科研立項計劃書

科研立項計劃書科研立項計劃書科研立項計劃書科研立項計劃書編制僅供參考審核批準生效日期地址：電話：傳真:郵編:項目編號附件2：北京林業(yè)大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃創(chuàng)新訓練項目申請書項目名稱：栓皮櫟組培再生體系的構(gòu)建及原生質(zhì)體游離研究主持人：宋少宇專業(yè)年級生科10聯(lián)系電話：指導教師：王君職稱副教授學院生物科學與技術(shù)學院起止年月：2012年1月—2013年12月申請日期：2012年4月20日北京林業(yè)大學

一、項目基本情況項目簡介項目名稱栓皮櫟組培再生體系的構(gòu)建及原生質(zhì)體游離研究項目類別√理工農(nóng)類□經(jīng)管文法類申請經(jīng)費（元）30000起止年月2012年1月——2013年12月主持人姓名性別學號專業(yè)年級聯(lián)系電話電子郵箱宋少宇女7生科項目組其他成員姓名性別學號專業(yè)年級所在學院項目分工李昌磊男3生技10-2生物科學與技術(shù)學院組培再生體系研究曾青青女6生科10生物科學與技術(shù)學院組培再生體系研究郭倩女8林學10-1林學院原生質(zhì)體游離研究尚峰男男4生科10生物科學與技術(shù)學院原生質(zhì)體游離研究指導教師姓名性別年齡職稱職務所在學院王君男30副教授生物科學與技術(shù)學院研究方向林木倍性育種及細胞遺傳學聯(lián)系電話二、項目立項依據(jù)（一）項目研究意義（限300字）栓皮櫟（Quercusvaribilis）屬殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus），樹干通直，木材堅硬，抗腐蝕性強，樹皮、果實及葉片等均有重要經(jīng)濟價值，是重要的硬闊用材和軟木資源樹種；同時，其分布廣泛、適應性強，在維持地域生態(tài)平衡和生態(tài)系統(tǒng)恢復等方面具有重要作用。然而，由于生長緩慢、控制授粉和無性繁殖困難，栓皮櫟遺傳改良研究相對滯后，主要集中在優(yōu)樹選擇、種子園營建等方面，進一步加強栓皮櫟遺傳改良研究迫在眉睫。本項目以栓皮櫟實生苗莖段為外植體，誘導愈傷組織并分化，構(gòu)建再生體系；并在此基礎上，分別以無菌苗葉片和愈傷組織為材料，研究原生質(zhì)體游離條件，建立栓皮櫟葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體游離技術(shù)體系，為進一步開展栓皮櫟細胞工程途徑遺傳改良奠定基礎。（二）國、內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動態(tài)，并附主要參考文獻（限1000字）植物原生質(zhì)體為植物育種基礎研究和遺傳工程提供了一個方便的遺傳操作實驗系統(tǒng)。利用原生質(zhì)體可以進行細胞融合和體細胞雜交，是一種創(chuàng)造遠源雜種，獲得同源或異源三倍體、四倍體以及雙二倍體的新途徑（Puite,1992;Zengetal.,2006）；原生質(zhì)體又是植物基因工程的理想受體，可對外源基因、DNA片斷、細胞器、染色體捕獲創(chuàng)造一種新方法（Prolsetal.,1988;Puite,1992）。因此，開展植物原生質(zhì)體游離、培養(yǎng)和細胞融合研究有重要的理論和實踐意義。加強櫟樹原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)研究有望從細胞工程途徑取得櫟樹遺傳改良研究的突破。植物原生質(zhì)體游離最常用的方法是酶解法。用酶液分離原生質(zhì)體，與起始材料、酶解時間、酶液成分和濃度等有密切關(guān)系。原生質(zhì)體游離的起始材料通常采用由外植體誘導產(chǎn)生的愈傷組織、懸浮細胞、組織培養(yǎng)再生植株以及種子無菌萌發(fā)而來的葉片等。常用于木本植物原生質(zhì)體分離的酶類有纖維素酶（CellulaseR-10，CellulaseRs）、果膠酶（PectolaseY-23）、離析酶（MaerozymeR-10）、半纖維素酶（Hemicellulase）、崩潰酶（Driselase）等。不同植物，甚至同種植物的不同起始材料使用的酶的種類和濃度不盡相同。在山杏原生質(zhì)體分離時添加%半纖維素酶可明顯提高原生質(zhì)體產(chǎn)量，而山桃原生質(zhì)體分離時加入%半纖維素酶則對原生質(zhì)體產(chǎn)量無影響（馬鋒旺和李嘉瑞，1998，1999）。酶解處理所遵循的原則是利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時間獲得大量有活力的原生質(zhì)體(謝從華和柳俊，2004)。原生質(zhì)體分離時要求酶液和材料的比例合適才能有效分離原生質(zhì)體。一般葉片、子葉需要量少，胚性愈傷組織和懸浮細胞需要量稍大，每克材料用酶量在10-20mL。酶解時間長短與材料和酶液的種類和濃度有關(guān)。酶解時間太短，酶解不充分，原生質(zhì)體產(chǎn)量低;酶解時間太長，酶液會對原生質(zhì)體產(chǎn)生毒性，原生質(zhì)體有自溶現(xiàn)象，降低產(chǎn)量和活力(何業(yè)華等，1999)。光照可能損傷剛分離的原生質(zhì)體質(zhì)膜，造成原生質(zhì)體活力下降（謝從華和柳俊，2004），因此酶解過程通常在黑暗或弱光條件下進行。同時，酶解時輔以低速振蕩能有效提高原生質(zhì)體產(chǎn)量。在桃原生質(zhì)體分離中，30-50rpm低速振蕩酶解的原生質(zhì)體產(chǎn)量是靜置酶解的幾倍(Millsetal.,1994)。同時，為了保持原生質(zhì)體的活力和膜的穩(wěn)定性，酶液中常加入甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等糖類物質(zhì)作為穩(wěn)定劑來調(diào)節(jié)滲透壓。穩(wěn)定劑的使用濃度因植物材料的不同而異，一般為（朱至清，2003）。原生質(zhì)體在輕微高滲溶液中比在等滲溶液中更為穩(wěn)定，較高水平的滲透壓可以有效抑制原生質(zhì)體的破裂和出芽，但也可能影響原生質(zhì)體的分裂。目前有關(guān)櫟屬樹種原生質(zhì)體游離的研究較少，僅國外學者在美國紅櫟（Quercusrubra）、枹櫟（Quercusserrata）等樹種中有所報道，且原生質(zhì)體主要來源于根器官和胚胎發(fā)生細胞系（BrisonandLamant,1990;SasamotoandHosoi,1992），相關(guān)研究亟待深入。參考文獻[1]BrisonM,LamantA.CallusformationfromrootprotoplastsofQuercusrubraL.(redoak).PlantCellRep.,1990,9(3):139-142.[2]MillsD,HammerschlagFA.IsolationofcellsandprotoplastsfromleavesofinvitropropagatedPeach(Prunuspersica)plants.PlantCell,TissueandOrganCulture,1994,36:99-105.[3]ProlsM,TopferR,SchellJ,SteinbibH.Transientgeneexpressionintobaccoprotoplasts:I.TimecourseofCATappearance.PlantCellRep.,1988,7:221-224.[4]PuiteKJ.Progressinplantprotoplastresearch.Physiol.Plant,1992,85(2):403-410.[5]SasamotoH,HosoiY.CallusproliferationfromtheprotoplastsofembryogeniccellsofQuercusserrata.PlantCell,TissueandOrganCulture,1992,29(3):241-245.[6]ZengSH,ChenCW,HongL,LiuJH,DengXX.Invitroinduction,regenerationandanalysisofautotetraploidsderivedfromprotoplastsandcallustreatedwithcolchicineinCitrus.PlantCell,TissueandOrganCulture,2006.87(1):85-93.[7]何業(yè)華,胡芳名,謝碧霞,胡中沂,何鋼.棗樹原生質(zhì)體分離條件的研究.中南林學院學報,1999,19(l):20-23.[8]馬鋒旺,李嘉瑞.山桃原生質(zhì)體培養(yǎng)再生愈傷組織.山西農(nóng)業(yè)學報,1999,8(3):73-76.[9]馬鋒旺,李嘉瑞.山杏原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株.園藝學報,1998,25(3):224-229.[10]謝從華,柳俊.植物細胞工程.北京:高等教育出版社,2004.[11]朱至清.植物細胞工程.北京:化學工業(yè)出版社,2003.三、項目研究內(nèi)容（一）項目研究內(nèi)容（限600字）1、栓皮櫟愈傷組織的誘導和繼代研究分別以栓皮櫟無菌莖段、葉片和葉柄為材料，對愈傷組織誘導培養(yǎng)基的外源生長調(diào)節(jié)劑種類及配比進行篩選，誘導產(chǎn)生愈傷組織，并篩選適宜的愈傷組織繼代培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。2、栓皮櫟愈傷分化及植株再生研究以栓皮櫟愈傷組織為材料，篩選愈傷組織分化出芽的適宜培養(yǎng)基及其外源生長調(diào)節(jié)劑配比，并進一步開展生根適宜培養(yǎng)基的篩選，建立栓皮櫟植株組培再生技術(shù)體系。3、栓皮櫟葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體游離研究以栓皮櫟無菌苗葉片和愈傷組織為材料，開展栓皮櫟葉肉原生質(zhì)體和愈傷組織原生質(zhì)體游離的適宜預處理條件、酶種組合和適宜濃度、等滲劑濃度及酶解時間等相關(guān)技術(shù)條件研究，建立較為完善的栓皮櫟原生質(zhì)體游離技術(shù)體系。（二）項目研究擬解決的關(guān)鍵問題（限300字）栓皮櫟植株組培再生技術(shù)櫟樹無性繁殖困難，主要采用種子園技術(shù)生產(chǎn)良種，難以同時利用對優(yōu)良個體的加性和非加性效應，本研究通過建立栓皮櫟無菌體系和植株再生系統(tǒng)，解決無性繁殖技術(shù)關(guān)鍵問題的同時，為進一步開展體胚發(fā)生和基因工程育種研究奠定基礎。栓皮櫟葉肉及愈傷組織原生質(zhì)體游離技術(shù)利用原生質(zhì)體可以進行細胞融合和體細胞雜交，是一種創(chuàng)造遠源雜種，獲得同源或異源三倍體、四倍體以及雙二倍體的新途徑。本研究解決栓皮櫟原生質(zhì)體游離關(guān)鍵技術(shù)，建立栓皮櫟原生質(zhì)體游離技術(shù)體系，為進一步開展原生質(zhì)體培養(yǎng)，實現(xiàn)細胞工程育種突破奠定基礎。四、項目實施方案（一）項目研究擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案（限1000字）1、研究方案和技術(shù)路線本項目以栓皮櫟無菌莖段、葉片、葉柄等為材料，誘導產(chǎn)生愈傷組織，并通過篩選培養(yǎng)基誘導愈傷組織分化為芽和根，構(gòu)建再生體系；在此基礎之上，以無菌苗葉片和愈傷組織為材料，探索原生質(zhì)體游離條件，形成較為完善的栓皮櫟原生質(zhì)體游離技術(shù)體系。技術(shù)路線如下：愈傷組織繼代適宜培養(yǎng)基篩選愈傷組織繼代適宜培養(yǎng)基篩選愈傷組織分化出芽培養(yǎng)基篩選生根培養(yǎng)基篩選栓皮櫟植株再生體系建立栓皮櫟莖段外植體無菌體系消毒、滅菌、接種無菌莖段、葉片、葉柄無菌葉片和愈傷組織愈傷組織誘導適宜培養(yǎng)基篩選適宜預處理技術(shù)研究適宜酶種及濃度篩選適宜等滲劑濃度篩選適宜酶解時間研究栓皮櫟原生質(zhì)體游離技術(shù)體系2、研究方法（1）栓皮櫟外植體的接種和繼代培養(yǎng)采集栓皮櫟枝條水培，抽條后，切取含腋芽的幼嫩莖段做為外植體，依次經(jīng)滴露表面消毒5min，自來水沖洗30min，70%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，%HgCl2浸泡處理2min，無菌水沖洗3次的消毒過程后接入MS(Murashige和skoog，1962）附帶6-BAL的初始培養(yǎng)基。接種后每20至30天轉(zhuǎn)接一次，繼代培養(yǎng)基為MS附帶6-BAL，擴大無菌材料數(shù)量。（2）栓皮櫟愈傷組織的誘導采用正交試驗設計，分別以栓皮櫟無菌莖段、葉片和葉柄為材料，進行愈傷組織誘導培養(yǎng)基適宜激素種類及配比的篩選，以MS作為基本培養(yǎng)基，篩選因素包括細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度及配比，L9（34）正交試驗設計表如下：表2愈傷組織誘導培養(yǎng)基激素組合及濃度水平ElementLevel6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)2，4-D(mg·L-1)TDZ(mg·L-1)1000023（3）栓皮櫟愈傷組織分化及植株再生以栓皮櫟愈傷組織為材料，采用L9（34）正交實驗設計，以MS為基本培養(yǎng)基對愈傷組織分化為芽的培養(yǎng)激素配比進行篩選，試驗設計如下：表3愈傷組織分化培養(yǎng)基激素篩選試驗設計表ElementLevel6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)2,4-D(mg·L-1)TDZ(mg·L-1)1000023將愈傷組織分化形成的芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基對生根培養(yǎng)基激素配比進行篩選，設計如下：表4生根培養(yǎng)基激素篩選試驗設計表ElementLevel6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)100234（4）栓皮櫟葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體的游離分別以栓皮櫟無菌苗葉片和愈傷組織為材料，以正交實驗設計結(jié)合單因素實驗設計，采用酶解法，研究酶的種類與濃度、滲透壓穩(wěn)定劑濃度、酶解時間、預處理方法等因素對原生質(zhì)體分離效果的影響。將葉片或愈傷組織切成mm的細條或者碎塊，按照1:10的比例置于經(jīng)抽濾滅菌的含纖維素酶R-10、半纖維素酶、果膠酶Y-23和離析酶R-10的混合酶液中，在一定的溫度下、慢速往復式搖床上黑暗酶解。酶液為CPW鹽溶液加一定濃度的甘露醇，并附加MESg/L、BSA1g/L，pH為。酶解產(chǎn)物分別經(jīng)200目和400目不銹鋼濾網(wǎng)依次過濾，以除去未酶解完全的細胞團或組織，500r/min離心min收集，新鮮洗液洗滌3次，收集原生質(zhì)體。表5原生質(zhì)體分離酶種及濃度篩選L9(34)正交實驗設計表ElementLevelCellulaseR-10HemicellulasePectinaseY-23MacerozymeR-10100002%%%%33%%%%（5）原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力測定用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體產(chǎn)量，每個樣品計數(shù)重復5次，取平均值，最后計算原生質(zhì)體產(chǎn)量。原生質(zhì)體數(shù)（個/mL）=5個大格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)×5×10000×稀釋倍數(shù)；原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/g）=[原生質(zhì)體數(shù)（個/mL）×稀釋后體積（mL）]/葉片總質(zhì)量（g）；原生質(zhì)體產(chǎn)量遵從泊松分布，應該對獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量試驗數(shù)據(jù)進行平方根轉(zhuǎn)換后，應用MicrosoftExcel軟件進行統(tǒng)計分析。原生質(zhì)體活力測定用%二乙酸熒光素（FDA）染色。每個樣品觀測5次取平均值，統(tǒng)計原生質(zhì)體活力。原生質(zhì)體活力=(發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100%。（6）數(shù)據(jù)處理主要采用方差分析對數(shù)據(jù)處理進行處理，其中涉及百分率的數(shù)據(jù)在方差處理前進行反正弦平方根轉(zhuǎn)換。（二）項目實施年度計劃二〇一二年①2012年1～4月，采集栓皮櫟外植體，接種獲得無菌苗；②2012年5～10月，栓皮櫟愈傷組織誘導研究；③2012年11～12月，數(shù)據(jù)整理。二〇一三年①2013年1～4月，栓皮櫟葉肉原生質(zhì)體的游離技術(shù)研究；②2013年2～7月，栓皮櫟愈傷組織分化及植株再生研究；③2013年6～10月，栓皮櫟愈傷組織原生質(zhì)體游離技術(shù)研究；④2013年11～12月，整理試驗結(jié)果，撰寫研究論文和總結(jié)報告。二〇一四年五、項目研究基礎（一）與本項目有關(guān)的研究積累和已取得的成績（限300字）本項目申請者及項目組成員均為生物學院生物科學和生物技術(shù)專業(yè)10級學生，已主修了《植物學》、《植物組織培養(yǎng)》等相關(guān)專業(yè)基礎課程，通過查閱文獻資料進一步學習，對植物生物技術(shù)研究有了較為全面的認識，且項目組成員已開展植物組織培養(yǎng)相關(guān)研究較長時間，較為熟練的掌握了基本操作技能。指導教師及其課題組長期從事林木遺傳改良研究，在新疆楊等楊屬樹種中已系統(tǒng)開展組織培養(yǎng)及原生質(zhì)體游離與純化方面研究，發(fā)表學術(shù)論文一篇，具有豐富的研究經(jīng)驗和知識儲備。該項目前期試驗已有所開展，已通過接種栓皮櫟外植體獲得了無菌材料，為本項目的進一步實施奠定了基礎。目前正在進一步擴繁栓皮櫟莖段。（二）已具備的研究條件、設備條件等（限200字）本項目依托北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室和林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，相關(guān)試驗主要在北京林業(yè)大學分析測試中心生物技術(shù)室開展，實驗室有關(guān)植物組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體游離、顯微觀察等試驗條件和設備較為完善，可基本滿足項目研究需求。（三）尚缺少的條件及解決方法（限200字）本項目試驗條件尚缺少1000μL和200μL微量移液器各1把用于培養(yǎng)基的配制和原生質(zhì)體的游離、國產(chǎn)大容量低速離心機1臺用于原生質(zhì)體的收集，擬通過購置的方式解決。六、項目特色、創(chuàng)新點及預期成果（一）項目的特色與創(chuàng)新點（限300字）1、研究思路科學：本項目基于栓皮櫟無菌再生體系研究，分別利用研究過程中獲得的無菌葉片和愈傷組織開展原生質(zhì)體游離技術(shù)探索，步步深入，思路科學。2、研究材料重要：栓皮櫟木材堅硬，抗腐蝕性強，是重要的硬闊用材和軟木資源樹種；其分布廣泛、適應性強，在維持地域生態(tài)平衡和生態(tài)系統(tǒng)恢復等方面具有作用巨大。3、研究方法新穎：植物原生質(zhì)體為植物育種和遺傳工程研究提供了理想的遺傳操作實驗系統(tǒng)。本項目在國內(nèi)首次開展櫟樹原生質(zhì)體游離技術(shù)研究，有望從細胞工程途徑突破櫟樹遺傳改良研究進展。4、理論聯(lián)系實際：栓皮櫟無性繁殖困難，遺傳改良程度低，本項目的實施有望從組培快繁途徑實現(xiàn)無性繁殖，并為進一步開展細胞工程育種奠定基礎。（二）項目預期成果及成果提交方式（限300字）構(gòu)建并優(yōu)化栓皮櫟組培再生體系；建立較為完善的栓皮櫟原生質(zhì)體游離技術(shù)體系；提交北京林業(yè)大學國家級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目結(jié)題報告；發(fā)表中文核心