沙門氏菌檢驗詳細流程課件

GB4789.4-2010

食品安全國家標準

食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗

-GB4789.4-2010

食品安全國家標準

食品微生物學(xué)1沙門菌概況沙門菌是1885年由Salmon氏等在豬霍亂流行時，分離出的豬霍亂沙門菌，由于Salmon氏對本屬細菌的發(fā)現(xiàn)貢獻卓越，故定名為沙門菌屬。沙門菌屬是腸桿菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原結(jié)構(gòu)、生化特性相似的革蘭氏陰性桿菌。血清型繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的沙氏菌有2500多個血清型和變種。我國發(fā)現(xiàn)的有250多個血清型。-沙門菌概況沙門菌是1885年由Salmon氏等在豬霍亂流行時2沙門菌的分類根據(jù)生化反應(yīng)不同，分為2個種：腸道沙門菌（Samonellaenterica）： Ⅰ腸道亞種（subsp.enterica）Ⅱ薩拉姆亞種

（subsp.salamae）Ⅲ亞利桑那亞種（subsp.arizonae）

Ⅳ豪頓亞種（subsp.houtenae）Ⅵ因迪卡亞種（subsp.indica）邦戈爾沙門菌（Samonellabongori）Ⅴ

-沙門菌的分類根據(jù)生化反應(yīng)不同，分為2個種：-3沙門菌種和亞種的鑒別項目腸道沙門菌邦戈爾沙門菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ衛(wèi)矛醇＋＋－－－＋山梨醇＋＋＋＋－＋水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－－＋丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋－＋注：+為陽性-為陰性-沙門菌種和亞種的鑒別項目腸道沙門菌邦戈爾沙門菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ衛(wèi)4沙門氏菌的血清分型迄今為止沙門氏菌有57個O抗原116個H抗原Vi抗原

被分成2500多個血清型。Vi抗原O抗原H抗原-沙門氏菌的血清分型迄今為止沙門氏菌有Vi抗原O抗原H抗原-5沙門氏菌命名與書寫方式目前的命名方法規(guī)定：腸道沙門菌腸道亞種（亞種Ⅰ）給予專用名，并采用標本分離地址的地名。菌名的第一個字母需大寫，且亞種Ⅰ的所用菌名不能用斜體。例如：腸道沙門菌鼠傷寒血清型應(yīng)書寫為Salmonellaentericasubsp.entericaserotypeTyphimurium，但在實際工作中，可簡寫為S.Typhimurium。其他沙門氏菌均不給專用名，只在亞種數(shù)字名后直接書寫抗原式，比如S.Ⅴ66:z35:-新的血清型名稱的批準必須有巴斯德研究所、德國漢堡衛(wèi)生研究所及美國CDC3個實驗室的一致同意。-沙門氏菌命名與書寫方式目前的命名方法規(guī)定：-6沙門氏菌檢驗程序-沙門氏菌檢驗程序-7目的：修復(fù)損傷的細菌細胞；方法：25g（mL）樣品＋225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)。于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。前增菌-目的：修復(fù)損傷的細菌細胞；前增菌-8無菌均質(zhì)袋-無菌均質(zhì)袋-9輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi),于42±1℃培養(yǎng)18～24h。同時,另取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi),于36±1℃培養(yǎng)18～24h。分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán),劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或顯色培養(yǎng)基平板）。于36±1℃分別培養(yǎng)18～24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、顯色培養(yǎng)基平板)或40h～48h(BS瓊脂平板)，觀察各個平板上生長的菌落。為了最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基。

選擇性增菌與分離-輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mL10分離培養(yǎng)基回收率測定（%）進口-SS65.3進口-SS81.0國產(chǎn)-SS52.0進口-HE83.2國產(chǎn)-HE80.0進口-XLD83.0國產(chǎn)-XLD86.2進口-BS106.6國產(chǎn)-BS77.7CHRO顯色68.4國產(chǎn)-DHL98.4國產(chǎn)-WS71.6TSA（對照）100.0-分離培養(yǎng)基回收率測定（%）進口-SS65.3進口-SS8111典型菌落--BS

菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變。國產(chǎn)BS進口BS-典型菌落--BS菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色12典型菌落--HE國產(chǎn)HE進口HE藍綠色或藍色,多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色。-典型菌落--HE國產(chǎn)HE進口HE藍綠色或藍色,多數(shù)菌落中心13典型菌落--XLD進口XLD國產(chǎn)XLD菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心-典型菌落--XLD進口XLD國產(chǎn)XLD菌落呈粉紅色，帶或不帶14初篩微生物菌落顏色特異性靈敏度沙門氏菌紫色(直徑約1mm)89％100%檸檬酸桿菌屬藍色(直徑約1mm)---變形桿菌無色或被抑制---(銅綠假單胞菌也呈紫紅色，可以通過前增菌排除。所以推薦在檢測中的前增菌用TTB。粉紅色、深紅色、干燥菌落、邊緣鋸齒狀等均非沙門氏菌菌落。）-初篩微生物菌落顏色特異性靈敏度沙門氏菌紫色(直徑約1mm)815生化試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，分別接種三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板；取菌落一部分于斜面劃線后穿刺底層。接種針在接種TSI后不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。-生化試驗自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，16穿刺TSI方法-穿刺TSI方法-17接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,必要時可延長至48h。將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復(fù)查。-接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白18沙門氏菌屬的三糖鐵和賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果

三糖鐵瓊脂

賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

初步判斷

斜面

底層

產(chǎn)氣

硫化氫

-+＋（－）

＋（－）

＋可疑沙門氏菌屬

-+＋（－）

＋（－）

－可疑沙門氏菌屬

++＋（－）

＋（－）

＋可疑沙門氏菌屬

++＋/－

＋/－

－非沙門氏菌

注：＋陽性，－陰性；＋（－）多數(shù)陽性,少數(shù)陰性；＋/－陽性或陰性。

該表顯示：只有在三糖鐵斜面產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸；同時賴氨酸陰性的菌株可排除。其他反應(yīng)結(jié)果均有沙門菌屬的可能，同時也均有不是沙門菌的可能。-沙門氏菌屬的三糖鐵和賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果

斜面底層19TSI的反應(yīng)賴氨酸脫羧酶試驗-TSI的反應(yīng)20沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

反應(yīng)序號

硫化氫

（H2S）

靛基質(zhì)

pH7.2尿素

氰化鉀

（KCN）

賴氨酸脫羧酶

A1＋

－

－

－

＋

A2＋

＋

－

－

＋

A3－

－

－

－

＋/－

注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。

反應(yīng)序號A1：為典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常,按下表可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。

-沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）21沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

pH7.2尿素

氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶

判

定

結(jié)

果

－

－

－

甲型副傷寒沙門氏菌(要求血清學(xué)鑒定結(jié)果)－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)＋－＋沙門氏菌個別變體(要求血清學(xué)鑒定結(jié)果)注：＋表示陽性；＋表示陰性。

反應(yīng)序號2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門菌靛基質(zhì)陽性變體兩項結(jié)果均為陽性；反應(yīng)序號3：補做ONPG，ONPG陰性，同時賴氨酸脫羧酶陽性為沙門菌；但甲型副傷寒沙門菌賴氨酸脫羧酶為陰性。-沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀(K22沙門氏菌屬各生化群的鑒別

必要時按此表進行沙門菌生化群鑒定

項

目

ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇

＋

＋

－

－

＋

－

山梨醇＋＋＋＋＋－水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示陽性;－表示陰性。

-沙門氏菌屬各生化群的鑒別

必要時按此表進行沙門菌生化群鑒定23沙門菌的其他鑒定API20EVITEK32GNI＋卡片-沙門菌的其他鑒定API20E-24沙門菌的血清學(xué)鑒定培養(yǎng)基：一般使用新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面作純培養(yǎng)，取斜面上部培養(yǎng)物作O抗原玻片凝集試驗，下部凝結(jié)水里的培養(yǎng)物作H抗原。H抗原的位相誘導(dǎo)試驗制備半固體瓊脂，融化完全分裝10ml/管，121℃滅菌15分鐘，冷至50℃?zhèn)溆?。取誘導(dǎo)用血清1滴加到小平皿中，傾入冷至50℃的10ml半固體瓊脂，輕輕搖勻，凝固。將培養(yǎng)物接種到平板的中央，放入濕盒中培養(yǎng)過夜。取邊緣的菌進行H抗原的檢測。-沙門菌的血清學(xué)鑒定培養(yǎng)基：一般使用新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面作純培養(yǎng)，25血清學(xué)鑒定時的注意要點：做血清凝集時，同時應(yīng)用生理鹽水做對照。O血清不凝集時，可將菌株轉(zhuǎn)接于瓊脂量較高(如2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反應(yīng)時，應(yīng)挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成菌懸液。煮沸后再檢查。(常見于傷寒沙門菌)。有極少數(shù)的二相沙門菌會同時出現(xiàn)2相H抗原，也有一些沙門氏菌在培養(yǎng)過程中H抗原會出現(xiàn)第1項和第2項之間的轉(zhuǎn)變，所以血清誘導(dǎo)實驗要用新鮮的培養(yǎng)物進行誘導(dǎo)。-血清學(xué)鑒定時的注意要點：-26謝謝大家!-謝謝大家!-27GB4789.4-2010

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食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗

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食品微生物學(xué)28沙門菌概況沙門菌是1885年由Salmon氏等在豬霍亂流行時，分離出的豬霍亂沙門菌，由于Salmon氏對本屬細菌的發(fā)現(xiàn)貢獻卓越，故定名為沙門菌屬。沙門菌屬是腸桿菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原結(jié)構(gòu)、生化特性相似的革蘭氏陰性桿菌。血清型繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的沙氏菌有2500多個血清型和變種。我國發(fā)現(xiàn)的有250多個血清型。-沙門菌概況沙門菌是1885年由Salmon氏等在豬霍亂流行時29沙門菌的分類根據(jù)生化反應(yīng)不同，分為2個種：腸道沙門菌（Samonellaenterica）： Ⅰ腸道亞種（subsp.enterica）Ⅱ薩拉姆亞種

（subsp.salamae）Ⅲ亞利桑那亞種（subsp.arizonae）

Ⅳ豪頓亞種（subsp.houtenae）Ⅵ因迪卡亞種（subsp.indica）邦戈爾沙門菌（Samonellabongori）Ⅴ

-沙門菌的分類根據(jù)生化反應(yīng)不同，分為2個種：-30沙門菌種和亞種的鑒別項目腸道沙門菌邦戈爾沙門菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ衛(wèi)矛醇＋＋－－－＋山梨醇＋＋＋＋－＋水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－－＋丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋－＋注：+為陽性-為陰性-沙門菌種和亞種的鑒別項目腸道沙門菌邦戈爾沙門菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ衛(wèi)31沙門氏菌的血清分型迄今為止沙門氏菌有57個O抗原116個H抗原Vi抗原

被分成2500多個血清型。Vi抗原O抗原H抗原-沙門氏菌的血清分型迄今為止沙門氏菌有Vi抗原O抗原H抗原-32沙門氏菌命名與書寫方式目前的命名方法規(guī)定：腸道沙門菌腸道亞種（亞種Ⅰ）給予專用名，并采用標本分離地址的地名。菌名的第一個字母需大寫，且亞種Ⅰ的所用菌名不能用斜體。例如：腸道沙門菌鼠傷寒血清型應(yīng)書寫為Salmonellaentericasubsp.entericaserotypeTyphimurium，但在實際工作中，可簡寫為S.Typhimurium。其他沙門氏菌均不給專用名，只在亞種數(shù)字名后直接書寫抗原式，比如S.Ⅴ66:z35:-新的血清型名稱的批準必須有巴斯德研究所、德國漢堡衛(wèi)生研究所及美國CDC3個實驗室的一致同意。-沙門氏菌命名與書寫方式目前的命名方法規(guī)定：-33沙門氏菌檢驗程序-沙門氏菌檢驗程序-34目的：修復(fù)損傷的細菌細胞；方法：25g（mL）樣品＋225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)。于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。前增菌-目的：修復(fù)損傷的細菌細胞；前增菌-35無菌均質(zhì)袋-無菌均質(zhì)袋-36輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi),于42±1℃培養(yǎng)18～24h。同時,另取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi),于36±1℃培養(yǎng)18～24h。分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán),劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或顯色培養(yǎng)基平板）。于36±1℃分別培養(yǎng)18～24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、顯色培養(yǎng)基平板)或40h～48h(BS瓊脂平板)，觀察各個平板上生長的菌落。為了最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基。

選擇性增菌與分離-輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mL37分離培養(yǎng)基回收率測定（%）進口-SS65.3進口-SS81.0國產(chǎn)-SS52.0進口-HE83.2國產(chǎn)-HE80.0進口-XLD83.0國產(chǎn)-XLD86.2進口-BS106.6國產(chǎn)-BS77.7CHRO顯色68.4國產(chǎn)-DHL98.4國產(chǎn)-WS71.6TSA（對照）100.0-分離培養(yǎng)基回收率測定（%）進口-SS65.3進口-SS8138典型菌落--BS

菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變。國產(chǎn)BS進口BS-典型菌落--BS菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色39典型菌落--HE國產(chǎn)HE進口HE藍綠色或藍色,多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色。-典型菌落--HE國產(chǎn)HE進口HE藍綠色或藍色,多數(shù)菌落中心40典型菌落--XLD進口XLD國產(chǎn)XLD菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心-典型菌落--XLD進口XLD國產(chǎn)XLD菌落呈粉紅色，帶或不帶41初篩微生物菌落顏色特異性靈敏度沙門氏菌紫色(直徑約1mm)89％100%檸檬酸桿菌屬藍色(直徑約1mm)---變形桿菌無色或被抑制---(銅綠假單胞菌也呈紫紅色，可以通過前增菌排除。所以推薦在檢測中的前增菌用TTB。粉紅色、深紅色、干燥菌落、邊緣鋸齒狀等均非沙門氏菌菌落。）-初篩微生物菌落顏色特異性靈敏度沙門氏菌紫色(直徑約1mm)842生化試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，分別接種三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板；取菌落一部分于斜面劃線后穿刺底層。接種針在接種TSI后不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。-生化試驗自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，43穿刺TSI方法-穿刺TSI方法-44接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,必要時可延長至48h。將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復(fù)查。-接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白45沙門氏菌屬的三糖鐵和賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果

三糖鐵瓊脂

賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

初步判斷

斜面

底層

產(chǎn)氣

硫化氫

-+＋（－）

＋（－）

＋可疑沙門氏菌屬

-+＋（－）

＋（－）

－可疑沙門氏菌屬

++＋（－）

＋（－）

＋可疑沙門氏菌屬

++＋/－

＋/－

－非沙門氏菌

注：＋陽性，－陰性；＋（－）多數(shù)陽性,少數(shù)陰性；＋/－陽性或陰性。

該表顯示：只有在三糖鐵斜面產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸；同時賴氨酸陰性的菌株可排除。其他反應(yīng)結(jié)果均有沙門菌屬的可能，同時也均有不是沙門菌的可能。-沙門氏菌屬的三糖鐵和賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果

斜面底層46TSI的反應(yīng)賴氨酸脫羧酶試驗-TSI的反應(yīng)47沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

反應(yīng)序號

硫化氫

（H2S）

靛基質(zhì)

pH7.2尿素

氰化鉀

（KCN）

賴氨酸脫羧酶

A1＋

－

－

－

＋

A2＋

＋

－

－

＋

A3－

－

－

－

＋/－

注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。

反應(yīng)序號A1：為典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常,按下表可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。

-沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）48沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

pH7.2尿素

氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶

判

定

結(jié)

果

－

－

－

甲型副傷寒沙門氏菌(要求血清學(xué)鑒定結(jié)果)－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)＋－＋