酵母菌的基因工程課件

A酵母菌作為基因工程受體菌的特征7酵母菌的基因工程酵母菌的分類學(xué)特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。如果說(shuō)大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。A酵母菌作為基因工程受體菌的特征7酵母菌的基因工程酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物B酵母菌的宿主系統(tǒng)7酵母菌的基因工程提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型ssc1

改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶ssc2

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄后加工rgr1

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平ose1

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平ssc11

改善重組蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平突變類型生物效應(yīng)作用位點(diǎn)減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌共有四個(gè)泛素編碼基因：UBI1

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI2

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI3

編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI4

編碼泛素五聚體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期關(guān)閉穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌共有七個(gè)泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7C酵母菌的載體系統(tǒng)7酵母菌的基因工程酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌中的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。IRs反向重復(fù)序列，600bp，重組FLP

編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)IRs的同源重組REP

編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STB

REP的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質(zhì)粒類似。酵母菌中的野生型質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亞基的雙鏈線狀質(zhì)粒pGKL1和pGKL1拷貝數(shù)為50-100個(gè)，分別攜帶K1K2兩種能使多種酵母菌致死的毒反向重復(fù)序列素蛋白編碼基因（abg），同時(shí)含有毒素蛋白抗性基因。酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCpYCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1～5個(gè)含有TEL的YAC質(zhì)粒的構(gòu)建酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建

在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來(lái)的質(zhì)粒稱為Yip。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1%～2%。但該程序操作周期長(zhǎng)，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%～33%。酵母菌的轉(zhuǎn)化程序堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見(jiàn)酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過(guò)程中應(yīng)避免使用PEG，它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/mgDNA。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10～30倍含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能高效地同源整合入染色體這對(duì)于體內(nèi)定點(diǎn)突變酵母基因組極為有利克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，如果含有受體細(xì)胞的染色體DNA的同源序列，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50%～80%用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類

營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE

但對(duì)于多倍體酵母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的受體非常困難營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物大都是毒性物質(zhì)的抗性蛋白顯性標(biāo)記基因aph

氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418cat

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素dhfr

二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

銅離子螯合物耐受銅離子suc2

蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型酵母菌啟動(dòng)子的可控性pho4TS-PHO5啟動(dòng)子：釀酒酵母PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開(kāi)PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控因子因此，裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的外源基因在35℃時(shí)關(guān)閉23℃誘導(dǎo)表達(dá)溫度控制型啟動(dòng)子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35℃時(shí)失活酵母菌啟動(dòng)子的可控性a–a型啟動(dòng)子：釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個(gè)等位基因決定。a1因子決定a細(xì)胞特征表達(dá)a2因子阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產(chǎn)生a2變體，它能滅活a1，同時(shí)阻遏a型溫度控制型啟動(dòng)子a型啟動(dòng)子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動(dòng)子受體細(xì)胞基因組重組質(zhì)粒a型啟動(dòng)子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動(dòng)子a2a125℃35℃外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問(wèn)題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇

乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無(wú)選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)長(zhǎng)，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇多型漢遜酵母也是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。得成功表達(dá)。F利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗7酵母菌的基因工程由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬(wàn)病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒(méi)有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。F利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗7酵母菌的基因工程產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)顆粒呈球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來(lái)的。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母

20世紀(jì)80年代開(kāi)始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中