萌發(fā)進(jìn)程種子基本生物大分子含量變化及呼吸-光合作用調(diào)節(jié)

萌發(fā)進(jìn)程種子基本生物大分子含量變化及呼吸-光合作用調(diào)節(jié)目的要求學(xué)習(xí)和掌握從植物組織中提取蛋白質(zhì)、糖及核酸的原理和操作技術(shù)；學(xué)習(xí)和掌握蛋白質(zhì)、糖及核酸的含量檢測原理和基本方法；學(xué)習(xí)測定生物反應(yīng)進(jìn)程中的氣體含量變化相關(guān)反應(yīng)的研究、分析和測定方法生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。生物大分子的特點在于其表現(xiàn)出的各種生物活性和在生物新陳代謝中的作用。生物大分子大多數(shù)是由簡單的組成結(jié)構(gòu)聚合而成的，eg.蛋白質(zhì)的組成單位是氨基酸，核酸的組成單位是核苷酸。生物大分子都可以在生物體內(nèi)由簡單的結(jié)構(gòu)合成，也都可以在生物體內(nèi)經(jīng)過分解作用被分解為簡單結(jié)構(gòu)，一般在合成的過程中消耗能量，分解的過程中釋放能量。理論基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)

蛋白質(zhì)、核酸和多糖是3類主要的生物大分子，它們在分子結(jié)構(gòu)和生理功能上差別很大，然而，在以下幾個方面又顯出共性：在活細(xì)胞內(nèi)，生物大分子和相應(yīng)的生物小分子之間的互變，通常通過脫水縮合，或加水分解。蛋白質(zhì)鏈（或稱肽鏈）、核酸鏈和糖鏈都有方向性，盡管方向性的體現(xiàn)各不相同。蛋白質(zhì)、核酸和多糖分子都有各具特征的高級結(jié)構(gòu)，正確的高級結(jié)構(gòu)是生物大分子執(zhí)行其生物功能的必要前提。

在活細(xì)胞中，三類生物大分子密切配合，共同參與生命過程，甚至很多情況下形成生命活動必不可少的復(fù)合大分子，如核蛋白、糖蛋白。核苷酸氨基酸乙酰輔酶A+甘油丙酮酸蛋白質(zhì)核酸脂類糖類TCA循環(huán)理論基礎(chǔ)植物的光合作用動植物所需要的能量最終來源于——太陽光能，光能通過光合作用被生物體儲存成生物體所需的化學(xué)能。光合作用：生物體利用光能把CO2和H2O轉(zhuǎn)化成儲存能量的有機(jī)物并釋放O2的過程。植物、大多數(shù)藻類和藍(lán)藻可以進(jìn)行光合作用，它們被稱為光合自養(yǎng)生物。以藍(lán)藻為例不存在葉綠體這一細(xì)胞器。光合自養(yǎng)生物提供維持地球生物生存所需的大氣中的氧濃度、所有的有機(jī)化合物和大部分能量。光合作用的過程：色素分子可見光C52C3ADP+PiATP2H2OO24[H]多種酶酶(CH2O)CO2吸收光解能固定還原酶光反應(yīng)暗反應(yīng)植物的呼吸作用呼吸作用：細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量的過程。有氧呼吸的三個階段葡萄糖的初步分解C6H12O6酶2CH3COCOOH+4[H]+2ATP

（丙酮酸）場所：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)①丙酮酸徹底分解酶6CO2

+20[H]+2ATP場所：線粒體基質(zhì)②2CH3COCOOH（丙酮酸）[H]的氧化酶12H2O+34ATP場所：線粒體內(nèi)膜③24[H]+6O2+6H2O有氧呼吸：（1）主要場所——線粒體

（2）總反應(yīng)式：C6H12O6+6H2O+6O26CO2+12H2O+能量酶38ATP無氧呼吸第一階段：C6H12O62CH3COCOOH+4[H]+2ATP

（丙酮酸）酶場所：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)場所：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)第二階段：2CH3COCOOH+4[H]

（丙酮酸）酶2CO2+C2H5OH2C3H6O3無氧呼吸1.場所：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)2.總反應(yīng)式：C6H12O6C6H12O6酶酶2CO2+C2H5OH+2ATP2C3H6O3+2ATP(能量只來自第一階段)光合作用與呼吸作用的區(qū)別：光合作用呼吸作用原料CO2、H2OO2、葡萄糖等有機(jī)物產(chǎn)物O2、葡萄糖等有機(jī)物CO2、H2O等能量轉(zhuǎn)換貯藏能量的過程光能→活躍的化學(xué)能→穩(wěn)定的化學(xué)能釋放能量的過程穩(wěn)定的化學(xué)能→活躍的化學(xué)能發(fā)生部位有葉綠體的細(xì)胞、葉綠體線粒體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)發(fā)生條件光照下才可發(fā)生光下、暗處都可發(fā)生瓦氏呼吸儀工作原理及本探索側(cè)重點本實驗設(shè)計了有光和無光兩種實驗條件：意圖探索種子萌發(fā)進(jìn)程的光合作用和呼吸作用的相對強弱、光合作用及呼吸作用的啟動及調(diào)控模式。

瓦氏呼吸儀工作的基本原理：在一個密閉的定溫定體積的系統(tǒng)中，進(jìn)行樣品中氣體變化的測定。氣體被吸收時，氣體分子減少，則壓力降低，氣體被釋放時，則壓力上升，此壓力變化可以在測壓計上表現(xiàn)出來。由此可以計算氣體產(chǎn)生或者吸收的量及速率。呼吸儀裝置圖T三通活塞F反應(yīng)瓶C中央管S側(cè)管R儲液囊K螺旋夾M壓力計的定點h壓力計左右臂間的液面差

實驗儀器與試劑一、儀器瓦氏呼吸計：壓力計和反應(yīng)瓶、恒溫水槽和搖動裝置其他：燒杯（50ml）、鑷子、濾紙、電子天平、量筒（10ml）、移液槍（1ml）、橡皮筋、凡士林、棉花、注射器、乳膠管、鉗子。二、試劑Brodie氏溶液（Nacl23g+牛膽酸鈉5g+染料（100mg甲烯藍(lán)）+1-2粒溴百里香酚藍(lán)溶液+水=500ml）20%KOH溶液100ml洗液：重鉻酸鉀方法步驟材料準(zhǔn)備：取1粒黑豆種子，用濾紙吸干水，在電子天平上稱重，記錄（w1）取1粒黑豆種子，用10%草酸煮沸30min，用濾紙吸干水分，在電子天平上稱重，記錄（w2）用排水法測體積，記錄體積（Vw1和Vw2）。每組兩管，分別將將黑豆種子和死黑豆放入反應(yīng)瓶中，加水，使水與種子總體積為3ml，水面高于種子；在中央小管中加入0.3mlKOH溶液，用棉球把口上KOH溶液擦干凈，防止KOH溶液沾到種子上。在KOH溶液中放入一小片濾紙，增加CO2吸收面積。放置黑豆的設(shè)備是測試組，放置死黑豆的是溫控計組。方法步驟數(shù)據(jù)記錄與處理用凡士林將各連接處的磨砂涂好，反應(yīng)瓶連在壓力計上，橡皮圈固定。將壓力計固定在振蕩板上，反應(yīng)瓶浸入水中三分之二，檢查各接口是否連接嚴(yán)密，不能漏氣。打開壓力計活塞，振蕩30min，以使反應(yīng)瓶內(nèi)外溫度達(dá)到平衡。調(diào)節(jié)壓力計右側(cè)的液面達(dá)到150mm處，準(zhǔn)確記下壓力計左側(cè)液面的高度，記為初始數(shù)據(jù)。關(guān)閉三通活塞，記下時間，每隔10min記錄一次雙側(cè)的數(shù)據(jù)。計數(shù)方法：在設(shè)備搖動過程中隨時用壓力計下的螺旋夾調(diào)整壓力計封閉側(cè)的液柱在零點（150mm）附近。讀數(shù)時迅速調(diào)節(jié)壓力計的封閉側(cè)液面高度達(dá)到零點（150mm），記錄開放臂壓力計的液面位置實驗完畢后，先打開壓力計活塞，使反應(yīng)瓶和外界相通，然后取下壓力計和反應(yīng)瓶，防止壓力計內(nèi)的液體倒吸入反應(yīng)瓶內(nèi)。取下反應(yīng)瓶，倒掉種子，用水清洗，再用乙醇溶液清洗壓力計和反應(yīng)瓶。

瓦氏呼吸儀數(shù)據(jù)處理K=（273×Vg÷T+Vf×a）÷P0K是反應(yīng)瓶常數(shù)Vg是反應(yīng)瓶中氣體體積，包括連接管到壓力計中所取零點的一段空間（ul）Vf反應(yīng)瓶中液體的體積a反應(yīng)瓶內(nèi)液體中的氣體的溶解系數(shù)T反應(yīng)瓶的絕對溫度P0標(biāo)準(zhǔn)大氣壓10,000（Brodie液柱）思考題1）瓦氏呼吸儀測試時反應(yīng)瓶總體積是12.616mL，反應(yīng)瓶中液體總體積是3.20mL，20℃時氧氣在水中的溶解系數(shù)是0.031，計算該反應(yīng)瓶的氧氣常數(shù)。2）暗反應(yīng)時，反應(yīng)瓶中央小管加入KOH溶液吸收種子萌發(fā)釋放的CO2，平衡反應(yīng)體系后，封閉反應(yīng)體系的右側(cè)氣路，闡述此時將產(chǎn)生的液壓計液面變化現(xiàn)象。種子萌發(fā)前后DNA、RNA的提取及含量測定目的要求

學(xué)習(xí)和掌握從植物組織中提取核酸的原理和操作技術(shù)；了解提取DNA/RNA的幾種方法，原理和優(yōu)缺點；學(xué)習(xí)測定DNA/RNA含量的基本原理及具體方法。核酸是遺傳信息的攜帶者，是生命的最基本物質(zhì)，它和蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的主要成分；按化學(xué)組成可以將核酸分成兩大類：

①含脫氧核糖核酸（DNA）；

②含核糖核酸（RNA）；在生物體中核酸以結(jié)合成核蛋白的形式存在，但核酸極不穩(wěn)定，在較劇烈的物理、化學(xué)因素和酶的作用下都很易降解。核酸的分布：細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、游離核酸分離、純化原則在生物體中核酸以結(jié)合成核蛋白的形式存在，但核酸極不穩(wěn)定，在較劇烈的物理、化學(xué)因素和酶的作用下都很易降解。①保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性

意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。②排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染；③無雜核酸分子的污染（如純化DNA分子時應(yīng)去除RNA分子）。注意：在低溫下進(jìn)行操作；減少物理因素對核酸的機(jī)械剪切力；防止過酸、過堿引起核酸降解，控制pH值范圍（pH值5-9），并要保持一定離子強度；防止核酸的生物降解；細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。因此，所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。進(jìn)行核酸分離時最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。1、RNA的提取與測定RNA廣泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各種動物組織中。常見方法（依據(jù)RNA的種類和來源）：①苯酚法（實驗室最常用的方法）

②去污劑法③鹽酸胍法苯酚法：組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。優(yōu)點：較好除去DNA和蛋白質(zhì)，且獲得生物活性的RNA。工業(yè)提取RNA的方法酵母細(xì)胞富含RNA，是工業(yè)上提取RNA的主要原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的濃鹽法或稀堿法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝較簡單。濃鹽法：使用10％氯化鈉的溶液，同時在90攝氏度熱處理3-4小時，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。經(jīng)冷卻，離心后上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法：使用0.2％氫氧化鈉裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌體，上清液用乙醇沉淀RNA，或調(diào)體系pH值至RNA的等電點PI2.5，沉淀目的樣品。工業(yè)提取RNA的方法原理：1）動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或濃鹽溶液（如1mol/L氯化鈉），但在0.14mol/L氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）則在0.14mol/L氯化鈉中溶解度最大，利用這一性質(zhì)可將其分開；2）植物組織含有大量的多酚類植物色素，它們與核酸結(jié)合能力較強且易于氧化，在核酸分離進(jìn)程中需要抑制植物色素的氧化對它們進(jìn)行分離。方法：先用研缽將植物細(xì)胞破碎成粉末，再用0.14mol/L氯化鈉溶液把細(xì)胞中的RNP提取出來，最后用酚將RNA和蛋白質(zhì)分開。本實驗提取RNA的原理及方法RNA提取勻漿：稱取2g干燥種子（干燥萌發(fā)種子）放置在研缽中，加入2ml的5%PVP，迅速將種子破碎研磨成粉末，粉末迅速轉(zhuǎn)移到離心桶中，用10ml預(yù)冷的核分離buffer輔助粉末轉(zhuǎn)移，在離心管內(nèi)搖勻粉末，0℃下放置10min；離心：勻漿后4℃下，溶液離心8000r/min（RCF？）離心7分鐘，量取上清液做RNA分離（體積？），沉淀物留做提取DNA（質(zhì)量？）；除雜質(zhì)：于上清液中加入等體積80％苯酚溶液（操作注意），攪拌充分混合10-15分鐘，置冰箱冷卻靜止10-15分鐘，離心取含有RNA上層水相（顏色？），棄下層酚相（顏色？）（操作注意）；沉淀RNA：取上層水相含RNA溶液（體積？），加入2倍體積95％冷乙醇，攪拌（操作注意），充分混合，置冰箱中冷卻(約10-15分鐘)，至出現(xiàn)白色絮狀物—RNA，8000r/min離心7分鐘，取沉淀物；溶解：用少量去離子水（約2毫升）溶解沉淀物，用以測定其含量。濃度測定：RNA樣品溶液用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，利用紫外-可見分光光譜儀檢測樣品在240-400nm區(qū)域的光譜信號，使得OD260在0.2-0.6之間，計算OD260/OD280值。利用公式RNA濃度=40×（OD260-OD280）×稀釋倍數(shù)測樣品的RNA濃度，計算樣品中的RNA質(zhì)量百分含量（RNA質(zhì)量×100÷種子質(zhì)量%）RNA含量測定方法測定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚；地衣酚測定

原理：當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時，即可發(fā)生降解，形成核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3.5-二羥基甲苯（地衣酚）反應(yīng)，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復(fù)合物，反應(yīng)在670nm處有最大吸收峰，RNA濃度在10~100μg/mL范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度成正比。核酸濃度：

ssRNA濃度（μg/mL）=40×（OD260-OD280）×稀釋倍數(shù)

ssDNA濃度（μg/mL）=33×（OD260-OD280）×稀釋倍數(shù)

dsDNA濃度（μg/mL）=50×（OD260-OD280）×稀釋倍數(shù)其中純的DNA樣品其OD260/OD280大于或等于1.8當(dāng)值大于1.9說明有RNA污染，小于1.6說明有蛋白質(zhì)或者酚類污染；純的RNA樣品其OD260/OD280大約為2當(dāng)比值在1.7-2.0之間可以說明RNA較純，當(dāng)比值小于1.7說明RNA受到蛋白質(zhì)或者酚類污染，比值大于2.0說明RNA受到異硫氰酸污染。OD260/OD230用于估計樣品的除鹽程度OD260/OD230小于2.0說明除鹽不充分，需要進(jìn)一步做70%乙醇洗滌。紫外吸收法在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸，當(dāng)有還原劑存在時磷鉬酸立即轉(zhuǎn)變藍(lán)色的還原產(chǎn)物―鉬藍(lán)。

H3PO4+12H2MoO4→H3P(Mo3O10)4+12H2O↓還原劑

鉬藍(lán)鉬藍(lán)最大的光吸收在650-660nm波長處。當(dāng)使用抗壞血酸為還原劑時，測定的最適范圍為1-10微克磷。定磷法思考題RNA提取方法有幾種？有什么優(yōu)缺點？RNA提取過程中應(yīng)注意什么？植物核酸提取需要注意的事項是什么？DNA的提取及含量測定在動植物中，小牛胸腺、動物肝臟、魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA；微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%~10%。本實驗：將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使DNA與蛋白質(zhì)分離開。加入固體氯化鈉使其濃度達(dá)到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-異戊醇去除蛋白質(zhì)，也可重復(fù)該步操作得較純DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法變性劑法：用SDS等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA；苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白質(zhì)和DNA，分層、離心。因蛋白變性，抑制了核酸酶活性，并且操作過程比較緩和，可以得到較好的DNA制品；氯仿法：用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白，使乳化，離心除蛋白，DNA在上層水相，用乙醇沉淀上層，可將DNA沉淀出來。DNA的提取溶解：將離心后除去RNA的沉淀(質(zhì)量？)，用10ml的65℃預(yù)熱的2×CTABbuffer和5ml2%的DTT溶解，制成懸濁液，65℃水浴中保溫50min，每10min振搖離心管一次，使反應(yīng)體系混合均勻，保溫后將反應(yīng)體系靜置、自然降溫至室溫；除雜質(zhì)：加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）混合液，充分震蕩10分鐘，8000r/min離心7分鐘，取上層液量好體積，倒入燒杯中（離心管）（現(xiàn)象？），加同體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）混合液，重復(fù)上次操作（現(xiàn)象？）。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止；沉淀：準(zhǔn)確量取上清液體積，

加入1/10體積3mol/LNaAC溶液，加2倍體積95％冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現(xiàn)，約10-15分鐘，離心8000r/min離心7分鐘，得白色沉淀（質(zhì)量？）；溶解：將沉淀物用0.1mol/LNaOH約10毫升溶解。濃度測定：RNA樣品溶液用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，利用紫外-可見分光光譜儀檢測樣品在240-400nm區(qū)域的光譜信號，使得OD260在0.2-0.6之間，計算OD260/OD280值。利用公式DNA濃度=50×（OD260-OD280)×稀釋倍數(shù)測樣品的RNA濃度，計算樣品中的RNA質(zhì)量百分含量（DNA質(zhì)量×100÷種子質(zhì)量%）DNA含量測定方法二苯胺法：

DNA分子中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成ω-羥基-γ-酮基戊醛，與二苯胺試劑作用生成藍(lán)色化合物（λmax=595nm）。DNA在40~400微克范圍內(nèi)，光吸收值與DNA的濃度成正比。乙醛可增加二苯胺法測定DNA的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯糖的干擾，能顯著提高測定的靈敏度。樣品中含有少量RNA并不影響測定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應(yīng)形成有色化合物，故能干擾DNA定理。思考題按照實驗操作流程圖，說明每一步操作的實驗?zāi)康摹F(xiàn)象、原理和進(jìn)一步操作的依據(jù)。評價DNA、RNA純度的方法提取植物DNA、RNA的關(guān)鍵步驟有那些工藝圖2g種子+2mL5%PVP研磨+10ml核分離buffer懸浮

0℃，靜置,10min

離心8000r/min,8min

等體積80％苯酚攪拌10-15min，冰箱靜置10-15min8000rn/min，7min上清RNA、多糖沉淀DNA、蛋白加2倍體積95％冷乙醇冰箱至出現(xiàn)白色沉淀離心沉淀離心冰箱至出現(xiàn)白色沉淀加2倍體積95％冷乙醇等體積苯酚-氯仿-異戊醇溶液，振搖10min，離心取上清65℃保溫50min，每10min振搖一次10mL65℃預(yù)熱的2×CTAB+5mL2%DTT上清DNARNA加1/10體積3MNaAc種子萌發(fā)前后蛋白質(zhì)的提取及含量測定蛋白質(zhì)含量測定方法雙縮脲法、Bradford法、Lowry法（Folin-酚法）、凱氏定氮法、紫外吸收法雙縮脲法測蛋白含量實驗原理在堿性溶液中，Cu2+可與肽鍵中失去了質(zhì)子的氮原子形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)。脂類和色素對此反應(yīng)有干擾，可以用四氯化碳消除干擾。硫酸銨、Trisbuffer和某些氨基酸可以干擾實驗。實驗需要10分鐘左右，用于蛋白含量的快速測定，靈敏度不高，線性范圍1-20mg。本實驗采取雙縮脲法測定蛋白濃度。Bradford法實驗原理在酸性溶液中考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液顏色從紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，吸收峰從460nm轉(zhuǎn)為595nm。優(yōu)點是反應(yīng)時間短，染料-蛋白結(jié)合溫度顏色溫度，抗干擾性強。缺點是不同蛋白與染料結(jié)合能力不同，目的蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相差較大時無法準(zhǔn)確使用。triton×100、SDS和0.1M的NaOH干擾實驗測定靈敏度最高1-5mg，快速5-15分鐘。BCA（Bicinchoninicacid）法堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，測定該絡(luò)合物在562nm的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比可以計算蛋白濃度不受絕大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的干擾，SDS、TritonX-100、Tween不影響實驗結(jié)果但是螯合劑（如，EDTA），還原劑（DTT、巰基乙醇）和脂類會干擾實驗結(jié)果線性范圍10-2000ug/mlLowry法（Folin-酚法）蛋白質(zhì)中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡(luò)合成紫紅色化合物（雙縮脲反應(yīng)），同時肽鏈打開，蛋白質(zhì)中的半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸可以使鎢酸、鉬酸失去1個、2個或者3個氧原子，還原成混合酸，呈現(xiàn)出藍(lán)紫色（最大吸收峰在740-750nm），顏色深淺與蛋白含量成正比，于此同時，蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯醇化反應(yīng)，鉬離子可以螯合在肽結(jié)構(gòu)中增大酚試劑對蛋白的靈敏度。靈敏度高大約5mg，速度慢需要40-60分鐘蛋白氨基酸組成不同時，方法的顯色能力不同Trisbuffer、甘氨酸、各種硫醇干擾實驗測定凱氏定氮法靈敏度高使用與0.2-1.0mg氮，誤差為2%，需要8-10小時將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，干擾少、時長紫外吸收法實驗原理蛋白質(zhì)中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸含有共軛雙鍵，它們使得蛋白質(zhì)呈現(xiàn)280nm處的特征吸收，蛋白質(zhì)在238nm處的光吸收值與肽鍵含量成正比。優(yōu)點：快速、不損失樣品，生化制備中常用的緩沖鹽不影響測定缺點：準(zhǔn)確性差，干擾因素多（堿基、pH）線性范圍0.1-1.0mg，快速5-10min一般用于柱層析后的蛋白濃度測定單純蛋白OD280/OD260約為1.8；單純核酸OD280/OD260大約為0.5。含核酸的蛋白樣品濃度測定C=1.45OD280-0.74OD260(mg/ml)蛋白樣品濃度測定C=0.75OD280(mg/ml)蛋白稀溶液C=0.144(OD215-OD225)(mg/ml)此時0.1MNaOH、0.1MHAc、琥珀酸、鄰苯二甲酸、苯巴比妥對實驗結(jié)果有影響，可以測定20-100mg/ml的樣品樣品制備稱取0.5g種子（萌發(fā)種子），利用研缽研磨成粉末，將干粉放置于預(yù)先清洗并干燥的100ml錐形瓶內(nèi)，加入1ml四氯化碳和10ml的0.05M氫氧化鉀，劇烈振蕩。再向錐形瓶內(nèi)加入40ml雙縮尿試劑（用封口膜密封錐形瓶），劇烈振蕩10min后室溫靜置1小時。取適量放置過的反應(yīng)液于離心管內(nèi)，8000rpm離心10min，離心后試管內(nèi)的上清液作為樣品溶液等待與標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品共同測試。樣品靜置1小時期間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品準(zhǔn)備，樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品同時測定OD540標(biāo)準(zhǔn)曲線制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線種子萌發(fā)種子管號01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)液10mg/ml00.20.40.60.81.000待測液0000002.52.5水10.80.60.40.202.52.5顯色劑4444440025攝氏度30minOD540計算樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量（蛋白質(zhì)質(zhì)量×100÷種子質(zhì)量%）思考題闡述蛋白質(zhì)濃度測定方法及其優(yōu)缺點雙縮脲法、BCA法顯色機(jī)制的差異紫外吸收法鑒定蛋白質(zhì)純度及檢測蛋白質(zhì)濃度的理論依據(jù)雙縮脲法測蛋白濃度的注意事項種子萌發(fā)前后糖的提取及含量測定糖含量檢測方法硫酸蒽酮法硫酸苯酚法DNS比色定糖法（還原糖）菲林試劑定糖法（還原糖）硫酸蒽酮法反應(yīng)原理糖在濃硫酸的作用下，經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或者羥甲基糠醛，糠醛和羥甲基糠醛可以與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與糖含量成正比。該反應(yīng)可以測試戊糖、己糖、所有寡糖類和多糖類，可以測溶液中全部可溶性碳水化合物總量但是此方法針對不同的糖顯色程度不同，果糖顯色要依次高于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、五碳糖。缺點是顯色不穩(wěn)定，需要20min內(nèi)測完。硫酸苯酚法實驗原理糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或者羥甲基糠醛可以與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg濃度范圍內(nèi)，OD485與糖含量成正比。主要用于測試可溶于水或者乙醇的甲基化糖、戊糖和多聚糖。優(yōu)點是顯色穩(wěn)定，靈敏度高。DNS法堿性條件下加熱時，體系內(nèi)的還原糖經(jīng)氧化生成糖酸及其他產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸同時經(jīng)還原生成棕紅色的3-氨基-5硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)OD540與糖濃度成正比。有醛基或酮基的糖是還原糖，單糖都是還原糖，二糖或者多聚糖不一定是還原糖。樣品制備第一天取2g種子（萌發(fā)種子），利用研缽研磨成粉末，利用90ml去離子水將粉末轉(zhuǎn)移到磨口圓底燒瓶，60℃下回流2小時，靜置自然冷卻到室溫；8000rpm離心8分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶，用去離子水定容到100ml；取10ml樣品放置在200ml錐形瓶內(nèi)，加入150ml無水乙醇，4℃過夜靜置。第二天8000rpm離心15min，棄上清，沉淀用去離子水溶解，定容至100ml硫酸蒽酮法測定糖含量標(biāo)準(zhǔn)糖曲線種子萌發(fā)種子管號123456789糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1mg/ml00.20.40.60.81.01.200待測液00000002.0