bFGF和VEGF的理解,朱中松

bFGF和VEGF在腫瘤血管新生中具有協(xié)同作用，怎樣的協(xié)同作用？bFGF/VEGF復(fù)合肽的發(fā)酵生產(chǎn)？3.可溶性表達？如何獲得可溶性表達？包涵體表達，通過復(fù)性的方法獲得有活性的目的蛋小鼠的品系：C57BL/6J小鼠，BALB/c小鼠，豚鼠腫瘤的品系：B16黑色素瘤，Lewis肺癌模型，HM7結(jié)腸癌發(fā)酵條件，M9培養(yǎng)基SDS電泳圖灰度掃描分析抑制血管新生因子？bFGF的肝素結(jié)合區(qū)、受體結(jié)合區(qū)、核轉(zhuǎn)位區(qū)？bFGF促進成纖維細胞，內(nèi)皮細胞的增殖，促進VEGF的分泌，bFGF與bFGFR結(jié)合，各種蛋白酶及膠原酸分泌增加，與腫瘤轉(zhuǎn)移bFGF與腫瘤的耐藥性，增強，抗凋亡，對其他免疫細胞的負影響VEGF可促進血管通透性增加，使管內(nèi)纖維蛋白原等血漿蛋白外滲，為內(nèi)皮細胞遷移、新生毛細血管網(wǎng)的建立提供必要的基質(zhì)，促進血管的形成誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生間質(zhì)膠原酶和纖溶酶原激活物（PAS），有助于瘤細胞組織的脫落，Ley等【40】研究發(fā)現(xiàn)當bFGF和VEGF劑量在3:1比例時產(chǎn)生很強的協(xié)同效應(yīng)VEGF具有促進內(nèi)皮細胞增殖的作用，bFGF可以促進壁細胞增殖，VEGF促進內(nèi)皮細胞分泌細胞因子PDGF-BB增加，而bFGF促進壁細胞分泌PDGFRR受體增加，VEGF和bFGF協(xié)同作用，啟動PDGF-B-PDGFRR信號通路，使增殖的血管形成成熟的血管系統(tǒng)bFGF中分離出11肽，F(xiàn)REG（48-58）對于bFGF本身的二聚化具有重要作用，肝素結(jié)合區(qū)多肽產(chǎn)生抗bFGF的抗體，受體結(jié)合區(qū)多肽免疫小鼠并沒有效果富含精氨酸的6肽（RRKRRR）,VEGF，VEGF^外顯子6中分離出12肽單獨阻斷bFGF出現(xiàn)代償性VEGF表達升高【58】。因此同時阻斷bFGF和VEGF在腫瘤血管新生治療本實驗室前期向軍儉等【59］以抗-bFGF單克隆抗體GF22篩選噬菌體隨機七肽庫,獲得LP（P/L）GH（F/I）K抗原表位，用此序列的陽性噬菌體克隆免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)此序列模擬肽能誘導(dǎo)抗bFGF抗體反應(yīng)。2004年篩選獲得VEGF表位肽GWYYDAL和VASAVFYSALVE可以在體內(nèi)誘發(fā)高效價的VEGF抗體，噬菌體展示的VEGF7肽和12肽對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的生長有明顯的抑制作用。人工合成的7肽（GWYYDAL）呈劑量依賴性抑制VEGF誘導(dǎo)的促HUVEC增殖作用伍。，61】,但是在體內(nèi)試驗中，并未見篩選得到的模擬肽抑制腫瘤生長的作用。bFGF和VEGF的表位肽？bFGF、VEGF抗原表位生物信息學(xué)方法預(yù)測1.bFGF/VEGF復(fù)合肽基因工程菌可溶性發(fā)酵研究VBP4與VBP3將VBP3工程菌、VBP4工程菌和克隆有pET32a表達載體的ER2566菌株，對照菌液由于pET32a載體上本身帶有組氨酸標簽，表達的蛋白可以特異性的與Ni-NTA親和層析柱結(jié)合，有利于純化，雜帶：該蛋白也有組氨酸標簽，估計是由于在蛋白表達時從柔性Linker處意外終止，出現(xiàn)一個帶有一半表位肽的蛋白。本重組bFGF/VEGF復(fù)合肽還帶有Trx標簽，下一步實驗要將其切除，研究切除后的重組bFGF/VEGF復(fù)合肽是否仍具有較強的免疫原性，引起較強的抗體應(yīng)答?；蛘邔⑶谐齌rx標簽的重組bFGF/VEGF復(fù)合肽同F(xiàn)DA允許的載體KLH偶聯(lián)，分析其免疫原性。Ni-NTA柱親和層析后的樣品純度不夠達到藥用級別，還需進一步研究其純化方法，比如HPLC方法等，得到純度98%以上的蛋白，并對蛋白進行質(zhì)譜分析、肽圖分析和蛋白序列測定等。7.載體蛋白：BSA,KLH分支狀的多聚賴氨酸骨架上MAP抗體滴度是什么指標ELISACCK-8細胞抑制劃痕實驗5.HUVEC6.鼠的B16FO細胞7.Erk1/2和Akt信號通路腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤血管的生長VEGF家族共有5個成員(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF)⑷，在人體中分布也較為廣泛，人的肺、心臟及腎等組織中均可見VEGF的高表達。不同VEGF家族成員能與相應(yīng)的絡(luò)氨酸激酶受體結(jié)合，分別為 VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(kinasedomainregion,KDR)、VEGFR-3(Flt-4)。VEGF家族成員通過與其相應(yīng)受體結(jié)合，導(dǎo)致受體自身的磷酸化進行信號的傳導(dǎo)，進而發(fā)揮生物學(xué)功能。通過阻斷VEGF/VEGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而干擾、抑制腫瘤血管的新生抗VEGF家族受體抑制劑作為一種小分子酪氨酸的蛋白酶抑制劑，Sunitinib具有抑制VEGFR2、PDGFRp、FLT3和KIT信號通路傳導(dǎo)bFGF與組織修復(fù)，與組織纖維化bFGF誘導(dǎo)血管生成能力是VEGF的兩倍。另外，bFGF在腫瘤血管新生中的作用機制與VEGF-A通路完全不相同bFGF與FGFR1結(jié)合后能夠激活Src-ERK1/2的信號途徑，參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖，通過PI3K-Akt途徑參與腫瘤細胞的遷移和侵襲。bFGF能夠激活人MCF-7乳腺癌細胞MAPK/ERK信號通路的傳導(dǎo)，提高MMP-9轉(zhuǎn)錄活性，增強腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，bFGF誘導(dǎo)的血管新生是部分依賴于VEGF-A的激活和內(nèi)源性VEGF-A和VEGF-C的存在［36］。表位疫苗的設(shè)計涉及到多方面，包括抗原的選擇，表位的選擇、表位的組合以及載體的選擇等利用人類表皮生長因子受體2(HER-2)的B細胞表位及T細胞表位分別免疫兔子，均能得到高滴度的抗體通過研究bFGF衍生的肽FREG發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)REG能夠在體外及體內(nèi)實驗中有效抑制bFGF依賴性的血管生成，同時FREG能夠與PDGF-Ra相互作用，促進PDGF-Ra的磷酸化，從而在體外抑制平滑肌及腫瘤細胞的增殖及侵襲，抑制率高達70%腫瘤多表位疫苗是由多個限定腫瘤抗原特異性B細胞和T細胞表位構(gòu)成的，表位的篩選在表位疫苗的設(shè)計中具有重要作用，，篩選得到12個人HER-2的胞外域的B細胞表位，研究人員選擇其中的4個B細胞表位分別與麻疹病毒融合蛋白(MVF)T細胞表位(AA288-302)組合形成表位嵌合體疫苗，由于腫瘤多表位疫苗能夠?qū)細胞及B細胞表位精確定位