核酸的定量測定課件

核酸的定量測定紫外吸收法核酸的凝膠電泳定磷法二苯胺法地衣酚法紫外吸收法

實驗原理

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質，其吸收高峰在260nm波長處。核酸的摩爾消光系數(shù)（或稱吸收系數(shù)）用來表示。為每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。測得未知濃度核酸溶液的A260nm值，即可以計算出其中RNA或DNA的含量。該法操作簡便，迅速，并對被測樣品無損，用量也少。試劑和器材試劑：鉬酸銨－過氯酸沉淀劑：取3.6mL70%過氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中，即成0.25%鉬酸銨－2.5%過氯酸溶液。5-6%氨水：用25-30%氨水稀釋5倍。

材料

酵母RNA干粉。

1.準確稱取待測核酸樣品0.5g，加少量0.01mol/LNaOH調成糊狀,再加適量水，用5-6%氨水調至pH7.0，定容至50mL。2.取兩支離心管，甲管加入2mL樣品溶液和2mL蒸餾水，乙管加入2mL樣品溶液和2mL沉淀劑?；靹?，在冰浴上放置30min。3.在3000r/min下離心10min。從甲、乙兩管中分別吸取0.5mL上清液，用蒸餾水定容至50mL。選擇厚度為1cm的石英比色杯，在260nm波長處測定A值。4.測定A280的值。求出A260/A280.判斷RNA的純度。RNA=A260/A280=2.0操作方法

二、計算公式

ΔA260

RNA濃度=xN0.024xL

式中，ΔA260為甲管稀釋液在260nm波長處A值減去乙管稀釋液在260nm波長處A值；L──比色杯的厚度，1cm；

N——為稀釋倍數(shù)；0.024──每毫升溶液內(nèi)含1μgRNA的A值；1mL待測樣品液中核酸（微克）核酸％＝1mL待測樣品液中制品的毫克數(shù)在本實驗中，1mL待測液中制品量為50μg。1.紫外分光光度計使用前要預熱。2.比色皿應成套使用，注意保護,不能拿在光面上。3.離心機使用前必須將離心管平衡，對稱放置。調速必須從低到高，離心完等轉子完全停下后，再打開蓋子，然后將轉速打到最低。注意事項

是當前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、成本低。常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段DNA或RNA的分離，精度低，但分離范圍廣。電泳遷移率決定于：（1）核酸分子的大?。ㄟw移率與相對分子質量對數(shù)成反比）（2）膠濃度（遷移率與膠濃度成反比，常用0.7～1%）（3）DNA的構象：超螺旋＞線狀分子＞開環(huán)狀分子（4）電壓（一般5V/cm,電壓與遷移率成正比)（5）堿基組成（影響不大）（6）溫度（4～30℃都可以，常室溫進行）

瓊脂糖凝膠電泳常用于DNA分析；分析RNA時需加入蛋白質變性劑甲醛。電泳完畢用溴化乙錠（0.5μg/mL）染色，用紫外光檢測★瓊脂糖電泳用于DNA分子量的測定在同一凝膠中加入已知相對分子質量的樣品（分子marker)，在電泳完成后，通過染色，照相，從照片上比較待測樣品的DNA片段與標準樣品中的已知大小片段，可以推測待測未知DNA片段的分子大小。用于小片段DNA的分析相對分子質量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）定磷法二、實驗原理在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應生成磷鉬酸，當有還原劑存在時磷鉬酸立即轉變藍色的還原產(chǎn)物——鉬藍。2.鉬藍最大的光吸收在650—660nm波長處。當使用維生素C為還原劑時，測定的最適范圍為1-10微克無機磷。測定樣品核酸總磷量，需先將它用硫酸或過氯酸消化成無機磷再行測定。總磷量減去未消化樣品中測得的無機磷量，即得核酸含磷量。RNA的理論含磷量為9.5%，故由所測的核酸含磷量可計算出核酸含量。

消化的RNA溶液(0.06mg/mL)：取0.6mg酵母RNA，加入1.5MH2SO4溶液10mL，在沸水浴中加熱10-20分鐘，使核酸充分水解后，用于對各組分的鑒定。

未消化的RNA溶液(0.06mg/mL):

取0.6mg酵母RNA,加入蒸餾水10mL，55-65度消化半小時。三、實驗步驟

1.取同樣規(guī)格的試管8支，按下表順序分別精確地加入各試劑。編號12345678標準磷溶液10ug/mL(mL)0.000.200.400.600.801.000.000.00水(mL)3.002.802.602.402.202.002.002.00定磷試劑3.003.003.003.003.003.003.003.00消化的RNA(0.06mg/ml)0.000.000.000.000.000.001.000.00未消化的RNA(0.06mg/ml)0.000.000.000.000.000.000.001.00相當于無機磷量(微克)0.002.004.006.008.0010.00AB將試管內(nèi)溶液立即搖勻，于45℃恒溫水浴內(nèi)保溫30-45分鐘。取出冷卻至室溫，于660nm處測定OD(光密度)值。以1-6號管標準磷含量（微克）為橫坐標，光密度為縱坐標，繪出標準曲線。二苯胺法二、實驗原理脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色反應，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。除DNA外，脫氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖）也有同樣反應。其它多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無此反應。編號1234567DNA標準液(200ug/mL)0.000.400.801.201.602.000.00蒸餾水(mL)2.001.601.200.800.400.000.00二苯胺試劑(mL)4.004.004.004.004.004.004.00DNA待測液(mL)0.000.000.000.000.000.002.00DNA含量(ug)080160240320400YOD595X三、實驗步驟

1.取同樣規(guī)格的試管7支，按下表順序分別精確地加入各試劑。將試管內(nèi)溶液立即搖勻，于70℃恒溫水浴內(nèi)保溫50-60分鐘。取出冷卻至室溫，于595nm處測定OD值。以1-6號管DNA含量（微克）為橫坐標，光密度為縱坐標，繪出標準曲線。根據(jù)7號管測得的OD值，從標準曲線求出DNA待測液中的DNA含量。地衣酚法二、實驗原理當RNA與濃鹽酸共熱時，即發(fā)生降解，形成的核糖轉變成醛類，后者與3，5-二羥基甲苯（地衣酚）反應，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復合物。反應產(chǎn)物在670nm處有最大光吸收。RNA濃度在20—250μg/ml范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度成正比。

地衣酚法特異性差，凡戊糖均有此反應，DNA和其他雜質也能與地衣酚反應產(chǎn)生類似顏色。試管試劑/ml0123456RNA待測溶液0.00.00.00.00.00.03.0標準RNA溶液(100ug/ml)0.00.61.21.82.43.00蒸餾水3.02.41.81.20.60.00地衣酚-Fe3