CIK細(xì)胞制備流程

CIK細(xì)胞制備流程CIK細(xì)胞制備流程CIK細(xì)胞制備流程資料僅供參考文件編號：2022年4月CIK細(xì)胞制備流程版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：CIK細(xì)胞的制備方法（僅供參考）【背景】CIK是“Cytokine-InducedKillerCells”的縮寫，中文全稱為“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞”。CIK是單個(gè)核細(xì)胞在CD3單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，其既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。

【培養(yǎng)原理】CIK培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體：nCD3激發(fā)型單抗：T細(xì)胞活化的第一信號來自于T細(xì)胞表面的受體，即T細(xì)胞抗原受體(Tcellantigenreceptor,TCR)與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細(xì)胞對抗原的特異性識別。TCR是由2條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T細(xì)胞表面，其與CD3分子通過非共價(jià)鍵結(jié)合，形成TCR/CD3復(fù)合體。TCR識別特異性抗原后會引起CD3和T細(xì)胞表面的輔助受體CD4或CD8分子的胞漿尾部聚集，進(jìn)而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck,Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進(jìn)一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或MAP激酶途徑等)，最終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T細(xì)胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，T細(xì)胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為增殖和活化狀態(tài)。

由上可見，CD3分子在T細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細(xì)胞表面CD3分子特異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T細(xì)胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復(fù)合物的識別和激活過程，從而引起T細(xì)胞的增殖與活化，因此是CIK細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。

此外，CD3激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細(xì)胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T細(xì)胞。因此，在進(jìn)行CIK培養(yǎng)時(shí)，最好選用OKT-3克隆，以保證每個(gè)患者的T細(xì)胞均能被激活。

nIL-2(白細(xì)胞介素-2)IL-2最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱為T細(xì)胞生長因子(Tcellgrowthfactor,TCGF)，是引起T細(xì)胞增殖最重要的細(xì)胞因子。IL-2既是自分泌細(xì)胞因子，也是旁分泌細(xì)胞因子，其通過與T細(xì)胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2還可刺激NK細(xì)胞的生長并增強(qiáng)其殺傷能力。因此CIK細(xì)胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與活化。

nIFN-g(干擾素-g)IFN-g具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)的作用，因此會增強(qiáng)T細(xì)胞對IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成的過程中加入IFN-g，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-g加入的順序與CIK的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN-g，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細(xì)胞毒活性。

nIL-1a(白細(xì)胞介素-1a)IL-1a也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-1a與IFN-g和激發(fā)型CD3單抗合用時(shí)，可以明顯提高CIK的細(xì)胞毒作用。

【細(xì)胞制備】1．外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞50-100mL；淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。

2．CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定將PBMC按1-2x106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000U/ml的重組人IFN-g，37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和300U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細(xì)胞的生長和增殖；注：此時(shí)也可同時(shí)加入100U/ml的重組人IL-1a。每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2300U/ml；在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)控：臺盼藍(lán)染色檢測：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上。細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10:1(數(shù)目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細(xì)胞1x104個(gè)，終體積為200ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率。收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5Eu)。

【步驟簡圖】【推薦試劑】生產(chǎn)商產(chǎn)品名稱產(chǎn)品編號產(chǎn)品規(guī)格北京同立海源生物科技抗人CD3單抗TL-98500ug北京同立海源生物科技抗人CD28單抗TL-99500ug北京同立海源生物科技重組人IFNγTL-34200ug北京同立海源生物科技重組人GM-CSFTL-5075ug北京同立海源生物科技重組人TNFaTL-8350ug北京同立海源生物科技重組人IL-2TL-41100ug北京同立海源生物科技重組人IL-4TL-4940ug北京同立海源生物科技重組人FibronectinTL-12北京同立海