單胞菌形態(tài)特征：革蘭陰性短桿菌，有時呈球狀 絕大多數(shù)有極端單鞭 動力陽性兼性厭氧 營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上可以生長，形成灰白色、光滑、濕潤、凸起，2mm大小的菌落，在TCBS培養(yǎng)基上不生長。在0c-45c范圍內均可以生長，根據(jù)生長溫度的不同，可分為嗜冷菌（37c以上不

8、生長）和嗜溫菌（10c-42c之間生長）兩大類。嗜水和殺鮭氣單胞菌與霍亂弧菌一樣，存在所謂活的非可培養(yǎng)（viable but nonculturable ,VBNC）狀態(tài)，實際上是一種休眠狀態(tài)，其菌體縮小成球狀，耐低溫及不良環(huán)境，常規(guī)培養(yǎng)不生長。溫度回升且獲得生長所需的營養(yǎng)條件時，細菌回復到正常狀態(tài)，重新具有致病力。3、生化性狀對葡萄糖和其他糖類能產酸，常產氣。氧化酶和觸酶陽性。通常精氨酸水解酶陽性，鳥氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫氨酶陰性，尿酶陰性。明膠酶和DNA酶皆陽性。還原硝酸鹽。多數(shù)種能發(fā)酵的糖包括麥芽糖、D-半乳糖和海藻糖。對抗菌抑制劑2，4二氨基6，7異丙基喋啶（O/129）不敏感。種屬鑒

9、定：氧化酶陽性、觸酶陽性、硝酸鹽還原試驗陽性、發(fā)酵葡萄糖和其它碳水化合物產酸或產酸產氣。4、致病性及毒力因子具有毒力因子的菌株才有致病性。其毒力因子有3類：一是胞外產物，如毒素和蛋白酶；二是粘附素，如S蛋白、4型菌毛和外膜蛋白等；三是鐵載體。5、微生物學診斷血平板、麥康凱平板或TSA培養(yǎng)基等可直接分離氣單胞菌。從動物腹瀉糞便分離則需采用RS選擇培養(yǎng)基。分離菌為革蘭氏陰性，氧化酶和觸酶陽性。同時可憑O129等其它關鍵生化指標進行判定。分離株是否有致病性，則還需檢測胞外蛋白酶和溶血素等毒力因子，可用脫脂奶平板和血平板劃線培養(yǎng)，或用相應抗體建立的ELISA試劑盒檢測。6 、常見種類嗜水氣單胞菌（A.

10、hydrophila） 殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）（一）嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）1 形態(tài)與染色特性G-, 兩端鈍圓、直或略彎的短小桿菌，0.3-1.01.0-3.5 m，多數(shù)單個存在，少數(shù)雙個排列。通常菌體一端有單鞭毛，幼齡培養(yǎng)在菌體四周形成鞭毛，但對數(shù)生長期過后，該細胞又呈極生單鞭毛。無莢膜，不形成芽孢。2 培養(yǎng)特性(1) 兼性厭氧。在普通瓊脂、TSA、麥康凱瓊脂、SS瓊脂上生長良好，血平板溶血，TCBS或6% NaCl中不生長，對弧菌抑制劑O/129不敏感，一般不發(fā)酵乳糖。(2) 普通瓊脂平板菌落: 直徑2-3mm, 圓形、表面光滑、邊緣整齊、中央隆起、灰

11、白色、半透明。(3) 在溴化十六烷基三甲銨瓊脂上不生長。在TSA平板28培養(yǎng)18-24h，菌落呈淡黃褐色，無水溶性色素。(4) 最適生長溫度28，最高38-41，一些菌株可在5生長，pH 6-11(7.2-7.4)，鹽濃度0-4%(0.5%)。3 生化性狀水解淀粉和精氨酸、發(fā)酵甘露醇、赤蘚糖醇、棉子糖、果膠糖：+苯丙氨酸脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶、MR、V.P、氧化酶、觸酶試驗：+4 抵抗力水中常見菌，一般夏季較多、冬季減少。是魚腸道菌群之一。魚和動物分離株較環(huán)境分離株的蛋白質分解能力強。對熱抵抗力較差，60-65,30min-1h死亡。 對氯霉素、土霉素、氟苯尼考、鏈霉素、四環(huán)素、磺胺嘧啶，硝基呋

12、喃等具抗性的菌株被篩選。從這些菌株分離到相應可轉移抗藥性質粒。5 抗原性運動性氣單胞菌有O、H和K抗原運動性氣單胞菌與殺鮭氣單胞菌及其他屬細菌也存在共同抗原成分6 致病性與致病因子嗜水氣單胞菌對多種魚、兩棲類及爬蟲有致病性，可引起鰻鱺赤鰭病、紅點病、爛鰓??；鯉魚和金魚豎鱗?。祸桏~打印??；青魚和草魚腸炎；青魚癤瘡病；香魚紅口?。患佐~“紅脖子病”；蛙紅腿病；蛇敗血病和口炎。此外，還可導致魚類敗血癥。稱為運動性氣單胞菌敗血病。感染人類引致急性胃腸炎，是食品衛(wèi)生檢驗對象。本菌主要通過腸道感染，魚體受傷或寄生蟲感染時可經(jīng)皮膚和鰓感染，并與水溫、有機質含量，飼養(yǎng)密度等密切相關。水溫24-28死亡率較高，

13、10以下不發(fā)病。致病因子(1)毒素:包括溶血素及腸致病性毒素。溶血素分和2種。 溶血素能引起家兔注射局部的硬結、毛細血管充血和皮膚壞死，對Hela細胞、綠猴腎細胞、成纖維細胞和Y1腎上腺細胞具有毒性，可致動物敗血性腸炎。 溶血素毒性較強，靜注0.4g即可導致小鼠死亡，引起家兔皮膚壞死。 腸致病性毒素可分為3種，即霍亂樣腸毒素、細胞興奮型腸毒素和細胞毒腸毒素。(2)蛋白酶: 酪蛋白酶、纖維蛋白酶、膠原酶、葡萄球菌溶解素等,這些均與本菌的毒性有關。(3)外膜蛋白：與細菌的黏附相關。7 微生物診斷 細菌分離培養(yǎng)：TSA；生化試驗：一般不分解乳糖，對O/129不敏感；葡萄糖產氣，發(fā)酵甘露醇、蔗糖，利用

14、阿拉伯糖，水解七葉苷/水楊苷，鳥氨酸脫羧酶陰性。 致病因子：檢測胞外蛋白酶、溶血素、外膜蛋白等；血清學檢查：玻片/試管/微量凝集；動物感染試驗。（二）殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida1 形態(tài)與染色特性 G-短小桿菌，長度不到寬度的兩倍，0.8-1.01.0-1.8m，通常成雙、短鏈或成叢狀排列。無鞭毛、無動力、不形成芽孢和莢膜。2 培養(yǎng)特性兼性厭氧，生長需精氨酸和蛋氨酸。普通瓊脂上22培養(yǎng)48h后，形成圓形、隆起、邊緣整齊、半透明、松散菌落。多數(shù)菌株在含酪氨酸和苯丙氨酸的TSA、FA(Furunculosis agar,癤瘡病瓊脂)上產生水溶性褐色素，但厭氧下不能產生色素。血瓊脂上快

15、速溶血，7天后菌落變成淡綠色。生長溫度5-35(22-25)，生長pH6-9(7)，鹽濃度0-3%3 生化特性阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、糊精、精氨酸水解：+山梨糖、山梨醇乳糖、棉子糖、纖維二糖：-KCN肉湯、7.5% NaCl營養(yǎng)肉湯生長：-氨基甲酰磷酸激酶脂酶、腺嘌呤3, 2-單磷酸激酶：+脲酶、鳥氨酸脫羧酶（ODC）和連四硫酸鹽還原酶：-4 抵抗力本菌在蒸餾水存活4d至2w，滅菌河水28d（20-25）、滅菌濕土40d（20-30）不死亡。強毒株在含有機質淡水中可存活15w，在死魚腎臟存活28d（4）、在海水中10d內死亡。對土霉素、四環(huán)素、氯霉素、萘啶酸、喹啉酮、噁啉酸等敏感。許多抗生素

16、只能抑制其繁殖，不能將其殺滅。5 抗原性殺鮭氣單胞菌各亞種間具有共同的O抗原。此外，不產色亞種還具有亞種特有的抗原。 殺鮭氣單胞菌與本屬的其他種也存在共同抗原成分。6 致病性與致病因子 致病性：主要感染鮭科魚類，為鮭科魚類癤瘡病病原。細菌通過患病魚、帶菌魚和污染水水平傳播。入侵門戶主要是受傷皮膚，也可通過胃腸道和鰓感染。致病因子本菌病因與細胞壁表面的A層(additional cell surface layer; A-layer)和胞外產物(extracellular products; ECPs)有關。有毒菌株的細胞壁都有A層，主要由50kD的蛋白質組成，因此又稱A蛋白層。A蛋白的氨基酸序

17、列類似于大腸桿菌的K88菌毛和胎兒彎桿菌的微莢膜，可吸附于宿主細胞。此外，還可幫助該菌獲取鐵離子，避免血液中補體的溶解和吞噬細胞的吞噬。有A層的菌體懸浮于鹽溶液時往往產生自凝現(xiàn)象。這些菌株可凝集鮭鱒魚類的紅細胞，但不凝集鯉科魚類和哺乳動物的紅細胞。殺鮭氣單胞菌的胞外產物（ECP）至少由25種蛋白構成。包括溶血素、鮭溶解素（salmolysin）、殺白細胞素、細胞性糖蛋白及酪蛋白酶、骨膠原酶等。7 微生物學檢查（1）涂片鏡檢 取病魚的血液、臟器等涂片，革蘭氏染色，可見革蘭氏陰性的短桿菌。（2）分離培養(yǎng) 取病魚腎臟或體表潰瘍的病健交界處組織，接種于TSA或FA平板，20-28培養(yǎng)，檢查有無產褐色素的菌落并進