植物組織培養(yǎng)的基本原理

第三章植物組織培養(yǎng)的基本原理

主要內(nèi)容植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化離體條件下植物器官的發(fā)生第一節(jié)植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化一植物細(xì)胞全能性二、植物細(xì)胞分化植物細(xì)胞全能性細(xì)胞學(xué)說1902年，Haberlandt提出了植物細(xì)胞的全能性理論：植物的體細(xì)胞在適當(dāng)條件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的能力。70年代：細(xì)胞全能性：每一個細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整植株的能力。80年代：每一個植物細(xì)胞帶有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機體所有不同類型的細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整的植株。一些高度分化的植物細(xì)胞如篩管和木質(zhì)部細(xì)胞目前暫時不能表現(xiàn)出細(xì)胞全能性。全能性表達(dá)最有利的證據(jù)是：通過胚狀體分化形成完整植株。當(dāng)離體培養(yǎng)時，這些細(xì)胞（組織、器官）生命特征屬性的表現(xiàn)過程和形式都將發(fā)生變化1新陳代謝方面：培養(yǎng)基2.調(diào)控能力方面：異養(yǎng)3.生長發(fā)育和繁殖方面：細(xì)胞脫分化，體細(xì)胞胚發(fā)生。4.在遺傳進(jìn)化方面：變異性增加二、植物細(xì)胞分化分化：指植物體各個部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，包括細(xì)胞分化、組織分化或器官分化等。細(xì)胞分化：指在個體發(fā)育過程中，不同部位的細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生改變，形成不同的組織和器官。細(xì)胞分化是發(fā)育生物學(xué)的核心問題，是基因選擇性活化或阻遏的結(jié)果。5%-10%細(xì)胞分化的某些規(guī)律和機理1.可分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化及生理生化分化；2.不存在部分基因組永久關(guān)閉的情況；3.離體培養(yǎng)可通過脫分化來喪失“細(xì)胞發(fā)育的決定”4.極性與分化密切相關(guān)；5.生理隔離或機械隔離在細(xì)胞分化中的促進(jìn)作用；6.細(xì)胞分裂對細(xì)胞分化具有重要作用；7.植物生長調(diào)節(jié)劑對細(xì)胞分化具有明顯的調(diào)節(jié)作用；8.細(xì)胞核染色體和DNA的變化對細(xì)胞分化的作用；第二節(jié)離體條件下植物器官的發(fā)生一、脫分化和再分化二、影響細(xì)胞脫分化和再分化的因素一、脫分化和再分化（一）脫分化1.定義脫分化（dedifferentiaton）：去分化，指離體培養(yǎng)條件下生長的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或成為未分化細(xì)胞特性的細(xì)胞的過程。2.脫分化種類1）通過細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織；2）本身細(xì)胞恢復(fù)分生狀態(tài)，即可再分化。脫分化也為植物界常有的現(xiàn)象3.脫分化的機理尚未清楚，誘導(dǎo)脫分化期間細(xì)胞學(xué)以及生理生化方面的變化：以下變化改變了細(xì)胞原有的生理狀態(tài)，引起細(xì)胞分裂膜透性改變細(xì)胞核增大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大多核糖體形成氣體交換率增加不同基因活化引起生長激素的分解或合成過氧化物酶增加蛋白和酚類物質(zhì)合成活躍乙烯產(chǎn)物增加（二）再分化1.定義再分化（redifferentiaton）：離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官、甚至形成完整的植株的現(xiàn)象。2.再分化的分類1）細(xì)胞水平的再分化：2）組織水平的再分化：3）器官水平的再分化：4）植株再生：1.細(xì)胞水平的再分化：細(xì)胞壁變厚、假導(dǎo)管細(xì)胞的形成及酶水平的變化，從而形成各種類型的細(xì)胞。2.組織水平的再分化：當(dāng)愈傷組織在高水平生長素條件下，最常見的是維管組織的分化。松散的愈傷組織內(nèi)含有大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少。3）器官水平的再分化：又稱器官發(fā)生，指再分化的組織可形成各種器官，如根、莖或芽、葉、花以及多種變態(tài)的器官。器官發(fā)生根據(jù)起源的不同可以分為：器官型：由外植體的細(xì)胞形成器官原基，繼而發(fā)育成器官器官發(fā)生型：先形成愈傷組織，由愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基。離體培養(yǎng)下的器官原基的形成過程：外植體脫分化分生細(xì)胞團(tuán)分化成不同的器官原基在器官縱軸上出現(xiàn)單向性形成愈傷組織分化成維管組織4）植株再生：離體培養(yǎng)再生植株的主要途徑是器官發(fā)生和胚胎發(fā)生。器官發(fā)生：根、莖或芽的器官發(fā)生原球莖發(fā)生（蘭花）綠色球狀體的發(fā)生（蕨類植物）莖原基發(fā)生（菊科）胚胎發(fā)生根和莖或芽器官的發(fā)生可使植株重建，有三種形式（1）先形成芽，芽的基部長根形成小植株；（2）先形成根，根上再出芽。（3）愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后形成維管組織把兩者結(jié)合起來形成一個植株。一般離體培養(yǎng)物中先形成芽后較易形成根。原球莖是蘭科植物的一種再生方式,它最初是指蘭花種子萌發(fā)過程中的形態(tài)學(xué)構(gòu)造,《植物生物學(xué)詞典》(1994年)中將之定義為植株基部由一團(tuán)尚未分化的薄壁細(xì)胞組成的上端有頂端生長點和葉原基,下端有很多不定根、初具球莖形態(tài)的球狀體,可理解為縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類似嫩莖的原器官。另外,在蘭科植物的組織培養(yǎng)中通過誘導(dǎo)適宜的外植體也能產(chǎn)生一些類似于原球莖的結(jié)構(gòu),通常把這種結(jié)構(gòu)稱為類原球莖或擬原球莖(protocormlikebodies),即PLBs。蘭花的原球莖生命力強，遺傳性狀穩(wěn)定，對快速繁殖及種質(zhì)資源保存極為有利。外植體接種后放置在23一25度的黑暗條件下培養(yǎng)，1～2個月后可分比出1至數(shù)個乳白色的原球莖，在解剖鏡下觀察類似桑果形狀的園球突起，以后轉(zhuǎn)綠，再經(jīng)培養(yǎng)易呈根狀莖（或呈樹枝狀的叢生形）。二、影響細(xì)胞脫分化和再分化的因素（一）影響細(xì)胞脫分化的因素植物離體培養(yǎng)中，細(xì)胞脫分化與外植體本身以及環(huán)境條件有關(guān)，影響因素主要有：1.損傷;刺激增殖，生命的自我調(diào)節(jié)方式。2.生長調(diào)節(jié)劑;3.光照;弱光或黑暗有利于脫分化的細(xì)胞分裂。4.細(xì)胞位置;5.外植體的生理狀態(tài);不同年齡不同季節(jié)6.植物種類差異;雙子葉易于單子葉植物（二）影響細(xì)胞再分化的因素

雖然理論上各種植物體的活細(xì)胞都具有全能性，但實際上，目前還不能讓所有植物的所有活細(xì)胞都再生植株。主要原因：1.不同植物種類再分化的能力差異很大；2.對某些植物的植株再生條件還沒有完全掌握。影響因素與脫分化基本一樣。三、愈傷組織1.定義愈傷組織：植物細(xì)胞脫分化而不斷增殖形成的，主要由薄壁細(xì)胞構(gòu)成的非器官化組織或不定組織。愈傷組織的顏色透明、質(zhì)地疏松。愈傷組織具有結(jié)構(gòu)的不均一性和生理和遺傳上的不穩(wěn)定性莖端上的愈傷組織2.愈傷組織形成的條件離體培養(yǎng)條件（尤其是激素的種類和濃度，常用的生長素是2，4－D，IAA和NAA，常用的細(xì)胞分裂素是KT和6－BA）外植體類型（木本植物中的幼態(tài)或成年態(tài)）外植體原來在植株上所處的位置（它反映了內(nèi)源激素的水平）（圖）不同類型細(xì)胞脫分化過程

可能進(jìn)行的程度圖3.愈傷組織形成的過程誘導(dǎo)期分裂期分化期誘導(dǎo)期

誘導(dǎo)期是外植體細(xì)胞進(jìn)行分裂準(zhǔn)備的時期。特點：在這一時期外植體細(xì)胞大小沒有多大變化，但細(xì)胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯增大。時間長短與物種相關(guān)分裂期

細(xì)胞分裂的速度大大超過了細(xì)胞伸展的速率，細(xì)胞體積迅速變小，逐漸回復(fù)到分生狀態(tài)。細(xì)胞進(jìn)行脫分化。特點：細(xì)胞分裂快；結(jié)構(gòu)疏松；顏色淺而透明；缺少有結(jié)構(gòu)的組織。更換培養(yǎng)基可無限增殖。分化期細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化而形成有不同形態(tài)和功能的細(xì)胞形成的愈傷組織。特點：出現(xiàn)形態(tài)各異的細(xì)胞愈傷組織形成過程中各期細(xì)胞形態(tài)和RNA含量的變化4.愈傷組織增殖將誘導(dǎo)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上時，愈傷組織就會進(jìn)一步增殖生長，生長一段時間以后，又必須重新將愈傷組織切割成一定大小的愈傷組織塊，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖。轉(zhuǎn)接必須及時，因為愈傷組織的生長基本符合s形生長曲線。5.愈傷組織培養(yǎng)的影響因素外植體：一般而言，分生細(xì)胞和薄壁細(xì)胞較易誘導(dǎo)出愈傷組織。培養(yǎng)基：一般選擇鹽濃度較高的基本培養(yǎng)基如MS，B5及它們的改良培養(yǎng)基來進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)；一般采用固體培養(yǎng)基，但也可