引物二聚體的形成

什么是引物二聚體如何除去引物二聚體是引物的3'端間相互錯配擴增形成的。引物二聚體的出現(xiàn)是必定的，不過或多或少的問題，電泳時看不到引物二聚體帶也不代表沒有二聚體出現(xiàn)，不過含量低我們的肉眼看不到而已。提升PCR謹慎性(包含提升退火溫度，降低引物濃度等)可大大降低二聚體的濃度。減少PCR產物中引物二聚體的方法:1從引物自己著手，從頭設計引物，這是最根本解決這一問題的方法;2.可能模板有問題;模板濃度過小，適合加大模板量;酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度;4.取你所要加的上下游引物混淆后，在100攝氏度下的開水中煮5分鐘，而后迅速取出至于冰塊之上剎時冷卻，這時再加入反響系統(tǒng)中間，引物二聚體就會消失的;原由:引物可能會發(fā)生發(fā)夾構造,自己環(huán)化等構造,在100攝氏度下的開水中煮5分鐘可使引物變成單鏈，以減少二聚體?？墒怯腥艘詾樵赑CR儀上95度變性5min也相同達到目的，并且成功試過經過延長退火時間也能夠除去引物二聚體。5.所配MIX中加5%的甘油或許5%的DMSO，能夠加強特異性;反響系統(tǒng)的配制在冰長進行，最后加TAq酶，PCR結束后，產物勿擱置在室溫下過長時間，有人以為室溫下有些TAQ酶會將剩余的引物合成為二聚體。7.增添循環(huán)數(shù);8.降低退火溫度后有條帶，則應漸漸提升溫度，若提升溫度的同時產物量減少，則考慮增添鎂離子濃度(依據擴增片斷長度而定，片段長則相應鎂離子濃度應當高一些);9.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)仍是只有引物二聚體，并且鎂離子的濃度在20-25mmol/l沒有差別，則考慮Buffer等試劑沒有完好融解、混勻，致使汲取的試劑濃度不對。以上一次的PCR產物作模板二次PCR，能夠提升引物與模板的特異性，減少引物二聚體，假如兩次時間間隔短的話，能夠把原產物稀釋100－1000倍，假如間隔較長能夠稀釋50－100倍。反響成分問題：可能的原由

解決方法引物3’端互補引物長度很短引物濃度太高模板濃度太低

從頭設計引物增大引物長度降低引物濃度提升模板濃度反響條件問題：可能的原由

解決方法退火溫度不夠優(yōu)化循環(huán)數(shù)太多

優(yōu)化退火溫度減少循環(huán)數(shù)如何劃分引物二聚體與PCR產物（100kb）（1）．PCR產物的電泳檢測可能出現(xiàn)那些問題：一般為48h之內，有些最好于當天電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消逝。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反響的重點環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環(huán)條件。找尋原由亦應針對上述環(huán)節(jié)進行剖析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶克制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟掉過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不完全。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化辦理，模板核酸提取過程出了弊端，因此要配制有效而穩(wěn)固的消化辦理液，其程序亦應固定不宜任意更改。酶失活：需改換新酶，或新舊兩種酶同時使用，

以剖析能否因酶的活性喪失或不夠而

導致假陰性。需注意的是有時忘加

Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度能否對稱，

是PCR失敗或擴增條帶不

理想、簡單彌散的常有原由。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不單要看OD值，更要著重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，必定要有引物條帶出現(xiàn)，并且兩引物帶的亮度應大概一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位磋商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要均衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保留，防備多次凍融或長久放冰箱冷藏部分，致使引物變質降解無效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反響體積的改變：往常進行PCR擴增采納的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大概積進行PCR擴增，是依據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大概積時，必定要模索條件，不然簡單失敗。物理原由：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的聯(lián)合而降低PCR擴增效率。有時還有必需用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延長溫度，這也是PCR失敗的原由之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性聯(lián)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失掉互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更齊整，亮度更高。引物設計不適合：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因此在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列很短或引物很短，簡單出現(xiàn)假陽性。需從頭設計引物。靶序列或擴增產物的交錯污染：這類污染有兩種原由：一是整個基因組或大片段的交叉污染，致使假陽性。這類假陽性可用以下方法解決：①操作時應當心柔和，防備將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不可以耐高溫的物質外，全部試劑或器械均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍優(yōu)等均應一次性使用。③必需時，在加標本前，反響管和試劑用紫外線照耀，以損壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有必定的同源性?？上嗷テ唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產物，而致使假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減少或除去。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與估計的大小不一致，或大或小，或許同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原由：一是引物與靶序列不完好互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，常常一些根源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一根源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必需時從頭設計引物。②減低酶量或調動另一根源的酶。③降低引物量，適合增添模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適合提升退火溫度或采納二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延長)。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原由常常因為酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多惹起。其對策有：①減少酶量，或調動另一根源的酶。②減少dNTP的濃度。③適合降低Mg2+濃度。④增添模板量，減少循環(huán)次數(shù)。（2）。怎么鑒識引物二聚體和產物：1．及時定量PCRPCR可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反響結束以后，我們能夠經過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的剖析，也能夠經過對光密度掃描來進半定量的剖析。不論定性仍是半定量剖析，剖析的都是PCR終產物?？墒窃诤芏酄顩r下，我們所感興趣的是未經PCR信號放大以前的開端模板量。比如我們想知道某一特定基因在特定組織中的表達量。初期定量PCR技術需要特其他訓練，嚴格的測試和特別正確的加樣。初期定量PCR技術的難點主要在于：如何確立PCR正處于線性擴增范圍內（只有在此范圍內PCR產物信號才與初始模板的拷貝數(shù)成比率），為了保證線性，研究者要擴增一系列梯度稀釋的cDNA或許對每個基因的擴增循環(huán)數(shù)作適合的調整；在這類需求下熒光定量PCR技術應運而生。所謂的及時熒光定量PCR，其反響系統(tǒng)中，引入了一種熒光化學物質，跟著PCR反響的進行，PCR反響產物不停累計，熒光信號強度也等比率增添。每經過一個循環(huán)，采集一個熒光強度信號，這樣我們就能夠經過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，進而獲取一條熒光擴增曲線（如圖1）。一般而言，熒光擴增曲線能夠分三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩飾，我們沒法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增添。PCR的終產物量與開端模板量之間沒有線性關系，所以依據最后的PCR產物量不可以計算出開端DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產物量的對數(shù)值與開端模板量之間存在線性關系，我們能夠選擇在這個階段進行定量剖析。為了定量和比較的方便，在及時熒光定量PCR技術中引入了兩個特別重要的觀點：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它能夠設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意地點上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準誤差的10倍。每個反響管內的熒光信號抵達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）（如圖2所示）。定量熒光擴增曲線是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表。熒光閾值線的地點一般事實上位于減去本底的地點上，這時的熒光信號超出了熒光背景信號并且開始增添。對某相同品的C（t）值就定義為熒光量與熒光閾值線交錯時的循環(huán)數(shù)。CT值與開端模板的關系研究表示，每個模板的CT值與該模板的開端拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，開端拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知開端拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，此中橫坐標代表CT值，縱坐標代表開端拷貝數(shù)的對數(shù)（如圖3所示）。因些只需獲取未知樣品的CT值，即可從標準曲線上計算出該樣品的開端拷貝數(shù)。SYBRGreenⅠ熒光染料當前熒光及時定量PCR所使用的熒光化學方法主要有五種，分別是：內嵌染料（SYBRGreenⅠ）、雙標志探針、FRET探針、分子信標和Ampliflor。此中SYBRGreenⅠ染料法不需要設計合成序列特異性探針和新的引物對，是一種簡易，性價比較高的及時監(jiān)測方法，常常被用于進行

RNA表達相對定量以及

DNA定量研究中。SYBRGreenⅠ是一種聯(lián)合于小溝中的雙鏈

DNA聯(lián)合染料。與雙鏈

DNA聯(lián)合后，其熒光大大加強。這一性質使其用于擴增產物的檢測特別理想。SYBRGreenⅠ的最大汲取波長約為497nm，發(fā)射波長最大概為520nm。在PCR反響系統(tǒng)中，加入過度SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射強熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子僅有微弱熒光信號背景，進而保證熒光信號的增添與PCR產物的增添同步。SYBRGreenⅠ在核酸的及時檢測方面有好多長處，因為它與全部的雙鏈DNA相聯(lián)合，不用因為模板不同而特別定制，所以通用性好，且價錢相對較低。利用熒光染料能夠指示雙鏈DNA熔點的性質，經過熔點曲線剖析能夠辨別擴增產物和引物二聚體，因此能夠劃分非特異擴增。其他，因為一個

PCR產物能夠與多個分子的染料聯(lián)合，所以

SYBRGreenⅠ的檢測敏捷度很高?？墒?，因為

SYBRGreenⅠ與全部的雙鏈

DNA相聯(lián)合，所以由引物二聚體、單鏈二級構造以及錯誤的擴增產物惹起的假陽性會影響定量的精準性。經過丈量高升溫度后熒光的變化能夠幫助降低非特異產物的影響。由溶化曲線來剖析產物的均一性有助于更正確地剖析SYBRGreenⅠReal-TimePCR定量結果。在PCR結束后，我們能夠依據變性過程中的熒光值變化繪出每個樣品的溶化曲線。繪制熔解曲線時，Real-TimePCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品在從雙鏈完好配對到完好解鏈的升溫過和中熒光值的變化過程。不同的擴增產物因為其長度和GC含量不同而在不相同的溫度下解鏈，當產物解鏈時，SYBRGreenⅠ的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測到。由此繪制出熒光強度隨溫度變化的負一次倒數(shù)圖。熒光強度變化的拐點（熔點，Tm）即為溶化峰值。溶化曲線是擴增反響的質控門路，當圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異樣增寬，表示實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增。熒光定量PCR技術的應用及時熒光定量PCR技術是DNA定量技術的一次飛騰。運用該項技術，我們能夠對DNA、RNA樣品進行定量和定性剖析。定量剖析包含絕對定量剖析和相對定是量剖析。前者能夠獲取某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者能夠對不同方式辦理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此以外我們不按期能夠對PCR產物或樣品進行定性剖析：比如利用溶化曲線剖析辨別擴增產物和引物二聚體。以劃分非特異擴增；利用特異性探針進行基因型剖析及SNP檢測等。當前及時熒光PCR技術已經被寬泛應用于基礎科學研究、臨床診療、疾病研究及藥物研發(fā)等領域。此中最主要的應用集中在以下幾個方面：1、比較經過不辦理樣本之間特定基因的表達差別（如藥物辦理、物理辦理、化學辦理等），及特定基因在不同相的表達差別。2、比較正常組織與病理組織中各樣

mRNA

表達量差別。3、考證基因芯片實驗結果。4、考證RNA擾亂實驗結果。2．DXY上的建議：1．能夠用非變性

PAGE膠電泳，應當能分開的，理論上說分辨率達到

1個堿基。能夠用非變性丙烯酰胺凝膠電泳進行分別判定

NA在丙烯酰胺凝膠中的有效分別范圍

:丙烯酰胺

(W/V):12%

有效分別范圍

(bp):40-20015%25-150電壓一般是1-8V/cm,6個小時后銀染即可分辨你的兩個片段2．能夠用%TAE的長膠，在30伏的電壓下（中號電泳槽），跑

16-20

小時是應當能夠分開的。3．用%的瓊脂糖就能分開，我們實驗室常常用它來分開相差

28bp

的片段，成效很好，看的很清楚，但有幾點要注意，緩沖液假如新配的，電壓100v跑10分鐘，接著50v跑一個半小時，到兩個小時。4．理論上用或許瓊脂糖應當都能夠分開，在電泳的時候電壓不適合太大，用40-50v跑上小時左右應當就能夠了。電壓加大到80v或許100v的時候固然節(jié)儉實驗時間，可是有時條

2帶的成效看起來就不是很好。還有就是仿佛你的

Marker

選擇的不好，即便電泳能夠分開兩Marker5．用聚丙烯酰胺跑垂直電泳。1。需要獨自的垂直電泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝膠。2，詳細的做法能夠到

生物谷網站，有詳盡的說明。3，你能夠用5%的瓊脂糖跑一下。6．建議你跑PCR的時候做個陰性比較，只加引物，電泳時看陰性比較引物二聚體的地點，以劃分擬定目的片段71bp條帶，或是電泳時直接加一空引物做比較1資料與方法1．1

標本人單核細胞系

U937，細胞密度

2×108/L，分比較組

(N)、辦理Ⅰ組

(T1)、辦理Ⅱ組

(T2)，N用

1640培育基及

10％胎牛血清培育，

T1用

IFN-γ104U/LLPS1

μ、g/LT2用

IFN-γ10U/LLPSl0μg/L分別刺激7h。1．2主要試劑與儀器TRIzol試劑(GIBCOBRL)、FluoroDD試劑盒(Genomyx)、SupersriptⅡ逆轉錄酶(GIBCOBRL)、AmpliTaqDNA聚合酶(GIBCOBRL)、RNase-freeDNaseI(Promega);GenomyxLR、GenomyxSC、DNAThermalCycler(PerkinElmer)1．3總RNA的制備按試劑盒供給的方法分別提取三種細胞的總

RNA，以

RNase-freeDNaseI(終濃度

80000U/L)除掉此中污染的

DNA，經甲醛變性凝膠電冰判定其完好性，并以紫外分光光度計檢

測其純度1．4mRNA差別顯示．1逆轉錄反響選擇錨定引物［T7(dT12)AP(anchoredprimers，AP)，序列為5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3，′此中M＝A／G／C．N＝A/G/C/T］，以總RNA為模板進行逆轉錄反響，每管反響系統(tǒng)以下：總RNAl．0μg,AP4pmol,70℃5min,加入50mmol/LTris-HCl,75mmol/LKCl,3mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,25，dNTPmix(1μmol/L∶1∶1∶1)，SuperScriptⅡ60Units，總反響系統(tǒng)20μ。l42℃5min，50℃50min，70℃15min。1．4．2熒光標志差別顯示PCR選用與逆轉錄引物序列相同的帶熒光物質標志的錨定引物［TMR-T7(dT12)AP］，隨機引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG，3')以逆轉錄產物為模板，進行

PCR反響。反響系統(tǒng)包含：

20mmol/LTris-HCl(pH8．4)

，50mmol/LKCl，3．75mmol/LMgCl2，逆轉錄產物物,0．35μmol/L3-錨定引物

3．0μl，50,AmpliTaq

μmol/LdNTPmix(1∶1∶1)，0．35μmol/L5'-隨機引Units，總反響系統(tǒng)10μl。95℃2min。94℃15s，50℃延長

30s，72℃7min。

2min，4個循環(huán)；

94℃

15s，60℃

30s，72℃

2min，25

個循環(huán)；

72℃1．4．3分別差別顯示片段配制5．6％變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0．25mm，大6133cmPCR40953000V100W55電泳4．5h。干膠后置于GenomyxSC掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSCprogram軟件剖析處理掃描結果。1．4．4回收差別條帶用AcquireSC軟件將差別條帶定位，用一次性手術刀片切割下所需條帶，置于30μl去離子水中，37℃水浴30～60min，備用。1．4．5差別條帶的再擴增以經上述辦理的回收據帶為模板，T7啟動子22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3')、反M13(-48)24-mer(5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3')為引物,進行再擴增反響：模板μl,20mmol/LTris-HCl(pH8．4)，50mmol/LKCl，1．5mmol/LMgCl2,20μ／molLdNTPmix(1∶1∶1∶1)，0．2μmol／LT7、0．2μmol/LM13-r，AmpliTaq1．0Units，總反響系統(tǒng)

20μl。反響條件同差別顯示

PCR。2結果2．1

總RNA的質量總RNA經DnaseI辦理，用1．0％甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28S、18S、5S條帶，且28S／18S約為2∶1(圖1)，表示RNA完好性好，無降解現(xiàn)象。N、T1、T2的OD260／OD280比值分別為1．92、1．83、1．98，表示樣品純度高。ResultoftotalRNAonformaldehyde-agarosegel2．2熒光標志mRNA差別顯示結果顯示每一泳道均有約50條大小不等的擴增產物，各組間比較見許多呈有無或強弱變的差別條帶，圖2中箭頭所示。

化2．3差別條帶再擴增取T2中約1．25Kb的條帶再擴增，結果見圖3。熒光標志差別顯示技術經過對引物設計、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標志物的改良，極大減少了上述不足。差別顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡并或非簡并的雙堿基錨定引物等多種種類，本實驗經過使用雙堿基錨定引物，將總mRNA集體分為12個亞群，這極大減小了每一錨定引物產生的第一條cDNA鏈的數(shù)目，不單可降低隨機引物的用量，更可降低DD產物的復雜性，使差示條帶在序列膠上易于分辨，進而傳統(tǒng)方法中常有的“重疊帶”現(xiàn)象減少。DD專用的隨機引物的特色為A+T與G+C含量近乎相等，且3’-端以G或C結尾，可增添DD擴增的效率。經過改變RT-PCR反響條件如底物濃度、延長時間等，差別片段的長度可達1．0～1．5kb(圖2)，因較長的cDNA片段簡單經過Northernblot進行剖析判定鑒識真假陽性克隆，且此中可供給更多的序列信息，故獲取大的片段擁有重要的意義。文件以為差別顯示居高不下的假陽性率實質上因再擴增所致［4］。往常，再擴增的引物與DD引物相同，本試驗將再擴增引物設計為T7(22-mer)與M13-r(24-mer)，此為在錨定引物的5’端和隨機引物的3'端分別增添的序列(本文方法中所列差別顯示引物序列的劃線部分)，這兩種根源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴增的時機。同時，

T7啟動子序列可直接用于體外轉錄合成

cRNA探針，為

cDNA片段的直接測序和判定(RPA或Northern剖析)供給了方便。用慣例的序列剖析膠進行分辨時,較長的cDNA片段常常擠在膠的上端而影響分辨率。操作改用5．6％的PAGE膠(聚丙烯酰胺)，減少膠的厚度(僅250μm)，經過提升電泳的電壓

本(3000V)及溫度

(55℃),可明顯提升分辨率。同位素標志存在曝光時間長、帶型不好，基本與相鄰的帶混淆、污染等弊端，質標志于錨定引物的5'端,可產生清楚、光亮、低背景的分辨成效，操作周期僅兩天。

將熒光物當前，DD技術己被寬泛應用于與疾病、衰老、生殖、生長發(fā)育、分化等生理［

5］、病理過程有關的未知表達基因的研究

,相信對揭露生物界基因表達調控的神秘將起重要的作用。軍隊“九五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助課題

(96M145)7．（附）：凝膠電泳程序：凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種.一、瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖凝膠電泳是一種特別簡易、迅速、最常用的分別純化和判定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物.依據瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖.低熔點瓊脂糖熔點為62～65℃，溶解后在37℃下保持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質粒與外源性DNA的迅速連結等.(一)凝膠濃度凝膠濃度的選擇依

DNA分子的大小而定

.瓊脂糖凝膠的濃度與

DNA分別范圍瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分別范圍(Kb)5～601～20107632(二)電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE與TPE緩沖容量高，DNA分別成效好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，簡單使DNA積淀.TAE緩沖容量低，但價錢較廉價，因此介紹采納TBE.緩沖液中的EDTA可螯合二價陽離子，進而克制DNA酶的活性，防備PCR擴增產物降解.10XTBE緩沖液的配制Tris鹼，108克EDTA，克硼酸，55克H2O至，1000ul(其PH應為～臨用時用水稀至(20倍稀釋.(三)核酸電泳的指示劑與染色劑1.指示劑:核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在%、1%、%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷徙率分別與1Kb、、和的雙鏈線性DNA片段大概相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1%和%瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和的雙鏈線性DNA大概相像.指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400構成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有①增添樣品密度，使其比重增添，以保證DNA平均沉入加樣孔內.②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可展望核酸電泳的速度和地點.③使樣品呈色，使加樣操作更方便.染色劑:核酸電泳后，需經染色后才能展現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色.溴化乙錠(ethidiumbromide，E是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光.依據狀況可在凝膠電泳液中加入終濃度為ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再察看.銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)固的復合物，而后用復原劑如甲醛使Ag+復原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.也用于瓊脂糖凝膠染色.其敏捷度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收.(四)電泳1.電泳裝置:電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等.2.電泳方法:(1)用蒸餾水將電泳槽和梳子沖刷潔凈.放在水平桌面上，并架好梳子.(2)依據核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段，可配制～

%濃度的瓊脂糖用于電泳

.3.配制電泳緩沖液

100ml

于三角燒瓶中，稱取必定量的瓊脂糖粉放入后開水鍋

或微波爐內加熱融化

.冷卻至

60℃(需要時可加入溴乙錠

)，倒入電泳槽中，待凝結

.4.向電泳槽中倒入，其量以沒過膠面

2mm

為宜，當心移去梳子

.如樣品孔內有

氣泡，應想法除掉

.5.在

DNA樣品中加入體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內

.6.接通電源，一般紅色為正極黑色為負極，牢記

DNA樣品由負極往正極泳動

(湊近加樣孔的一端為負

).電壓為

1-5V/cm(長度以兩個電極之間的距離計算

).7.依據指示劑泳動的地點，判斷能否停止電泳

.一般

200～400bp

的

PCR產物

50V

電壓，電泳

20～40min

即可.(3)溴化乙錠染色后，紫外儀上察看電泳帶及其地點，并與核酸分子量標準比較被擴增產物的大小.二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳適合分別判定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列剖析.其裝載的樣品量大，回收DNA純度高.長度僅相差%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分別.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參加下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交錯聯(lián)接而形成凝膠.聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分別范圍見表2.丙烯酰胺(%)有效分別范圍(bp)溴酚蘭*二甲苯青*100～200010046080～5006526060～4004516040～200307025～150156010～1001245*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷徙率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數(shù)目(bp).(一)資料1.電泳儀器:電泳儀，垂直電泳槽及其附件.%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml裝于棕色瓶內，4℃可保留二個月.%過硫酸銨過硫酰銨，1克加水至，10ml4℃可保留一周，-20℃可保留一個月.電泳緩沖液(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳依據分別DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠.1.按要求裝置好垂直電泳板，兩塊玻璃板的雙側及底部用

1%的瓊脂糖封邊，防備關閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出

.2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成

45～60℃角.3.按表

3配制所需

%濃度凝膠的毫升數(shù)

.4.加入

TEMED后，立刻混勻，慢慢倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液

體湊近溢出時為止.5.立刻插入適合的梳子，親密注意防備梳齒下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，而后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄露的時機.6.室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入緩沖液.7.當心取出梳子，立刻用緩沖液沖刷加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合，產生不規(guī)則的表面，將致使此后DNA電泳帶型不規(guī)則

.8.將DNA樣品與適當?shù)妮d樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內，加樣時不9.接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳.

要產生氣泡

.10.依據指示劑遷徙地點來判斷能否停止電泳

.11.電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，當心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上.浸入含ml的溴化乙錠溶液中，15～30min后取出水洗紫外儀下察看結果.