吉?jiǎng)P基因RNA干擾技術(shù)wuhan

吉?jiǎng)P基因RNA干擾實(shí)驗(yàn)技術(shù)

課程培訓(xùn)

2007年11月中國(guó)武漢2006年10月2日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院宣布，將2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予兩名美國(guó)科學(xué)家安德魯·菲爾和克雷格·梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)簡(jiǎn)介

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干擾的過程。RNAi具有特異性和高效性。這種技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具，并將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發(fā)揮重要作用。What’sRNAi雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來(lái)高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。RNA干擾具有普遍性、高效性、特異性的特點(diǎn)2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予兩名美國(guó)科學(xué)家安德魯·菲爾和克雷格·梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用RNA干擾的最大潛能在于它可以在幾天內(nèi)選擇性的關(guān)閉幾乎每一個(gè)基因，并且只是關(guān)閉特定的基因，因此它比以往任何一項(xiàng)技術(shù)都更適合用于：基因功能研究藥物靶基因篩選藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介-已有技術(shù)平臺(tái)和基因資源技術(shù)平臺(tái)：①高效siRNA化學(xué)合成技術(shù)平臺(tái)（2003年）；②基因作用靶點(diǎn)快速篩選技術(shù)平臺(tái)（2004年）；③藥物作用靶點(diǎn)快速篩選技術(shù)平臺(tái)（2004年）；④全長(zhǎng)基因克隆技術(shù)平臺(tái)（2004年）；⑤慢病毒、腺病毒、快病毒的構(gòu)建、包裝和純化技術(shù)平臺(tái)（2005年）；⑥siRNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)（2005年）；⑦病毒的shRNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)（2005年）；⑧穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)（2005年）⑨轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)（2006年）；基因資源：有一個(gè)由1800個(gè)RNA干擾載體；600個(gè)RNA干擾病毒載體；100多套工具載體；6000多個(gè)真核基因全長(zhǎng)CDS表達(dá)載體構(gòu)成的基因文庫(kù)。實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介-承擔(dān)國(guó)家科技部項(xiàng)目RNA單體生產(chǎn)及RNA固相合成：上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)(種子資金)（0341H1115）；RNA干擾藥物核心原料產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究：034319222，上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)(上海市2003年度重大科技攻關(guān)項(xiàng)目)；RNA干擾技術(shù)在乙型肝炎治療中應(yīng)用的研究：DZ19208，上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)(上海市2004年度重大科技攻關(guān)項(xiàng)目)；腦膠質(zhì)瘤增殖侵襲病理機(jī)制研究：863目標(biāo)導(dǎo)向研究項(xiàng)目（2007AA02Z483）；其他合作項(xiàng)目GENECHEMGENEDATABASE吉?jiǎng)P基因?yàn)槟峁┰赗NA干擾技術(shù)領(lǐng)域全方位的實(shí)驗(yàn)解決方案載體構(gòu)建shRNA病毒構(gòu)建Lentivirus化學(xué)合成siRNAH1-GFP-H1-RFP-U6-GFP-U6-RFP-U6-GFP-U6-RFP-Pre-designedsiRNAsValidatedsiRNALibrariesCustomsynthesisservice用戶使用吉?jiǎng)P產(chǎn)品或服務(wù)發(fā)表文章（近60篇）產(chǎn)品成果：作為基因功能研究的專業(yè)技術(shù)服務(wù)公司，吉?jiǎng)P基因?yàn)橹袊?guó)生命科學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家和醫(yī)藥企業(yè)提供了誠(chéng)信和優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。在過去的3年中，中國(guó)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家發(fā)表的國(guó)際高質(zhì)量科學(xué)論文中，已經(jīng)有30多篇使用了吉?jiǎng)P基因的產(chǎn)品和服務(wù)，代表性文章包括：KangJ,ShiY,XiangB,QuB,SuW,ZhuM,ZhangM,BaoG,WangF,ZhangX,YangR,FanF,ChenX,PeiG,andMaL.ANuclearFunctionofb-Arrestin1inGPCRSignaling:RegulationofHistoneAcetylationandGeneTranscription.

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（影響因子29）JiaY,ZhouJ,TaiY,andWangY.TRPCChannelsPromoteCerebellarGranuleNeuronSurvival,NatureNeuroscience,2007,10:559-567.（影響因子15）GaoJ,DuanB,WangDG,DengXH,ZhangGY,XuL,andXuTL.CouplingbetweenNMDAReceptorandAcid-SensingIonChannelContributestoIschemicNeuronalDeath.

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Takemori,H.,andXiongZ-Q.(2006).RequirementofTORC1forLate-PhaseLong-TermPotentiationintheHippocampus.

PLoSONE,2006,1:e16.LuoML,ShenXM,ZhangY,WeiF,XuX,CaiY,ZhangX,SunYT,ZhanQM,WuM,andWangMR.

AmplificationandOverexpressionofCTTN(EMS1)ContributetotheMetastasisofEsophagealSquamousCellCarcinomabyPromotingCellMigrationandAnoikisResistance.CancerResearch2006,66:11690-11699（影響因子7.6）TaoY,YanD,YangQ,ZengR,andWangY.LowK+PromotesNF-B/DNABindinginNeuronalApoptosisInducedbyK+Loss.Mol.CellBiol.,

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BlockageofIntermediate-Conductance-Ca2+-ActivatedK+ChannelsInhibitsProgressionofHumanEndometrialCancer.Oncogene

2007,doi:10.1038/sj.onc.1210308（影響因子6.8）ZhangY,ZhuW,WangYG,LiuXJ,JiaoL,LiuX,ZhangZH,LuCL,andHeC.InteractionofSH2-BbetawithRETisinvolvedinsignalingofGDNF-inducedneuriteoutgrowth.JCellSci.,2006,119:1666-1676.

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2005,280:4374-4382.（影響因子5.8）Tuschlrules:AAN19TT,NAN19NN,NARN17YNN,NANN17YNNOnlineDesignSoft:Sfold;siDirect;Dharmacon;Ambion;Qiagen,etc.siRNA設(shè)計(jì)關(guān)鍵要素-siRNA的自由能化學(xué)合成的siRNA特點(diǎn)：突出端為dN堿基，增加siRNA的RNase降解耐受性操作簡(jiǎn)潔實(shí)驗(yàn)在手時(shí)間短結(jié)果明確實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)多種嵌和體適合于：靶點(diǎn)篩選主要關(guān)心基因瞬時(shí)敲減結(jié)果得到實(shí)驗(yàn)作為vectorbasedRNAi結(jié)果的對(duì)照實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不適合于：對(duì)于轉(zhuǎn)染效率低于50%的細(xì)胞，化學(xué)合成siRNA不適合用于直接的敲減結(jié)果研究，但可以借用其他高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行靶點(diǎn)篩選；敲減結(jié)果的觀察需要持續(xù)72小時(shí)以上的；敲減的基因蛋白質(zhì)分子量大于100KD的，或者蛋白表達(dá)水平非常高的；特點(diǎn)：可以使用GFP，RFP等報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；可以使用抗生素篩選轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞；一次制備，可以重復(fù)使用；實(shí)驗(yàn)在DNA水平操作，對(duì)RNasefree環(huán)境要求相對(duì)寬松；VectorbasedshRNA可以通過簡(jiǎn)單的PCR方法轉(zhuǎn)接到病毒載體上；實(shí)驗(yàn)在手時(shí)間比較長(zhǎng)：長(zhǎng)鏈DNA合成中往往會(huì)引入錯(cuò)誤堿基；合成的單鏈由于自身可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，雙鏈退火要求的條件比較苛刻；發(fā)卡結(jié)構(gòu)影響測(cè)序結(jié)果，導(dǎo)致即便克隆進(jìn)載體也得不到正確的測(cè)序結(jié)果。適合于：敲減結(jié)果的觀察需要持續(xù)72小時(shí)以上，但仍然觀察瞬時(shí)敲減結(jié)果的轉(zhuǎn)染效率比較低，但可以通過加抗生素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)；不適合于：對(duì)于代謝水平比較低的細(xì)胞，vectorbasedshRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄水平低而導(dǎo)致shRNA不工作；敲減結(jié)果的觀察需要持續(xù)10天以上的；最好不用于靶點(diǎn)篩選，特別是在外源基因靶點(diǎn)篩選系統(tǒng)中的篩選；siRNA表達(dá)載體不同載體適合不同研究需要瞬時(shí)表達(dá)載體適合于較長(zhǎng)時(shí)間基因抑制作用的研究，不同抗性和不同報(bào)告基因，可實(shí)現(xiàn)不同基因在同一細(xì)胞的協(xié)同抑制研究；可誘導(dǎo)載體利用四黃素類似物開關(guān)對(duì)目的基因的抑制；腺病毒載體適合于在不同細(xì)胞類型中研究同一基因RNAi結(jié)果反轉(zhuǎn)錄病毒載體提供一種可整合的，穩(wěn)定的基因抑制研究手段慢病毒載體提供一種可整合的，并且可以感染分裂和非分裂細(xì)胞，穩(wěn)定的基因抑制研究手段。GeneChemRNAi病毒系統(tǒng)慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性，作為基因治療載體發(fā)展起來(lái)，最近已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備。利用慢病毒構(gòu)建的shRNA載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的shRNA相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，lentivirus－shRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。GeneChemLentivirus

system不同病毒系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)（Adenovirus）慢病毒表達(dá)系統(tǒng)（Lentivirus）森林腦炎病毒表達(dá)系統(tǒng)（SemlikiForestVirus）病毒基因組雙鏈DNA病毒RNA病毒RNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂和非分裂細(xì)胞，能特異感染神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)豐度高水平表達(dá)中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間快（1-2天）慢

(2-4天

)快（6-8h）滴度滴度高達(dá)1012pfu/ml滴度最高可達(dá)108TU/ml滴度最高可達(dá)1011TU/ml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入不超過5kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性LentiviralVectorPromoterMarker用途U6GFP/RFPRNAinterferenceCMVGFPOverexpressionUbiquitinGFPOverexpressionSpecificpromoterLuciferase組織特異性promoter介導(dǎo)的基因表達(dá)低轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞的RNA干擾讓我們用心，換取您的放心！hepG2單克隆細(xì)胞株L02單克隆細(xì)胞株SMMC7721單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)特定RNA干擾片段的細(xì)胞讓我們用心，換取您的放心！Lentivirus用于腫瘤基因功能研究細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答、其他基因功能研究中InvivoRNAinterferenceRNA干擾實(shí)例體內(nèi)注射siRNA/shRNA/vshRNA電轉(zhuǎn)病毒感染體外灌注siRNA傳輸至特定靶細(xì)胞皮下注射靜脈灌注鼻腔給藥氣管給藥胚胎干細(xì)胞;肝細(xì)胞分離膜內(nèi),小腦,皮下,肌內(nèi)給藥RNAi載體質(zhì)粒測(cè)序中斷（包括常規(guī)的shRNA載體和病毒