現代分子技術在食品檢測中的應用課件

現代分子技術在食品檢測

中的應用主要內容1PCR技術及其在食品檢測中的應用2生物傳感器及其在食品檢測中的應用3基因芯片及其在食品檢測中的應用1PCR技術及其在食品檢測

中的應用1953年沃森（Waston)和克里克（Crick)對威爾金斯（MauriceWilkins)DNA的X-射線衍射圖分析發(fā)現了DNA的雙螺旋結構，奠定了現代分子生物研究的基礎。他們3人因此獲得了1962年的諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應示意圖(e)(f)(g)溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。ReactionConditionforaTypicalPCRAssay檢測常用的PCR技術普通PCR技術巢式、半巢式PCR技術：是一種提高靈敏度的方法。通過設計兩對引物，其中一對引物結合的位點在另有所一對引物擴增的產物之中。多重PCR技術：設計一組引物，在一個PCR反應過程中，對多個目的片段進行擴增。實時熒光定量PCR(real—timequantitativepolymerasechainreaction，RQ-PCR)又稱熒光定量PCR：就在普通PCR儀的基礎上配備了一個激發(fā)和檢測的裝置，實時監(jiān)控PCR反應的進程。按照PCR反應的數學函數關系，結合相應的算法，加入相應的內對照，對待測樣品中的目標基因進行準確定量。具體步驟細菌的培養(yǎng)和基因組DNA的提取接種于EMB固體培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)，挑一單個菌落復接種到30ml相應增菌液內增菌，提取1ml菌液用甘油保存于-80℃?zhèn)溆谩?000r/min離心1min，收集沉淀。用細菌DNA提取試劑盒提取3種細菌DNA，用紫外分光光度計測定DNA濃度，分裝數管，-20℃保存?zhèn)溆谩位騊CR擴增及特異性和敏感性分析先對3種菌進行單獨擴增，反應體系：模板DNA，上、下游引物各1，dNTP，Taq酶，10×Taq酶bufer，MgC12溶液，其余用無菌的去離子水補足。PCR擴增條件：95℃變性3min，94℃變性50S、54℃退火50S、72℃延伸50s，共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產物在1.5％的凝膠上進行電泳。將3個PCR擴增產物進行回收，然后進行核苷酸序列測定，并與Genbank中發(fā)表的相應序列進行比較。PCR技術在食品檢測中的應用

1食品加工中外源DNA污染的檢測病原微生物的檢測摻假量的檢測2轉基因食品的檢測病原微生物的檢測常見食源性病原微生物的PCR檢測已有相應的商品試劑盒出售。表1是一些應用PCR技術檢測食物中病原微生物的成功例子。常見的食源性病原微生物的PCR檢測試劑盒主要有BioCon—trol公司的肉毒梭菌、大腸桿菌0157：H7、李斯特菌、沙門氏菌PCR檢測試劑盒(商品名Probelia)和Qual—icon公司的大腸桿菌0157：李斯特菌、沙門氏菌PCR檢測試劑盒(商品名BAX)等。大量研究表明，PCR技術在對食品中病原微生物的確證試驗方面與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比至少具有相同的靈敏度，而多數情況下則表現出更高的靈敏度，而且檢測周期大為縮短。Aabo等對96個碎肉樣品中自然污染的沙門氏菌進行檢測，結果表明，一種PCR檢測方法的檢出率達到0.92，而由于樣品本身所攜帶的菌群的干擾，傳統(tǒng)方法漏掉了很多陽性樣品，檢出率僅為0.50。摻假量的檢測由于DNA比蛋白質具有更高的熱穩(wěn)定性，與免疫學檢測技術相比，利用PCR分析時不需要特異性抗體。特異性抗體的制備時間遠遠長于合成引物所需要的時間，所以RQ-PCR就成了檢測食品摻假量的一種優(yōu)勢選擇。SandbergM等人利用RQ—PCR定量檢測谷物基因來控制那些缺乏麥麩的嬰兒食物。轉基因植物所采用的啟動予主要為來源于花揶菜花葉病毒的Camv35S啟動子、根瘤農桿菌的nos啟動子及玄參花葉病毒的FMV35s啟動子；廣泛應用的終止子分別來源于根瘤農桿菌的nos終止子、花揶菜花葉病毒的camv終止子以及新霉素磷酸轉移酶NPtⅡZ終止子。針對這些基因的PCR擴增可涵蓋95％的現有的轉基因植物的需要。因此通過檢測樣品是否含有特定啟動子、終止子或標志基因序列作為鑒別轉基因食品依據是一種可行方法。2生物傳感器及其在食品檢測中的應用生物傳感器是一種新興的生物技術產品，在分析領域中具有極大的發(fā)展?jié)摿颓熬?，它是由生物活性物質制成、制成的生物功能敏感元件，在配上適當的信號轉換器。生物活性物質包括酶、抗原、抗體、細胞器、完整細胞、激素、核酸等。生物傳感器具有結構緊湊、操作方便、檢測迅速、選擇性好、靈敏度高等特點，能夠從微量的試樣中測定其痕量物質。生物傳感器的分類按生物敏感材料的不同分為：酶傳感器，免疫傳感器，微生物傳感器，細胞傳感器等。按轉換器的不同分為：電化學生物傳感器，光生物傳感器，聲波生物傳感器，仿生傳感器，生物量傳感器等。按生物反應的基本原理分為：催化型和親和型生物傳感器。生物傳感器在食品檢測中的應用病原菌的檢測抗生素殘留的檢測毒素的檢測國內，盧智遠等人研制成一種能快速測定乳制品中細菌含量的電化學生物傳感器，實驗結果表明，該生物傳感器能有效的測定鮮奶中的微生物含量。蔡豪斌研制了一種電化學生物傳感器對大腸桿菌、啤酒酵母、霍亂弧菌及卡介菌苗的響應，并實際測量了發(fā)酵罐中啤酒酵母菌總數及消毒鮮牛奶中的細菌總數?？股貧埩舻臋z測β-內酰胺類抗生素(包括青霉素)常用來治療奶牛乳房炎，因此它是牛奶中最常見的抗生素殘留。2002年，Gustavsson等人用基于生物傳感器的表面等離子共振(SPR)設計了檢測牛奶中口一內酰胺類抗生素的實驗。他們將帶有羧肽酶活性的微生物受體蛋白用作探測分子，這種受體蛋白和抗體相比，其優(yōu)點是只能分辨出活性、完整的β-內酰胺結構。在β-內酰胺類抗生素存在時，受體蛋白和抗生素之間形成穩(wěn)定的復合物，抑制了蛋白酶的活性，從而可以通過酶活性的降低值，定性地檢測出牛奶中的青霉素G。這種方法的檢測極限為2.6μg／kg，低于歐洲4μg／kg的最大殘留限(MRL)。3基因芯片及其在食品檢測中的應用基因芯片(DNA芯片、DNA微陣列)技術是近十幾年來在生命科學領域迅速發(fā)展起來的一項高新技術，是一項基于基因表達和基因功能研究的革命性技術，他綜合了分子生物學、半導體微電子、激光、化學染料等領域的最新科學技術，在生命科學和信息科學之間架起了一道橋梁，是當今世界上高度交叉、高度綜合的前沿學科和研究熱點?；蛐酒夹g的基本原理將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面，微生物樣品DNA經PCR擴增后，制備熒光標記探針，然后再與芯片上的寡核苷酸點雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品靶分子的數量?；蛐酒谑称窓z測中的應用在食品微生物檢測中的應用在轉基因食品檢測中的應用在食品毒理學研究中的應用在食品微生物檢測中的應用DNA微陣列技術被廣泛用于食品的快速檢測，是因為DNA微陣列技術可以確定某種病原體污染的特異分子標志物，因為這些標志物建立在成千上萬個基因之上，即使檢測結果只有部分符合這些標志物也能反映病原體的一些特性，根據這些分子標志物而制造的商業(yè)化DNA微陣列可以快速靈敏地檢測出病原體。DNA微陣列中廣泛應用的標志基因是16SrRNA，此外還包括rpoB、recA、gyrB、groEL和atpD等基因。AngelikaLehner等利用DNA微陣列成功地從牛奶中檢測出Enterococcusfaecium和Enterococcusfaecalis。GeorgiosKeramas等設計的DNA微陣列3h可以檢測6-60fg的Campylobacter基因組，而且成功地檢測并區(qū)分兩個親緣關系非常近的Campylobacterjejuni和Campylobactercoli。MasafumiIkeda等從新鮮蔬菜中檢測出SalmonellaentericaserovarEnteri—tidis、Yersiniaenterocolitica和Bacilluscereus。DNA微陣列技術可以在不同的水平上檢測轉基因生物的生理和代謝上的變化。如UKFoodsStandardsAgency已建立了西紅柿成熟的不同階段的cDNA文庫，由此制造的微陣列不僅可以檢測基因表達的變化，而且還可以檢測一些部分相關的代謝途徑的激活與否。DNA微陣列技術不僅可以檢測轉基因食品自身基因表達。還可以用來檢測食用轉基因食品的人或動物的基因表達，從而為轉基因食品的安全評價提供更全面、更準確的依據。在食品毒理學研究中的應用飲食補充劑和一些微量元素的使用已成為一個趨勢．這些補充劑的功效、安全性和劑量有待進一步研究，飲食中的多種營養(yǎng)物和組分被認為具有化學預防或抗癌作用，可以降低癌癥和其他退行性疾病和衰老的發(fā)生。已有詳實證據表明VA、VC、VE和β-胡蘿卜素具有抗癌作用，然而一些具有化學預防作用的物質被大量食用時，會產生一