備課素材：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗的研究-高一下學(xué)期生物人教版必修2

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗的研究十九世紀(jì)中葉，整個生物學(xué)界的熱點歸納起來就是三個字－進(jìn)化論。二十世紀(jì)中葉，整個生物學(xué)界的熱點歸納起來也是三個字－DNA。

DNA這個分子是怎么吸引了一眾生物學(xué)者們愛慕的眼神的呢？這就得從第一次世界大戰(zhàn)時說起。DNA遺傳物質(zhì)的證據(jù)的經(jīng)典實驗教材上有兩個，一是肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗，包括體內(nèi)和體外實驗；二是噬菌體侵染細(xì)菌的實驗。肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗歷經(jīng)16年（1928年到1944年），經(jīng)過了兩代科學(xué)家。轉(zhuǎn)化實驗證明了遺傳物質(zhì)是DNA，不是蛋白質(zhì)，也不是多糖。值得學(xué)習(xí)和傳誦，以下是摘自“科學(xué)松鼠會”的文章，相信通過學(xué)習(xí)對教材上的經(jīng)典實驗了解更深刻。一、體內(nèi)轉(zhuǎn)化實驗－轉(zhuǎn)化因子的提出

上個世紀(jì)二十年代，在英國衛(wèi)生部下屬病理實驗室工作的一名衛(wèi)生官員兼微生物學(xué)家格里菲斯（

Griffith）正在研究大葉性肺炎。

FrederickGriffith

（1879-1941）十九世紀(jì)末到二十世紀(jì)初正是大葉性肺炎的主要致病菌肺炎雙球菌大為流行的時期，這種細(xì)菌是一種毒性十分強(qiáng)烈的革蘭氏陽性菌，除了肺炎，它還能引起中耳炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、急性鼻竇炎等等一系列疾病，因此當(dāng)時研究者眾多。格里菲斯也是其中的一人，他的主要工作就是把肺炎雙球菌加以觀察分類，希望能對大葉型肺炎的傳染途徑有進(jìn)一步的了解。此外，他也在老鼠身上進(jìn)行動物實驗，用各種不同的肺炎雙球菌來感染老鼠，研究這種細(xì)菌致病的機(jī)制。肺炎雙球菌表型上主要可被分為兩大類，一類被稱為光滑型菌株（smooth），另一類則被稱為粗糙型菌株（rough）。這兩者之間的區(qū)別當(dāng)兩種菌株分別在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時表現(xiàn)得十分明顯，光滑型菌株因為外面有一層由多聚糖形成的富含水分的莢膜，所以會形成比較大而光滑的菌落；粗糙型的菌落與之相比就顯得較小且表面干燥。莢膜對肺炎雙球菌最大的意義在于它會妨礙巨噬細(xì)胞的吞噬作用，另外，莢膜對細(xì)菌來說還能貯存養(yǎng)料。最后，莢膜本身對人也是一種致病因子。因此有莢膜的光滑型菌株進(jìn)入人體后，一方面引起種種致病反應(yīng)，另一方面免疫細(xì)胞又對它束手無策，于是病菌迅速增殖，肺炎等病癥就猛烈爆發(fā)。比起來，沒有莢膜的粗糙型菌株則很容易被免疫系統(tǒng)消滅在萌芽狀態(tài)。莢膜作為肺炎雙球菌的“外衣”，并不是像制服一樣千人一面的，不同的光滑型菌株的莢膜實際上有各種不同的組分與結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)它們侵入人體時，人體也會為了對抗它們產(chǎn)生不同的抗體。在格里菲斯的時代，光滑型（S型）的肺炎鏈球菌就根據(jù)這個被具體細(xì)分為S-I、S-II、S-III、

S-IV型。而研究者們早就發(fā)現(xiàn)，有時候S型與R型之間可以互相轉(zhuǎn)變，大約是因為基因發(fā)生突變的緣故。于是，本來粗糙型（R型）表現(xiàn)型其實就一種－沒有莢膜，但根據(jù)它能轉(zhuǎn)變成的不同S型，也被相應(yīng)地分為R-I、R-II、R-III、R-IV型。這種突變發(fā)生的頻率不高，但確實是存在的。值得一提的是，分屬不同型的S菌株與R菌株因為編碼莢膜的基因之間差距太大，是不會因一兩個突變就變成彼此的。當(dāng)時科學(xué)界的傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，能交配的動物會雜交產(chǎn)生不一樣的后代，這個好理解。至于細(xì)菌這種獨自默默地在那分裂的生物，一變倆倆變四四變八……一路走來，始終如一。一個細(xì)菌分裂了一百次，也還是一個細(xì)菌，不能分著分著就變成其它細(xì)菌。也就是說，而一個球菌順著它的家譜樹往上追十八代祖宗，那祖宗

也必須是個球菌，不能是個螺旋菌。因此，倘若培養(yǎng)一個R-I的菌株，就算養(yǎng)再久，頂多出現(xiàn)一兩個返祖的S-I，肯定不能出現(xiàn)S-II、S-III、S-IV型——除非養(yǎng)著養(yǎng)著污染了。可是，真理有時候恰與我們的常識相違背。1927年，格里菲斯做了一個后來被稱為“格里菲斯實驗”的著名實驗。實驗結(jié)果1928年發(fā)表在《衛(wèi)生雜志》上，文章標(biāo)題叫《肺炎鏈球菌種類的意義》－從這個標(biāo)題就看得出，格里菲斯主要想解決的問題還是流行病學(xué)的問題。實驗設(shè)計是這樣的：格里菲斯先給老鼠分別皮下注射活的光滑型S-III與粗糙型R-II菌株，注射光滑型S-III的老鼠很快發(fā)病死亡，尸檢顯示死亡原因是光滑型菌株感染引起的。注射粗糙型R-II菌株的老鼠則健康情況良好。格里菲斯實驗確定了兩種活的肺炎雙球菌對老鼠的影響后，格里菲斯用加熱法殺死了兩種雙球菌，然后再次讓老鼠分別注射加熱滅活的光滑型S-III與粗糙型R-II菌株。這次，兩邊的老鼠都健康情況良好。這一組實驗顯示加熱滅活應(yīng)該是完全而有效的。最后，格里菲斯把活著的粗糙型R-II菌株混合已經(jīng)加熱滅活的光滑型S-III菌株——這二者單獨注射時已經(jīng)都證明對老鼠無毒害作用——當(dāng)格里菲斯讓老鼠同時注射這二者，出乎意料的是，老鼠居然發(fā)病死亡了。格里菲斯解剖了死鼠，發(fā)現(xiàn)原本的粗糙型R-II菌株披掛上了莢膜，搖身一變變成了光滑型S-III菌株！格里菲斯把這些變身的光滑型S-III菌株培養(yǎng)了幾代，發(fā)現(xiàn)它們依然能保持S-III菌株的表型。理論上，就算R-II要變，它也必須只能變成S-II。可現(xiàn)在，格里菲斯就讓大伙兒眼睜睜地看著他大變活菌－他手下的肺炎雙球菌硬是從一種菌株轉(zhuǎn)成了另一種外形、抗原、致病性都完全不同的菌株！

難道S-III的滅活不完全，可是之前單獨注射滅活S-III的實驗已經(jīng)排除了這一可能。格里菲斯混提出了一個“轉(zhuǎn)化原理”的假說－粗糙型菌株R-II會轉(zhuǎn)變成S-III，說明已滅活的光滑型菌株的某種因子以某種方式，讓粗糙型菌株長出了莢膜。根據(jù)功能給它取個名，就叫“轉(zhuǎn)化因子”。1941年，格里菲斯在自己的公寓中逝世?！读~刀》與《英國醫(yī)學(xué)雜志》都登載了他的訃聞，但對他發(fā)現(xiàn)的肺炎球菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，前者是草草帶過，后者則壓根沒提。那時的科學(xué)界還未意識到格里菲斯實驗背后藏著的巨大寶庫。格里菲斯逝世三年后，認(rèn)識到轉(zhuǎn)化現(xiàn)象真正意義的人這才終于出現(xiàn)。二、體外轉(zhuǎn)化實驗－DNA是轉(zhuǎn)化因子那個人在哪兒呢？倒不在英倫小島上，甚至不在歐洲大陸上，橫越過浩浩湯湯的大西洋，在洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所的艾弗里（OswaldT.Avery）。艾弗里所在的洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所（即現(xiàn)在的洛克菲勒大學(xué)）當(dāng)時是美國肺炎球菌研究的中心，因此他在第一時間讀到了格里菲斯的研究。這個結(jié)果當(dāng)時就引起了他的極大反響－倒不是正面的反響。艾弗里壓根就不相信格里菲斯的結(jié)果。從1913年起，艾弗里就一直是研究肺炎雙球菌的權(quán)威人士。他的實驗室專注于分析肺炎雙球菌的多種菌株所擁有的各異多糖莢膜。艾弗里和他的同事們共同分析出了各種莢膜不同的化學(xué)組分，并以此為依據(jù)為大葉性肺炎找出了診斷標(biāo)準(zhǔn)，還開創(chuàng)性地應(yīng)用了免疫血漿療法，并且設(shè)計出了一一對應(yīng)的抗生素與疫苗，這一切都建立在一條不言自明的真理之上：肺炎雙球菌菌株不會互相轉(zhuǎn)化。否則特異性的抗生素與疫苗意義何在？而現(xiàn)在，格里菲斯卻說，在某種轉(zhuǎn)化因子的作用下，粗糙型菌株R-II會轉(zhuǎn)變成S-III？艾弗里倒并沒即刻著手實驗來駁斥格里菲斯，原因就在他的身體，艾弗里患有一種自體免疫性疾病——葛瑞夫茲氏病，即突眼性甲狀腺腫。這一疾病當(dāng)時令他極為困擾，也不能長時間在實驗室里工作，只得眼睜睜地看著德國羅伯特科赫研究所的諾伊菲爾德（FredNeufeld），以及他在洛克菲勒醫(yī)院的同事道森（MartinDawson）與阿洛韋（LionelAlloway）先后重復(fù)了格里菲斯的實驗。而他們成功地得出了一致結(jié)論：格里菲斯的實驗結(jié)果是真實可靠的。重復(fù)雖然驗證了格里菲斯的結(jié)果，但更進(jìn)一步的突破卻沒有產(chǎn)生。當(dāng)時，甚至包括格里菲斯本人在內(nèi)的科學(xué)界中，可能只有艾弗里敏銳地意識到格里菲斯這個發(fā)現(xiàn)的真正價值。格里菲斯的問題在哪里呢？太關(guān)注他的本行——

流行病學(xué)，完全以解釋肺炎雙球菌的變化與傳播機(jī)制為重點來闡釋實驗結(jié)果。艾弗里則看得更深遠(yuǎn)，他隱隱感到，那個神秘的轉(zhuǎn)化機(jī)制，也許就是解開遺傳之謎的關(guān)鍵。艾弗里的探索歷程，就從阿洛韋那里拿來的一管S-III菌株粗提物開始。阿洛韋已經(jīng)重復(fù)驗證過，那神秘的轉(zhuǎn)化因子就藏在其中。

艾弗里的實驗1943年五月，艾弗里給他任職于范德比爾特大學(xué)的兄弟羅伊（RoyAvery）寫信解釋他推遲退休的原因－他原本計劃不久便退休，搬去羅伊所在的城市納什維爾，但為了研究轉(zhuǎn)化因子，艾弗里決定繼續(xù)工作。艾弗里確實有了重大進(jìn)展。比起之前的研究者，艾弗里在格里菲斯實驗的基礎(chǔ)上做了許多的改進(jìn)，而其中最重要的一點，就是他把實驗環(huán)境從老鼠體內(nèi)換到了體外的培養(yǎng)皿中。在格里菲斯的實驗中，最后S-III型的菌株是在死亡后小鼠的心臟血中培養(yǎng)而取得的，從R-II到S-III，這中間究竟發(fā)生了什么完全無從觀察和了解。只有在體外進(jìn)行的實驗，才可能設(shè)計更好的對照組與更精確的實驗設(shè)計。倒不是格里菲斯沒考慮過在體外重復(fù)轉(zhuǎn)化實驗，只是他的這種嘗試總是失敗。艾弗里的信里是這樣描述的：“格里菲斯只有用老鼠時才能成功。他用同樣的細(xì)菌混合物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，總是無法得到轉(zhuǎn)化現(xiàn)象?！?/p>

你還記得和我們一道的道森（Dawson），他在液體培養(yǎng)基里加了抗R型菌株的血清，然后就在體外成功重復(fù)了轉(zhuǎn)化現(xiàn)象?！卑ダ镏暗睦媳拘芯褪茄芯靠狗窝椎难?、抗生素以及疫苗。這回一點沒浪費，全用上了。為什么抗R型菌株的血清對體外重復(fù)轉(zhuǎn)化實驗這么重要呢？要說這道理也簡單。莢膜對于細(xì)菌而言有兩大作用，其一、協(xié)助細(xì)菌對抗免疫系統(tǒng)；其二、作為養(yǎng)分協(xié)助細(xì)菌度過饑饉年頭。換言之，越是惡劣的生存環(huán)境，細(xì)菌越是需要莢膜。而在體外培養(yǎng)時，面對的是一個沒有天敵、營養(yǎng)豐富的世界，這時沒有莢膜的R型細(xì)菌就好比輕裝上陣的馬拉松選手，輕輕松松就能把穿著笨拙的救生衣的S

型細(xì)菌甩出幾條街。同樣的時間里，R型細(xì)菌已經(jīng)子又生孫孫又生子曾孫又生曾曾孫子，回頭一看，S型細(xì)菌還在那一針一針給自己的長子織救生衣呢！也就是說，假如外界沒有有利于S型細(xì)菌的選擇壓力，競爭優(yōu)勢就會盡在R型細(xì)菌一方。不用多久，S型細(xì)菌就會在與R型細(xì)菌的自然競爭中敗下陣來。哪怕有R型轉(zhuǎn)化而成的S型細(xì)菌產(chǎn)生，只要復(fù)制幾代之后，也只能觀察到R型細(xì)菌慶祝自己全國山河一片紅而已。只有靠著老鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)或者外加的抗R型血清的幫助，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的S型細(xì)菌才有脫穎而出的機(jī)會。這就是艾弗里成功的關(guān)鍵。同一封給羅伊的信中，艾弗里詳盡地描述了他的探索過程“阿洛韋用III型菌株提取出的濾過物－沒有定形成分或者細(xì)胞碎片的那種－成功地讓R-II型培養(yǎng)菌變成了典型有莢膜的S-III型肺炎鏈球菌?！@種改變是可遺傳的。在過去的兩年中，先是和麥克勞德

（MacLeod），然后和麥卡蒂（McCarty）博士一起－我一直在試著找出細(xì)菌抽提物中的哪一個物質(zhì)引發(fā)了那個特殊現(xiàn)象（轉(zhuǎn)化）。（S-III型的）粗提物里滿是莢膜的多糖、碳水化合物、核蛋白、酵母型核酸（注：即RNA）與胸肽型核酸（注：即DNA）、脂質(zhì)，以及其他細(xì)胞組分?！?/p>

要去試著分離

并確定那個特定（轉(zhuǎn)化）因子的化學(xué)成分……

這工作－充滿了失望與心碎。但也許我們終究找到它了－”

“這種活性組分不會被結(jié)晶胰蛋白酶或糜蛋白酶所消化。用能分解酵母型核酸的結(jié)晶核糖核酸酶處理后它也不會失去活性。III型莢膜的多糖可以用特異的III型酶去除，并不影響抽提物的轉(zhuǎn)化活性。再在零下12攝氏度下用乙醇與乙醚可以從抽提物中萃取出脂質(zhì)?！?/p>

蛋白質(zhì)的去除可以用塞瓦戈方法－（用氯仿和戊醇混合震蕩）處理直到雙縮脲測試結(jié)果呈陰性，即為蛋白質(zhì)已大致除盡。”“即使已經(jīng)這樣純化，抽提物依然含有痕量的蛋白質(zhì)、大量碳水化合物、以及酵母型與胸肽型核酸。此后我們一滴滴地加入純乙醇，一件有趣的事情發(fā)生了。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到大約90%體積時，析出了一種纖維狀的物質(zhì)，當(dāng)我們用玻璃棒攪拌混合物時，它就纏在玻璃棒上，仿佛絲線繞在線軸上一般－而其他的雜質(zhì)則成

為一顆顆沉淀被留在混合物中。重復(fù)幾次這一過程，再將收集到的纖維狀物質(zhì)重新溶解。簡而言之，這一物質(zhì)具有高度的轉(zhuǎn)化活性，而元素分析非常符合理論上純的胸肽型核酸（的元素組成）?！鄙衩氐霓D(zhuǎn)化因子居然是此前無人看好的DNA，艾弗里的信中寫道：“誰能想到呢？”艾弗里終于成為了那個打開DNA寶庫大門的人，他固然是幸運的，但幸運女神也只垂青有準(zhǔn)備的頭腦。1944年，《實驗醫(yī)學(xué)學(xué)報》發(fā)表了艾弗里、麥克勞德、麥卡蒂三人聯(lián)名撰寫的論文。這一年，艾弗里67歲。

三、遺憾和不足艾弗里的實驗首次讓人們意識到，遺傳物質(zhì)極可能是DNA，但這個實驗遠(yuǎn)非完美。首先，艾弗里不知道DNA這么一個看似簡單的又同質(zhì)性極高的小分子是怎樣蘊(yùn)含了世間萬物形形色色的遺傳信息的。其次，這個實驗的結(jié)果嚴(yán)格表述起來，應(yīng)該是降解DNA后轉(zhuǎn)化就不再成功了－這依然不能完全排除其他一

些DNA并非遺傳物質(zhì)的可能。比如，或許另有真正的遺傳物質(zhì)，但DNA協(xié)助保持這種遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定，一旦DNA被分解，遺傳物質(zhì)便隨之而去。又比如，DNA的作用其實在于幫助把真正的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)部，這樣轉(zhuǎn)化才能完成。當(dāng)時的還有人依然堅信蛋白質(zhì)這樣的大分子才能攜帶足夠多的遺傳信息，質(zhì)疑艾弗里的DNA純度不夠，真正起轉(zhuǎn)化作用的是混雜其中的蛋白質(zhì)。但無論如何，還是有許多相信了艾弗里實驗結(jié)果的人們開始用各種實驗來試圖證實或證偽“DNA是遺傳物質(zhì)”這一假說。從格里菲斯發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，到艾弗里發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化與DNA密切相關(guān)，中間過去了十六年。而在艾弗里的論文發(fā)表后，還要再過九年，沃森與克里克才通過解析DNA的結(jié)構(gòu)完美地解釋了DNA藏有遺傳信息的分子基礎(chǔ)，讓大部分人都接受了DNA是基因的觀念。這一發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的建立，生物學(xué)一個全新的紀(jì)元自此開始。在194