學年創(chuàng)新實驗總結報告

2002學年創(chuàng)新實驗總結報告手性藥物去甲腎上腺素對映體的高效毛細管電泳-電化學分離檢測報告人：許迪明

指導教師:謝天堯

1精選PPT手性藥物去甲腎上腺素對映體的毛細管電泳-電化學分離檢測

摘要：本文報道了以未涂層融硅石英毛細管（50cm×75μm）為分離柱，5mmol/LNaOH+8mmol/LCitricacid+8mmol/Lb-CD為電泳介質，分離電壓12.5KV，檢測電壓0.80V，建立的去甲腎上腺素對映體高效毛細管電泳-方波安培分離檢測方法。對分離過程中使用的緩沖溶液種類、濃度、pH、分離電壓對拆分效果的影響進行了討論，并對拆分機理進行了探討。2精選PPT

手性藥物在醫(yī)學領域中的作用越來越被人們重視。在含有對映異構體的藥物中，一種異構體是藥物的有效組分，而另一種則可能低效，無效乃至有毒，所以美國食品與藥物管理局出臺了手性藥物的管理法規(guī)，并引起國際上對手性藥物分離分析的重視（1）。手性化合物分離檢測的常用方法有高效液相色譜（HPLC），氣相色譜（GC），超臨界流體（SFC）和毛細管電泳（CE）。近年來，毛細管電泳手性分離技術引起了人們的重視，并得到了快速發(fā)展。概述部分3精選PPT

目前，有關采用毛細管電泳分離手性藥物報道中以光學檢測為多，電化學檢測的應用很少。毛細管電泳—電化學檢測，尤其是安培檢測，可使用極細孔徑的毛細管而不會造成靈敏度的損失，具有靈敏度高、線性范圍寬、設備簡單價廉、易于微機化和微型化，而被認為是CE的極具潛力的檢測方法。近年來隨著制約其應用的關鍵技術的突破，其應用潛能正在得到發(fā)揮，與其它類型的檢測器相比，具有自身的特點和優(yōu)勢，已發(fā)展成為一種重要的分離分析方法，將在手性藥物拆分方面有較大的應用前景。概述部分4精選PPT

去甲腎上腺素(Noradrenaline)是一種急救藥，具有很強的血管收縮作用，使全身小動脈與小靜脈都收縮(但冠狀血管擴張)，外周阻力增高，血壓上升。臨床上主要利用它的升壓作用，靜滴用于各種休克(但出血性休克禁用)，以提高血壓，保證對重要器官(如腦)的血液供應。，結構式見圖1。去甲腎上腺素是手性分子，含R型和S型。本文首次采用高效毛細管電泳—方波安培檢測法，以5mmol/LNaOH+8mmol/LCitricacid+8mmol/Lb-CD為電泳介質，實現了去甲腎上腺素對映體的分離檢測，取得了滿意的結果。概述部分5精選PPT去甲腎上腺素分子結構圖圖1去甲腎上腺素的分子結構Fig.1StructureofNoradrenaline6精選PPT1.主要儀器和試劑CES2000毛細管電泳儀（高壓電源，安培檢測器，毛細管電泳數據工作站，中山大學化學與化工學院研制）；PHS-3C型酸度計（上海偉業(yè)儀器廠）；石英毛細管（50cm×75μmi.d.,河北永年光導纖維廠）。CQ-2B型超聲波清洗器（明珠電器有限公司）。

去甲腎上腺素（上海禾豐制藥公司產品）；b-CD（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司產品）；氫氧化鈉（廣州化學試劑廠）；檸檬酸（Citricacid,廣州化學試劑廠）；所用試劑均為分析純，水為二次石英重蒸水。實驗部分7精選PPT

2.緩沖液和樣品溶液

分別配制100mmol/L檸檬酸、氫氧化鈉；25mmol/Lb-CD儲備液。實驗時，按要求量取適量儲備液制得不同濃度和不同pH的電泳運行緩沖液。去甲腎上腺素對映體配成2mg/mL的儲備液，進樣時用緩沖溶液稀釋到所需濃度。實驗部分8精選PPT

3.實驗方法

連接好毛細管電泳儀和檢測裝置，毛細管柱在使用前依次用0.1mol/LNaOH，蒸餾水和運行液各沖洗約5min。檢測電極用超聲波進行沖洗。當更換運行液或進樣4次以后，也需按上述步驟清洗毛細管和電極。進樣方式采用重力進樣，要求進樣端與檢測端的高度差為20cm，進樣時間為10s。方波安培檢測器的輸出信號經數據工作站采集到微機中，進行實時數據處理、圖形顯示和數據文件存儲。實驗在恒溫（25?C），恒濕（70%）的實驗條件下進行。實驗部分9精選PPT

3.1

b-CD濃度的影響

b-CD是手性選擇劑，是對映體分離的主要因素，它的濃度直接決定了分離效果，不同濃度的b-CD對兩個對映體分離的分離效果不同。高濃度和低濃度的b-CD對手性分離的機理也有變化。高濃度的b-CD由于非特異性疏水作用和b-CD的二聚作用導致手性識別能力。低濃度的b-CD與兩對映體的作用互相競爭。b-CD的濃度也影響了底液的性質，使毛細管電泳的推動力電滲流產生變化，改變了對映體的分離性。3.結果與討論10精選PPT1b-CD濃度的影響

實驗也證明了這一點，圖2－A是b-CD的時濃度為4mmol/L時的分離效果圖，可以看出兩個對映體還沒有明顯分開；圖2－B是b-CD的時濃度為8mmol/L時的分離效果圖，此時的分離效果比較滿意；圖2－C是b-CD的時濃度為12mmol/L時的分離的效果圖，此時的分離效果基本滿意。當b-CD濃度大于8mmol/L小于12mmol/L時，去甲腎上腺素對映體分別得到完全分離。最佳b-CD濃度為8mmol/L。結果與討論11精選PPT圖2不同濃度的b-CD分離效果電泳條件：檸檬酸8mmol/L，NaOH5mmol/L，分離電壓12.5KV，進樣時間10Sβ-CD濃度的影響4mmol/L8mmol/L12mmol/LABC12精選PPT2檸檬酸濃度及pH值的影響在分離過程中，通過選擇pH值可以調整電遷移和電滲流的平衡，增加分離度。pH值不僅可以影響毛細管中的電滲流來改變出峰時間來改善分離效果，同時還會使手性對映體與β-CD的相互作用變化，改變分析物的遷移行為和分離選擇性。緩沖液pH值得選擇還應兼顧遷移時間。在低pH情況下，電滲流很小，對于質子化程度較低的手性藥物來說分析時間較長，提高pH值分析時間縮短[3]。所以在分辨率允許的范圍內，常采用高的pH值。檸檬酸體系在方波安培檢測中有良好的背景。

結果與討論13精選PPT2檸檬酸濃度及pH值的影響實驗結果表明：當檸檬酸濃度在4－8mmol/L時，去甲腎上腺素對映體得不到分離，如圖3－A所示，L型和R型在檸檬酸濃度為4mmol/L時得不到較好的分離效果。檸檬酸濃度大于8mmol/L后，對映體到達基線分離，但出峰時間較長，如圖3－B所示，在檸檬酸濃度為8mmol/L時，去甲腎上腺素兩對映體的分離效果較好，且出峰時間大約在14分鐘左右；如圖3－C所示檸檬酸濃度為12mmol/L時，分離效果很好，只是出峰的時間在15分鐘左右。本實驗選擇檸檬酸濃度為8mmol/L。

結果與討論14精選PPT檸檬酸濃度的影響圖3不同濃度的檸檬酸分離效果圖電泳條件：b-CD8mmol/L，NaOH5mmol/L，分離電壓12.5KV，進樣時間10S4mmol/L8mmol/L12mmol/L

ABC15精選PPT3.分離電壓和檢測電壓的影響電壓在分離過程中有一最佳值。樣品的出峰時間對電壓的響應很敏感，高電壓使溶液的電滲流值增加，從而加快了樣品出峰時間。但是加大分離電壓會產生較多的焦耳熱而使溫度升高，溫度的升高又使溶液粘度變化，使毛細管壁上的溶液和毛細管中央的溶液的遷移速度不通，而造成峰形拖尾的現象。兩對映體和b-CD的包合是一個快速可逆的平衡過程，從熱力學角度來講，高溫不利于包合，降低了b-CD的分離效率。結果與討論16精選PPT3.分離電壓和檢測電壓的影響

圖4－A是電壓為12.5KV時的分離效果，圖4－B是電壓為10.5KV時的分離效果。由圖可知，隨著分離電壓的增加，對映體的出峰時間迅速提前（由14.5min提前到13min),同時未出現因熱效應引起的區(qū)帶展寬和分離效果變差。綜合考慮分離度和分析時間，本實驗選擇分離電壓為12.5KV。結果與討論17精選PPT分離電壓的影響圖4不同分離的電壓分離效果圖電泳條件：b-CD8mmol/L+檸檬酸8mmol/L+NaOH5mmol/L，進樣時間10S

＋12.5KV＋10.5KV

AB18精選PPT

4.旋光性測定

對于外消旋體，由于左、右旋體的量相等結果其旋光度為零，在電泳圖譜上表現為兩個面積幾近相同的電泳峰。本實驗中去甲腎上腺素針劑樣品的兩個對映體的峰面積大小相差較大（見圖5），表明其以非外消旋體形式存在，應具旋光性。將甲腎上腺素加水稀釋成1mL含2mg的溶液，在鈉光譜(539.3nm)，20℃條件下，測得的旋光度為-0.565°。表明出峰較早的電泳峰對應的是左旋(－)對映體，隨后的右旋體(+)。

結果與討論19精選PPT圖5

去甲腎上腺素針劑樣品的CE圖譜電泳條件：b-CD8mmol/L+檸檬酸8mmol/L+NaOH5mmol/L，分離電壓12KV，進樣時間15S

（－）（＋）旋光性測定20精選PPT5重現性測定

在優(yōu)化實驗條件下，分別將20mg/L去甲腎上腺素各連續(xù)6次測定，峰面積，如表1所示。

結果與討論21精選PPT表1重現性測定

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3456（-）峰面積279242791027887278032802327822（+）峰面積108310661046102511011041（+）/（（-）+（+））右旋體含量百分比（℅）3.733.683.623.563.783.61

相對標準偏差(RSD)2.2℅22精選PPTb-CD是由7個D-吡喃型葡萄糖基通過α-（1→4）糖苷鍵連接而成的錐筒狀分子，其2-，3-位仲羥基及6-位伯羥基分別位于錐筒空腔的大小口，b-CD的空腔內表面只有氫原子和帶孤對電子的糖苷氧原子，所以b-CD腔內疏水，腔外親水的兩性分子，因此可以與一些有機化合物形成主-客體包和物，b-CD的結構見圖6。Dalgliesh認為b-CD分離對映體應該符合“三點原理”：第一，被拆分的對映體必須有一部分進入b-CD的空腔內；第二，被拆分的對映體必須帶有能和b-CD上的羥基形成作用力的羥基或氨基；第三，兩對映體與b-CD的包合作用力不同，即包和常數有差別。機理討論23精選PPT圖6.b-CD的分子結構MW=1135Fig.3Chemicalstructureandschematicmodelofb-CD：MW=1135(molecularmass)β-CD的分子結構24精選PPT

在拆分去甲腎上腺素對映體時，苯環(huán)進入b-CD疏水腔，氨基上的氮原子與環(huán)糊精空腔外的羥基發(fā)生作用。R型和S型的氮原子與b-CD上的羥基形成不同的分子間作用力，使R型和S型對映體與β-CD形成的包合絡合物在溶液中的淌度不一樣，而實現分離，如圖7所示。機理討論25精選PPT

機理討論圖7b-CD包合去甲腎上腺素示意圖

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1苑可

戴立信

，關注“手性藥物”，科技術語研究，2002，4（2）：2-42朱曉峰

薛俊

林炳承，手性藥物的毛細管電泳拆分環(huán)糊精