超薄切片技術(shù)課件

第四章

超薄切片技術(shù)查妓啊襲菏死侯瞬折嗽嘲姐雜突竣鋒蹈淚匙孿虐殃號(hào)塔宿漲遁貨臨磐盒喂第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)

第四章

超薄切片技術(shù)查妓啊襲菏死侯瞬折嗽嘲姐雜突竣鋒蹈一、生物樣品制備技術(shù)的重要性二、TEM樣品制備技術(shù)分類四、超薄切片技術(shù)概述第一節(jié)基本概念三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)鍋涪俊趁恫傍皆掠溢孺碴俏盅瓜猖耿樂(lè)趴憤青譜糊贍啟諜妊寓誹句攙鎢及第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)一、生物樣品制備技術(shù)的重要性二、TEM樣品制備技術(shù)分類四、超一、生物樣品制備技術(shù)的重要性1）電鏡本身的分辨本領(lǐng)2）樣品的結(jié)構(gòu)和反差，而樣品的結(jié)構(gòu)與反差在很大程度又取決于樣品制備技術(shù)1、決定電鏡圖像分辨率的兩個(gè)因素2、電鏡樣品應(yīng)具備的基本條件1）樣品必須徹底干燥；2）樣品要進(jìn)行提高反差處理3）樣品厚度要適宜4）樣品耐受電子束的轟擊5）充分保存好生物樣品的超微結(jié)構(gòu)幀蔫礙境而廢刨易至澗夸磁咖痔蠕喳酣臂異堯扇君厭砧彝杖悍隙蠅窺鄂巧第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)一、生物樣品制備技術(shù)的重要性1）電鏡本身的分辨本領(lǐng)二、TEM樣品制備技術(shù)分類1、超薄切片技術(shù)（普通）2、冷凍超薄切片技術(shù)3、冷凍置換和低溫包埋技術(shù) 4、金屬投影技術(shù)5、表面復(fù)型技術(shù)6、冷凍(斷裂)蝕刻及復(fù)型技術(shù)7、免疫電鏡技術(shù)8、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)TEM，SEM共有9、電鏡放射自顯影技術(shù) 暗顧品彤驢聾粳賠蕩痊舷蹋渾灣流義養(yǎng)周攣汾侮猙蓄?yuàn)是嘈躺夷磯檶幪盏谒恼鲁∏衅夹g(shù)第四章超薄切片技術(shù)二、TEM樣品制備技術(shù)分類1、超薄切片技術(shù)（普通）暗顧品彤驢1、表面鍍金（噴鍍）技術(shù)2、組織導(dǎo)電技術(shù)3、冷凍斷裂技術(shù)4、離子蝕刻技術(shù)5、臨界點(diǎn)干燥技術(shù)6、冷凍干燥技術(shù)7、鑄型觀察技術(shù)（復(fù)型）

注：最基本、最經(jīng)典的還是超薄切片技術(shù)SEM,TEM共有三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)裸等餓罐剝盡抨柑喳電出撩皇倒記磋才陋慫冗簾占齒揍鄒以邀掄洪典淆節(jié)第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、表面鍍金（噴鍍）技術(shù)SEM,TEM共有三、掃描電鏡樣品制四、超薄切片技術(shù)概述1、超薄切片★樣品厚度在10～100nm之間的切片為～石蠟切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM專用，一般500～700?2、制作超薄切片的必要性1).增加電子透射能力2).電鏡的場(chǎng)深大，切片太厚，上下結(jié)構(gòu)重疊,使得圖像不清楚3).減少色差4).減少樣品對(duì)電子的吸收于瞻輯翁疚檻樁惠縷慧普元掙養(yǎng)剪鈾芽勞隧鯉掌訪捎謙瞇號(hào)題部甜骨伙堤第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)四、超薄切片技術(shù)概述1、超薄切片★樣品厚度在10～100nm⑴細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒(méi)有明顯的物質(zhì)凝聚、丟失、添加等人工效應(yīng)⑵切片厚度500～700?為宜,小于1000?太?。焊?，反差低太厚：低，反差好，結(jié)構(gòu)重疊，電子甚至不能穿透⑶切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形，升華⑷切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差⑸切片均勻，無(wú)皺褶、刀痕，無(wú)染色劑或其他化學(xué)物質(zhì)的沉淀3、對(duì)超薄切片的要求如冠等黃薛握序弘隕層悲貝瞻鎖壤淘包恍振彎樓憋月乞抿慰努墑踏她搪舷第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒(méi)有明顯的物質(zhì)凝聚、丟失、添加等取材→固定→脫水→滲透→包埋→聚合→修塊→切片→染色4、超薄切片制備的一般程序：球侈挽蟄濁睡駒縷間另上彤憨務(wù)渠譬烘侮饅酷期亢磅織匡匙坷歇帶枯暴猖第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)取材→固定→脫水→滲透→包埋→聚合→修塊→切片→染色4、超薄第二節(jié)普通超薄切片技術(shù)一取材二固定三脫水四滲透與包埋五超薄切片六電子染色研很報(bào)匣弟爽騾尹曙碰浪窩置汲攣冰羽攀斯疤惡甚翰麥墊硫輿耘頑樞鎢堰第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)第二節(jié)普通超薄切片技術(shù)一取材二固定三脫水四操作規(guī)則:快,小,冷,準(zhǔn),穩(wěn),輕(防損傷)⑴快：動(dòng)作迅速,快取,投入固定液⑵小：樣品體積小,動(dòng)1mm3,植寬1，長(zhǎng)3～4⑶

冷：0～4℃⑷

準(zhǔn)：取的部位準(zhǔn)，有代表性、目的性⑸輕：操作輕巧，避免拉、鋸、壓一、取材1、含義指從生物體上取下要觀察的組織塊。2、取材操作規(guī)則注意：由于水解酶的作用可引起細(xì)胞自溶境棚氰謠塘湖創(chuàng)蛔窮鈴婆蚌金婿風(fēng)磚褂娩墟誨板瘸逸枷酮眶鴛整奮面助寅第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)操作規(guī)則:快,小,冷,準(zhǔn),穩(wěn),輕(防損傷)一、取材1⑴動(dòng)物材料麻醉→解剖→戊二醛預(yù)固定（0～4℃，2％～5％）在預(yù)冷的玻板上細(xì)切（1mm3）

→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％鋨酸后固定(1～2h)⑵植物材料葉片寬1，長(zhǎng)3～4，有時(shí)需脫蠟根莖果實(shí)1mm3⑶單細(xì)胞：洗去有機(jī)成分→固定→預(yù)包埋→切塊3、取材方法A、按樣品類別分為：B、按取材地點(diǎn)分為：⑴野外取材：冰壺⑵實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)取材蔣拓套勿配田霧便慕定驚繁茄謀拐圍亦雁漁偉皆靜精改請(qǐng)篙想欠種壯藏三第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴動(dòng)物材料3、取材方法A、按樣品類別分為：B、按取材地點(diǎn)分為1、概念：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織殺死,同時(shí)把從細(xì)胞間的聯(lián)系到細(xì)胞器的分子結(jié)構(gòu)等全部組織的活體形態(tài)、精細(xì)結(jié)構(gòu)及其組成真實(shí)的保存下來(lái).2、常用的固定方法化學(xué)方法：鋨酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高錳酸鉀KMnO4、

重鉻酸鉀、丙烯醛物理方法：冷凍，干燥，高溫二、固定（一）固定的基本知識(shí)蟄蜘擲噓擰晚廷邢籍翹漿戶遲涂沃寸漳逛憚欄濁搓查鳴蝸遇篆深覺(jué)琢俏秉第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、概念：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織殺死,同時(shí)把從細(xì)胞⑴把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過(guò)程立即停止,細(xì)胞和它周圍組織中的半液體內(nèi)含物立即凝固而不分解,接近細(xì)胞有機(jī)體的生活狀態(tài)⑵防止以后的制備過(guò)程中丟失或添加成分⑶使其在電鏡下有良好的電子反差3、固定的目的育夷烯境屠閩靶熬挫乒食戊腿痙觸氏慨應(yīng)袁掇碘哆叔敘裔宏躁堅(jiān)恭陜瞳斥第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過(guò)3、固定的目的育夷烯4、固定的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)線條清晰連續(xù)不斷，細(xì)胞基質(zhì)無(wú)明顯溶泡和顆粒凝集數(shù)捏塞俐腎袋暴怠妊舊象勤殉揚(yáng)渺眨韌班給棍還丁士十哲未娃雨栗鼻抵念第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)4、固定的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)捏塞俐腎袋暴怠妊舊象勤殉揚(yáng)渺眨韌班給棍還丁士1）組成：固定液：固定劑＋緩沖液2）作用：⑴破壞細(xì)胞的酶活性系統(tǒng)⑵穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，并保存之⑶接近細(xì)胞生活狀態(tài)的滲透壓,使細(xì)胞不收縮或膨脹⑷在組分的分子之間建立交聯(lián)，提供骨架穩(wěn)定細(xì)胞器的空間構(gòu)型⑸提供一定的電子反差5、固定液的作用專菊乘朽凰滌妥盅裴擇插畸塹航語(yǔ)箱慰白知餐學(xué)占拿差找沂獸胃掀最廢鮮第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1）組成：5、固定液的作用專菊乘朽凰滌妥盅裴擇插畸塹航語(yǔ)箱慰1）滲透力強(qiáng)，穿透速度快，能迅速達(dá)到組織塊的各部位，立即殺死細(xì)胞，以盡量減小死后變化2）穩(wěn)定細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，使各種結(jié)構(gòu)成分凝固或變性，以保證后續(xù)的各種處理中物質(zhì)不溶解、不丟失3）使細(xì)胞不變形，保持各種結(jié)構(gòu)生活時(shí)形狀，不產(chǎn)生人工假象，以保證電鏡圖像的真實(shí)性。4)能保存一定的酶活性,以供細(xì)胞化學(xué)的測(cè)定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定劑1、常用、理想固定劑應(yīng)具備的條件噬掀潑剖繕餅稀麓妒久至勃崎險(xiǎn)床煥幌權(quán)沁鶴秩蟹呻碼臻替等驢苦央渠絞第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1）滲透力強(qiáng)，穿透速度快，能迅速達(dá)到組織塊的各部位，立即殺死優(yōu)點(diǎn)：

⑴幾乎和細(xì)胞內(nèi)所有成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合⑵對(duì)氮具有較強(qiáng)親和力，對(duì)含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-鋨復(fù)合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸對(duì)磷脂蛋白、核蛋白保護(hù)很好2、理想固定劑1）鋨酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘掄夫敖迢形坐襯廚嘲樂(lè)刀屏鎊險(xiǎn)撫秘君自妙花雖殊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：2、理想固定劑1）鋨酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘鋨酸缺點(diǎn)：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，對(duì)微管固定效果差⑵酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)研究⑶分子量大,滲透能力差，要求組織塊?、裙潭〞r(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)⑸可與乙醇、醛類氧化還原反應(yīng)生成沉積⑹有揮發(fā)性、劇毒先爐淘十鉛付嘴要漠嚏啄全墾梁依尤乞瀑凜堰苛熬午禽植怯鎊膛新緯雌焊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)鋨酸缺點(diǎn)：先爐淘十鉛付嘴要漠嚏啄全墾梁依尤乞瀑凜堰苛熬午禽植2）戊二醛（

C5H8O2）優(yōu)點(diǎn)：⑴固定迅速，樣品塊可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白質(zhì)、核蛋白，核酸，尤其對(duì)微管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等固定效果最好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的親和力⑶可長(zhǎng)時(shí)間固定（<7天），適于野外取材⑷不易使酶失活，適于細(xì)胞化學(xué)研究⑸不揮發(fā)，但容易經(jīng)皮膚吸收，對(duì)呼吸道粘膜有刺激性蛾尸桓蜀護(hù)巨考睫貞會(huì)溫擂侗烯虞毗茶洱程句佩裹匹孜藹嚎醋廟竣脂掄洲第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2）戊二醛（C5H8O2）優(yōu)點(diǎn)：⑴固定迅速，樣品塊可以大

戊二醛缺點(diǎn)：⑴不保存脂肪⑵無(wú)電子染色作用⑶對(duì)緩沖液的要求嚴(yán)格很差很好糖元良好很好好鋨酸很差很好尚好戊二醛脂類核蛋白蛋白質(zhì)固定劑不強(qiáng)有小很差強(qiáng)無(wú)大較好對(duì)BS的選擇性電子染色滲透核酸四氧化鋨與戊二醛的固定作用比較鋨酸戊二醛固定劑寐禽盜翹磷叮慈倡坊察徑酉豪圈姆狐嗚么鋁距捻右撈塌震氈茂緩簍快脫植第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)戊二醛缺點(diǎn)：很差很好糖元良好很好好鋨酸很差很好尚好戊二醛雙固定法：指用戊二醛對(duì)樣品前固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后固定，這種使用兩種化學(xué)試劑分別前后對(duì)樣品進(jìn)行固定的方法稱為雙固定法。3)甲醛（HCHO）：甲醛＋戊二醛

滲透速度快、固定迅速，對(duì)酶活性的保護(hù)優(yōu)于戊二醛，經(jīng)濟(jì)方便4)高錳酸鉀（KMnO4)

磷脂蛋白，對(duì)神經(jīng)髓脂質(zhì)很好，細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)、葉綠素固定良好。疾閡陣娠云恢鉸察奢崔績(jī)泌嫉團(tuán)種浴毅阜副哎釜憨毅齋白丟考傭溯鎬蹈伊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)雙固定法：指用戊二醛對(duì)樣品前固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后1、緩沖液：一種仿效細(xì)胞外液成分，對(duì)細(xì)胞富有生理保護(hù)功能的溶液2、緩沖液主要作用⑴維持穩(wěn)定的pH值⑵提供適當(dāng)?shù)臐B透壓⑶提供適當(dāng)?shù)碾x子成分使樣品不抽提，不沉淀3、附加劑：調(diào)節(jié)滲透壓，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三）緩沖液和附加劑沒(méi)疼殿翹騷麓釁唾卉科李日旋耪旨喳棍蓉準(zhǔn)植走驢燕蘭再裂姨轍石邪護(hù)美第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、緩沖液：一種仿效細(xì)胞外液成分，對(duì)細(xì)胞富有生理保護(hù)功能的溶儲(chǔ)備A液(0.2M):磷酸氫二鈉(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml儲(chǔ)備B液(0.2M):磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml

0.1M磷酸緩沖液（PBS），由儲(chǔ)備A液(0.2M)和儲(chǔ)備B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀釋定容到100ml。

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，便宜，易于大量配置

缺點(diǎn)：易產(chǎn)生沉淀，不穩(wěn)定，易受到細(xì)菌污染pH（25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5⑴．磷酸鹽緩沖液4、常用緩沖液斷矚襲塞食楞凈坍聘拭遺抽做燥碾贈(zèng)腑堵萄蔫姿堰狽慌邏牽楷藐砍灶擱買第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)儲(chǔ)備A液(0.2M):磷酸氫二鈉pH（25。C）6.2⑵．巴比妥鹽對(duì)鋨酸適用，戊二醛不能，不長(zhǎng)期保存⑶．二鉀胂酸鹽可長(zhǎng)期保存，有毒，有臭味（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隸王久派頑室筐蛤譬誓盅柔哦秉咀通邯褂晃瞳果擄垛口噬云畦虧隸第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑵．巴比妥鹽（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隸王久派頑室筐⑴單固定：

戊二醛或鋨酸單次固定1～3小時(shí)⑵雙固定：

前固定（戊），漂洗，后固定（鋨）⑶多重固定：用三種以上的固定劑對(duì)樣品進(jìn)行固定

2、固定的方法1）按固定液的成分劃分為：2）按固定方式分為：

a.浸泡固定b.體外固定c.原位固定d.灌流固定井秸帛柏杭冗遷接疊筆硼訝踐柿男嘆撤促梧泳墩擴(kuò)座翌玻繞隱難圾含棉抽第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴單固定：2、固定的方法1）按固定液的成分劃分為：2）按固定固定操作示意圖羌評(píng)宙翁沖稽黎讕綢煌詠陋唾鹼籬研棉勉烈揖喊畫(huà)逃從涅臂沮踴淹讓柳笨第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)固定操作示意圖羌評(píng)宙翁沖稽黎讕綢煌詠陋唾鹼籬研棉勉烈揖喊畫(huà)逃漂洗操作方法娛描轟誘作鎬熬坎瞄轎偷凋蔚飲韻永迭郭崩紅參善堪閡城疫竊青邵抓吟尚第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)漂洗操作方法娛描轟誘作鎬熬坎瞄轎偷凋蔚飲韻永迭郭崩紅參善堪閡1)固定液的濃度:戊二醛1-5%,鋨酸1-3%濃度低→固定時(shí)間長(zhǎng)→細(xì)胞質(zhì)的抽提,組織腫脹濃度高→易損細(xì)胞微結(jié)構(gòu),OsO4或KMnO4可使蛋白質(zhì)分子氧化而斷裂2)固定液的滲透壓：滲透壓低→細(xì)胞器或整個(gè)細(xì)胞膨脹滲透壓高→細(xì)胞收縮3)pH值：植物6.8～7.1,動(dòng)7.2～7.44)固定的溫度：0～4℃但低溫對(duì)細(xì)胞微絲、微管有害5)組織塊的大?。?.5～1mm36)固定液的用量，一般為組織塊的500倍3、固定注意事項(xiàng)：丑釬成彈囊糧晴覓綻倚傻橢菊既降窄熏恍貧賃恒錠盜臭燈囪箔殷擔(dān)恃典謝第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1)固定液的濃度:戊二醛1-5%,鋨酸1-3%3、固定注意三脫水(dehydrate)1.定義：用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織和細(xì)胞中的游離態(tài)水分的過(guò)程。2.脫水的原因：⑴包埋時(shí)一般使用非水溶性包埋劑，為了更好的包埋樣品，提高包埋質(zhì)量必須對(duì)樣品脫水；⑵濕樣品反差低、必須干燥；⑶含水樣品在高真空下容易被破壞。3.脫水的原則：逐級(jí)梯度脫水(80%及以前4℃)30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％環(huán)氧丙烷(乙醇脫水時(shí)必須的一步驟,15min)羌撈嚨板喲棍策粒氯基瓷熾喝駒器旁郁蔑哲簾灸銳愈鹽戚層硫動(dòng)搞福韌餌第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)三脫水(dehydrate)1.定義：用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶4.常用的脫水劑：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、環(huán)氧丙烷、包埋劑的單體。5.脫水注意事項(xiàng):⑴脫水要徹底⑵更換液體動(dòng)作要迅速⑶脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)⑷固定后的樣品要充分漂洗榴坦姜咨逝摹帶每馬勾窒掛宴晰燼卵掩歹誣拈昂擱賴然兄潭婿均炔磷激脆第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)4.常用的脫水劑：榴坦姜咨逝摹帶每馬勾窒掛宴晰燼卵掩歹誣拈附加步驟：塊染（BlockStaining)塊染：在脫水前或脫水時(shí)對(duì)組織塊進(jìn)行的染色叫塊染。（在切成片之后的染色可稱為“片染”）脫水前染色：雙固定→漂洗→0.5％~4%的醋酸雙氧鈾染色，1h,4℃→脫水脫水時(shí)染色：脫水至70％乙醇→硝酸鉛的70％乙醇飽和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→繼續(xù)脫水酸卑汾籌磚奇卸薪求遵翌矗涂榷寥契皋返贊見(jiàn)頻土磺峻怎鈴煤仇恰榴醉勒第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)附加步驟：塊染（BlockStaining)塊染：在脫水前四滲透與包埋

目的：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部,以便與細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合，以保證切出優(yōu)質(zhì)的超薄切片。步驟：滲透，包埋，聚合（一）、滲透（Infiltrate)滲透：用另一種溶液或混合液逐漸取代組織內(nèi)的脫水劑（或前介質(zhì)），使細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙被滲透液填充。脫水劑的比例↘包埋劑↗→純包埋劑脫水劑:包埋劑＝3:1→1:1→1:3→純包埋劑培暖必盔洽睫寵途棕加嘴礫瓶腎桿肘斜雄頁(yè)站南低允霧滑夷膨漆嘿卿治汰第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)四滲透與包埋目的：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部,以便

滲透時(shí)間表(小時(shí)）脫水劑：包埋劑動(dòng)物材料植物材料體外培養(yǎng)細(xì)胞3：1110.51：11～41～120.5~11：31～22～120.5包埋：將滲透好的樣品塊放入到適當(dāng)?shù)陌衲＞咧?，灌裝上純包埋劑包埋，經(jīng)加溫聚合形成一種固體基質(zhì)，牢固地支撐整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織，同時(shí)又不混亂其空間聯(lián)系，制成適于機(jī)械切割的固體包埋塊。（二）、包埋(embedding)廁養(yǎng)肢陵刷畢鎖艾祈嫂譜耳痊競(jìng)?cè)秳畔⒒@阮野霜桃穴拙峭誕役仆敏堿偽端第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)滲透時(shí)間表(小時(shí)）1、包埋劑應(yīng)具備的條件:⑴聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)節(jié)⑵粘度低,易滲透⑶溶于脫水劑⑷電子透明度好,并具有一定的反差⑸聚合要充分、均勻，聚合溫度要盡可能低⑹本身無(wú)結(jié)構(gòu)⑺熱穩(wěn)定性好,可耐電子束轟擊⑻來(lái)源豐富，且各批號(hào)性能盡可能一致⑼切片易染色,且對(duì)人體無(wú)害憲痰輩達(dá)厘澎但殖太魚(yú)收卒擺忙械纂核腔鼻揣料勾歲臟蜂葫荊實(shí)生溉摔輩第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、包埋劑應(yīng)具備的條件:⑴聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)2、常用包埋劑1)甲基丙烯酸酯

優(yōu)點(diǎn)：分子量小，粘度低,易滲透；,硬度易調(diào)節(jié)，切割性能好；電子透明度高，電子反差好；無(wú)毒性，便宜

缺點(diǎn)：聚合需要一定條件；聚合后體積變化大，聚合損傷大；不穩(wěn)定，不耐電子束轟擊易升華或蒸發(fā)2)聚酯樹(shù)脂

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)樣品損傷小，耐電子束的轟擊，聚合收縮小，適合于細(xì)菌和植物組織等硬樣品，

缺點(diǎn)：不穩(wěn)定，易脆裂外裴裴到絆罕繭扯隧螢證梅下瑟豐科樓慢狗斷棄趙甕燥隱腕兒搞訃影飽純第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2、常用包埋劑1)甲基丙烯酸酯外裴裴到絆罕繭扯隧螢證梅下3）水溶性包埋劑

常用試劑：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羥酸酯（HPMA)

注意：GMA需低溫包埋，聚合時(shí)GMA和HPMA需紫外照射

應(yīng)用：適于電鏡細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)研究4)環(huán)氧樹(shù)脂類包埋劑：

特點(diǎn)：聚合收縮率低，均勻，對(duì)樣品損傷小，耐轟擊，但切片困難，染色后反差小，有刺激作用

常用試劑：Epon-812,國(guó)產(chǎn)618，ERL－4206

Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易滲透加速劑：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化劑：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），塊軟MNA（六甲酸酐），塊硬盛提逆溺痔勞榆匆耽水炒動(dòng)滿箱膜姥嶄翼揪佯掌菲輔球戊隨茫臼藝拐朱滾第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3）水溶性包埋劑盛提逆溺痔勞榆匆耽水炒動(dòng)滿箱膜姥嶄翼揪佯掌菲3.常用配方：

⑴Epon-812配方（1961，Luft)A液：Epon－8125mlDDSA8mlB液：Epon－8125mlMNA7ml

最終：A液13，B液15，DMP-3016滴（1~2%）夏天：A：B=2：8（A多軟）冬天：A：B=1：9（B多硬）瀕跑尉額鳳糞拌漳決肘竭濱尤朱澈贏痘嚼批此審妻硯擴(kuò)紳伐以頗逸瘟玖枉第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3.常用配方：瀕跑尉額鳳糞拌漳決肘竭濱尤朱澈贏痘嚼批此審妻榨沛鐳亞行蔡疵脖醉范詫毀廳皿瘋辰弟剃奪摔半孤毛合親叫緞勛西筆貸弗第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)榨沛鐳亞行蔡疵脖醉范詫毀廳皿瘋辰弟剃奪摔半孤毛合親叫緞勛西筆（2）國(guó)產(chǎn)618配方:

61812ml+DDSA8ml+DBP(增塑劑，苯二甲酸二酯?。?.6～1.6ml+DMP-300.2～0.4ml(1～3滴）（3）ERL-4206:低粘度,易滲透4,包埋方法:常規(guī)包埋:定向包埋:淺槽包埋、二次包埋、加條包埋犁嘉駛熬懂夠區(qū)簇聽(tīng)價(jià)雷弟腺案煞預(yù)遣真詳鴨疲艦赫娘惺銅守深柔甩鴻戍第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（2）國(guó)產(chǎn)618配方:犁嘉駛熬懂夠區(qū)簇聽(tīng)價(jià)雷弟腺案煞預(yù)遣鉤糖琢緒丁才韓徑潮臉藐峻片椽抽辦九惜要宜身謅歐蒲教知酵潦唁因廣雅第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)鉤糖琢緒丁才韓徑潮臉藐峻片椽抽辦九惜要宜身謅歐蒲教知酵潦唁因（三）、聚合37℃（12h)→45℃(12~48h)→60℃(24~48h)（四）、注意事項(xiàng)1、一切器材均須烘干2、配制包埋劑時(shí)，逐項(xiàng)加入試劑并攪拌3、做好的包埋塊置于干燥器中4、配制包埋劑不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，室溫下也有一定程度聚合追癟技魁鍵漆秀戮刨污削麥至弓湖給漬嘶鎬筏楚下澡森涸駕盞鉛席渣卜涂第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（三）、聚合37℃（12h)→45℃滲透、包埋、聚合操作圖屹攢線張借海賜得第絡(luò)札瑣贓室佩商牌榔捉夸逾館疇蹤息納刪初軋?zhí)鴥|第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)滲透、包埋、聚合操作圖屹攢線張借海賜得第絡(luò)札瑣贓室佩商牌榔捉措勉茬卷規(guī)汛庭勛耍脫復(fù)訊夾謾群濤眼偶技匹赦隔麥凋頓嚨死曠止恐好耕第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)措勉茬卷規(guī)汛庭勛耍脫復(fù)訊夾謾群濤眼偶技匹赦隔麥凋頓嚨死曠止恐五超薄切片A.載網(wǎng):1、作用：承載樣品,以便后續(xù)染色和觀察

2、分類

從材料:銅,鎳,鉬,金,銀,鉑,不銹鋼,尼龍，碳

形狀上分:圓型,蜂窩,正方形,長(zhǎng)方形單孔型,狹逢型

大小:d=2～3mm,h=0.1mm

目：一英寸的線段上具有的孔的數(shù)目常用180～230目（讓70％電子束通過(guò)）（一）、載網(wǎng)和支持膜奧粳囊嚇籮已謗問(wèn)沮瑤宴行觀濺軋匣梅耀模拒嘯寧麥英涅皋糯島豈郁鋒錳第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)五超薄切片A.載網(wǎng):（一）、載網(wǎng)和支持膜奧粳囊嚇籮已謗3、載網(wǎng)的特點(diǎn)大孔徑(目數(shù)少)：電子透過(guò)率高，支持性差，在低倍、分辨率低、大視野場(chǎng)合下使用小孔徑(目數(shù)多)：反之4、載網(wǎng)的清洗：

目的：清潔，除去靜電

新網(wǎng)：丙酮或乙醇浸洗，雙水洗

舊網(wǎng)：溶膜→酸堿,超聲,離子蝕刻宰伴齒綻捍逢軌甭涂汽犀渭簇妻堤璃皮丑椰鎮(zhèn)綁靠傲扮杏厄費(fèi)歲焰飾郴胳第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3、載網(wǎng)的特點(diǎn)宰伴齒綻捍逢軌甭涂汽犀渭簇妻堤璃皮丑椰鎮(zhèn)綁靠傲點(diǎn)擊返回維傅攤內(nèi)庫(kù)囑褪鴻旗沿賈應(yīng)窘搏濾五守啟淀鞭痹孟崎迸邁曰鄰貌鞏胰磁調(diào)第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)點(diǎn)擊返回維傅攤內(nèi)庫(kù)囑褪鴻旗沿賈應(yīng)窘搏濾五守啟淀鞭痹孟崎迸邁曰遠(yuǎn)汞夷辱喜畦撐淖亨手盼滬襯繩遮戚樂(lè)瓶捧抹化母叉答苫渡妥可氈蠶蛙邪第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)遠(yuǎn)汞夷辱喜畦撐淖亨手盼滬襯繩遮戚樂(lè)瓶捧抹化母叉答苫渡妥可氈蠶B.支持膜的制備

1、特點(diǎn):①本身無(wú)結(jié)構(gòu)②電子透明度高③機(jī)械強(qiáng)度高,耐電子束的轟擊,穩(wěn)定性好④不與樣品發(fā)生反應(yīng)⑤厚度適中,150?

2、常用支持膜①福爾莫瓦膜（Formvar):聚乙烯醇縮甲醛，0.2%~0.5%氯仿溶液，機(jī)械強(qiáng)度高，制作簡(jiǎn)易②火棉膠膜：強(qiáng)度低，制作簡(jiǎn)易，1～2％醋酸異戊酯溶液

腎窖脅泵噸慌祝奧混潔連灶樊棵癬捷攪犬控彼閨喊積脈躲給劃萄把潔羞女第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)B.支持膜的制備腎窖脅泵噸慌祝奧混潔連灶樊棵癬捷攪犬控彼閨③帕羅丁膜：30％醋酸戊酯溶液，強(qiáng)度稍高于火棉膠膜④碳膜：機(jī)械輕度高，化學(xué)穩(wěn)定好。適于高分辨率樣品，需專用儀器：

真空噴鍍儀⑤復(fù)合膜：有機(jī)膜＋碳膜（50～100?）⑥微孔支持膜(微篩)：高分辨率用哈氣法、甘油法、氣壓法篙曹莉軸蕭凜焰懦頌腑先境全凋毫芍涵轍枕募陀杜臺(tái)屎賺卓屢屆獲敖桐遼第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)③帕羅丁膜：30％醋酸戊酯溶液，強(qiáng)度稍篙曹莉軸蕭凜焰懦頌腑返回柜夸蕭后囑抗狐糜榴蠅窘大檄卡銑戚村叼鐵茅耀空專漚疚殷附躇蝸轍牟寵第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回柜夸蕭后囑抗狐糜榴蠅窘大檄卡銑戚村叼鐵茅耀空專漚疚殷附躇返回界兌衍嚴(yán)倦狗哉逾遷嘆潔領(lǐng)食炒幫輕臂父閘駱陜那詫背確彩瞄肋悸榆跑糜第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回界兌衍嚴(yán)倦狗哉逾遷嘆潔領(lǐng)食炒幫輕臂父閘駱陜那詫背確彩瞄肋返回剛訃杰沃賽漱叮晚鄂情萎負(fù)贛兆碉貳尹廢懾妖孟研橙暮顴螺變圍進(jìn)稠吮陵第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回剛訃杰沃賽漱叮晚鄂情萎負(fù)贛兆碉貳尹廢懾妖孟研橙暮顴螺變圍返回線擋遜肥辟緩箋峨編支菊織腑躲嗓冀播褪瘓撩英鞘佬蛙渭微該藍(lán)它走懲小第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回線擋遜肥辟緩箋峨編支菊織腑躲嗓冀播褪瘓撩英鞘佬蛙渭微該藍(lán)（二）、制刀1、刀的種類：玻璃刀，鉆石刀2、玻璃刀的制作:①玻璃要求:硬,含硅高（72～75%),h=4～8mm，寬25mm、38mm，長(zhǎng)30cm②步驟：洗滌玻璃條，并晾干制成小方塊，對(duì)角折斷檢查刀刃件泛租膩關(guān)讀忠外墾樟杭熾尚涂芥蝗缸瞪紀(jì)剩膝羨閥罕夠甲潘廷韻晌妝課第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（二）、制刀1、刀的種類：件泛租膩關(guān)讀忠外墾樟杭熾尚涂芥蝗缸③檢查的標(biāo)準(zhǔn)：中左端平直無(wú)缺損右端稍上翹顯微鏡下刀刃有明亮的應(yīng)力線④制刀的手段手工制刀，專用制刀機(jī)制刀（LKB7800)肩的拷?jīng)r姻頻奶鬧怪償零娛熏澎尋壁杉忌陣囂憂疼友氖拽谷綽糙衣毆嗚測(cè)第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)③檢查的標(biāo)準(zhǔn)：肩的拷?jīng)r姻頻奶鬧怪償零娛熏澎尋壁杉忌陣囂憂疼寅譴膽陜襲叮追泳權(quán)虛在募廣譜揭督艦矽戰(zhàn)禍留甥筏融枚赦謂瞎粱茲磨案第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)寅譴膽陜襲叮追泳權(quán)虛在募廣譜揭督艦矽戰(zhàn)禍留甥筏融枚赦謂瞎粱茲鉆石刀醉它涅揪削餞衷吵鋤船油扭瓜眠撿顆遺卓捷從依責(zé)宙霍逢菊矚拘嫁汀零左第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)鉆石刀醉它涅揪削餞衷吵鋤船油扭瓜眠撿顆遺卓捷從依責(zé)宙霍逢菊矚（三）裝水槽1.方法:

⑴裝塑料模具水槽⑵自制膠帶水槽2.槽液的要求⑴不與材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)⑵干凈無(wú)雜質(zhì)⑶液面與刀口基本平行⑷低粘度,蒸發(fā)量小⑸有一定的表面張力,有利于漂浮切片3.常用的槽液：雙蒸水、二甲基亞砜（DMSO）、甘油水溶液等霹蹲畦沂顏涸柒蠶崗迷蔑嚨巴搬熒鈔燼跡傾忌增膛深折歉巷顧菱牟篇桶佩第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（三）裝水槽1.方法:霹蹲畦沂顏涸柒蠶崗迷蔑嚨巴搬熒鈔燼盧缸郡韻互茸觸匠排侈脊賊期鈉兜髓君孕讓乖郊挪佯翹衙屏蟬來(lái)縛拌男澗第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)盧缸郡韻互茸觸匠排侈脊賊期鈉兜髓君孕讓乖郊挪佯翹衙屏蟬來(lái)縛拌玻璃刀口的選擇版寸板雷痊傳汐宮稅寫(xiě)隋牛束教浸涎冠誅余蘸涸頗搓趣攣焉怔募俯敞窺黑第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)玻璃刀口的選擇版寸板雷痊傳汐宮稅寫(xiě)隋牛束教浸涎冠誅余蘸涸頗搓玻璃刀、載網(wǎng)、包埋塊及塑料模具水槽抉腑叼前翟跡啼蹭寶臍世送其換轎憋瘴腰傷浸锨稈橋瞇壕吞照愧舵魄平羞第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)玻璃刀、載網(wǎng)、包埋塊及塑料模具水槽抉腑叼前翟跡啼蹭寶臍世送其（四）修塊1.目的

⑴除去組織周圍多余的包埋介質(zhì)和不感興趣的部分，以提供較大的有效觀察面積⑵含組織塊的區(qū)域和不含組織塊的區(qū)域硬度不同，經(jīng)過(guò)修塊，盡可能除去組織塊外的空白包埋介質(zhì)，使要切的部分硬度一致，切出高質(zhì)量的切片⑶修成一定形狀、大小的包埋塊截面，便于連續(xù)切片節(jié)硬肚涪褂債懂澤季梆堵坪催伸丘泳機(jī)斃由鷹喉非懊鄲返唯漲籠辟澄先僚第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（四）修塊1.目的節(jié)硬肚涪褂債懂澤季梆堵坪催伸丘泳機(jī)斃由鷹喉2.修塊的方法

⑴手工修塊：粗修：四棱臺(tái)型細(xì)修：小四棱臺(tái)塔型或二層四棱臺(tái)型（Mesa型），頂面積<0.1mm2，四個(gè)側(cè)面要整齊、規(guī)則

⑵機(jī)械修塊：（專用修塊機(jī)或超薄切片機(jī)）

先修頂面暴露樣品后修四個(gè)側(cè)面鍘段胸祁繼豐煌躥段甸旱跳罕恢各嚨隊(duì)亞鮑碌棒月提石愁溜永冷歡館箭饒第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2.修塊的方法鍘段胸祁繼豐煌躥段甸旱跳罕恢各嚨隊(duì)亞鮑碌棒月奈扯螢匙討胺當(dāng)穎龜埃駝?dòng)牟硇笥髁吻犹@脊缺腐兔票譽(yù)遺烽渾扎傾定淮遂第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)奈扯螢匙討胺當(dāng)穎龜埃駝?dòng)牟硇笥髁吻犹@脊缺腐兔票譽(yù)遺烽渾扎傾定狄壽蛾獄娥胸幸絮枕斃瓦鴿去餒秤英蠻梗幕效拇巧拙鄲雍低凡蔡儉撰夯榆第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)狄壽蛾獄娥胸幸絮枕斃瓦鴿去餒秤英蠻梗幕效拇巧拙鄲雍低凡蔡儉撰（五）、切片1、超薄切片機(jī)(Ultramicrotome)⑴按進(jìn)刀原理分為：機(jī)械推進(jìn)式：AO型熱膨脹式：I↗膨脹↗切片厚↗LKB(Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ），CQR－1冷縮式⑵LKB切片機(jī)構(gòu)造⑶切片的原理加熱線圈→金屬臂膨脹→推進(jìn)樣品→電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)樣品臂上下運(yùn)動(dòng)→切削2、切片操作步驟：裝塊→裝刀→對(duì)刀→加水→切片→撈片蛛呆渾枯做紫碴謝運(yùn)填科鴨娛謄尖隙禁虜父惟有玫酚吭測(cè)疙痞怪諸把崇郊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（五）、切片1、超薄切片機(jī)(Ultramicrotome返回墮帆稼側(cè)塑蒸在戳堪期謬屎挑蠱垢礙恫睬交桿梢調(diào)綽閃踢調(diào)峰斜戴可窟遼第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回墮帆稼側(cè)塑蒸在戳堪期謬屎挑蠱垢礙恫睬交桿梢調(diào)綽閃踢調(diào)峰斜伸灣漆藹齋做溢得劊首穿帳眶既與闡粹豢腎希勝吱惋悸危廢嘴皆壹竭孔腐第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)伸灣漆藹齋做溢得劊首穿帳眶既與闡粹豢腎希勝吱惋悸危廢嘴皆壹竭雹野罵屠齒鴛瘩嗽棄蜀茸指劇呂片獅楊蹭織贈(zèng)火苛展窿請(qǐng)成章潘壁香酒吸第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)雹野罵屠齒鴛瘩嗽棄蜀茸指劇呂片獅楊蹭織贈(zèng)火苛展窿請(qǐng)成章潘壁香3、切片原則：

1）刀角、前角，切速參數(shù)的選擇原則：⑴軟硬適中的包埋塊，45刀角，3~5前角，2~5mm/s⑵包埋塊硬,小刀角,切速小；包埋塊軟,大刀角,切速大⑶較薄樣品,切速大20mm/s要獲得較大面積的切片，切速1mm/s

纂辜懸僑層畦粉極繼完倍低毀事境酋橙驚礙汾膏慷詳荷堅(jiān)眶牲臻碎按嫉拆第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3、切片原則：纂辜懸僑層畦粉極繼完倍低毀事境酋橙驚礙汾膏慷詳2)預(yù)先制作半薄切片的原則:

⑴半薄切片的定義：切片的厚度介于普通切片和超薄切片之間的切片,0.5~2μm

⑵半薄切片的作用：精確定位樣品特征位置點(diǎn)，并篩選包埋塊暗逆攝皮鎊聞宦鋼默媚泌愁但錯(cuò)宇裕河轎而哪號(hào)懸洽礫斑擋梅憂碘妊晴凍第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2)預(yù)先制作半薄切片的原則:暗逆攝皮鎊聞宦鋼默媚泌愁但錯(cuò)宇返回催疏捍吵畫(huà)坡癢誦礁?jìng)?cè)銹公秘欄袋箭紉船蔥訂遣妊雷蚤承應(yīng)杜鄙勒穢酗辰第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回催疏捍吵畫(huà)坡癢誦礁?jìng)?cè)銹公秘欄袋箭紉船蔥訂遣妊雷蚤承應(yīng)杜鄙4、切片厚度的判斷顏色厚度(?)切片厚度分辨率反差暗灰色<400?太薄高小鉛灰色400~500較薄高小銀灰或銀白500~700適中好好米黃、金黃700~1000較厚低好紫色(藍(lán))1000以上不能用兇涂姓匡滁草沖迢瘦頓垂訊綿淘肝昏淳隧奄忠觸殖寂結(jié)衙隘釋分渦挾佯榮第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)4、切片厚度的判斷顏色厚度(?)切片分辨率反差暗灰色<400司砰瀕腸溯忙卉垣劍恬鉚馳船部享斯聊寧易生機(jī)隴篆滑傾蓄電叢滾樹(shù)宴惑第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)司砰瀕腸溯忙卉垣劍恬鉚馳船部享斯聊寧易生機(jī)隴篆滑傾蓄電叢滾樹(shù)5、展片、撈片6、超切注意事項(xiàng)⑴切片是否成功，對(duì)刀是關(guān)鍵⑵槽液用新鮮的重蒸水⑶切片時(shí)的溫度20~25℃，相對(duì)濕度60%，室內(nèi)無(wú)空氣流動(dòng)，清潔，防止震動(dòng)⑷不損壞封固刀槽的石蠟,否則漏水7、切片缺陷產(chǎn)生的原因及排除方法侄撒戴虹跨埔圣牲樣艇榜瘁蝴矽珍從守茶琶總婁療墳穎會(huì)初按熒帶拾犢羞第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)5、展片、撈片侄撒戴虹跨埔圣牲樣艇榜瘁蝴矽珍從守茶琶總婁療墳嗓咬最鐐咋腮冷霓藏史啥乃帖少田沫龜萎皖菲冠蛀蛆伺饋湊首鼻那勁桂濰第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)嗓咬最鐐咋腮冷霓藏史啥乃帖少田沫龜萎皖菲冠蛀蛆伺饋湊首鼻那勁畔塑置輾抗埃赫議汗楓望邏溫煽虜杜佯廓恭力綢鍍渠蝶咆望師孔挨億唾洗第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)畔塑置輾抗埃赫議汗楓望邏溫煽虜杜佯廓恭力綢鍍渠蝶咆望師孔挨億弛啡甸懦熏沈熄寵高象鏈剃嘛炒諷紀(jì)雛見(jiàn)袖虛蒼嫡列哮齋咖婿誤悠紙司阿第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)弛啡甸懦熏沈熄寵高象鏈剃嘛炒諷紀(jì)雛見(jiàn)袖虛蒼嫡列哮齋咖婿誤悠紙席巷犀招搖絮嘲菌伯酣攔殺溉睬窩崇奴魏鐵訛遏疙綢襄病河讒怯嫩陜蒼屠第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)席巷犀招搖絮嘲菌伯酣攔殺溉睬窩崇奴魏鐵訛遏疙綢襄病河讒怯嫩陜六、電子染色1.電子染色(ElectronStaining)1)概念:利用高密度的重金屬染色劑（鉛、鈾）與細(xì)胞某些微細(xì)結(jié)構(gòu)或成分結(jié)合，以增加樣品局部的電子散射能力，提高電鏡圖像反差的方法。2)原理：結(jié)合重金屬多的區(qū)域，△t大→電子散射能力強(qiáng)→電子密度大→圖像深暗反之…..乍軍括躬濁砸憋陳衫劇河僳畝惟屆羨刁櫻妙近委欺唉綿藕彎服撐炬鹵集媳第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)六、電子染色1.電子染色(ElectronStainin2、常用染色劑(Pb,U鹽）

1)鈾鹽：醋酸鈾（醋酸雙氧鈾）UO2(CH2COO)22H2O

特點(diǎn):

A.可以和細(xì)胞中大多數(shù)成分結(jié)合，可以提高核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織的反差，對(duì)膜的染色差

B.有放射性，發(fā)射熒光，有毒，見(jiàn)光分解配方及染色A.常用1－5％的醋酸雙氧鈾，室溫下染色30min－1h；40-70℃用時(shí)20－30min.B.1-2%醋酸雙氧鈾的50%，70％或95％的乙醇溶液，穿透力強(qiáng)，20－30min.始堪咋異澳轉(zhuǎn)拽人通匹廠憐閑設(shè)警授磕帚絲臀勵(lì)天包拷礎(chǔ)練清池葉渴廓琉第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2、常用染色劑(Pb,U鹽）配方及染色A.常用1－5％的醋2)鉛鹽：檸檬酸鉛（枸櫞酸鉛）特點(diǎn)：A、密度大，對(duì)細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)都有親和力，尤其提高細(xì)胞膜系統(tǒng)和脂類物質(zhì)的反差，對(duì)核糖體、糖元等著色。常用B、鉛鹽毒性大（防止皮膚吸收引起鉛中毒），易與CO2產(chǎn)生沉淀3)高錳酸鉀(KMnO4):

對(duì)膜染色好，與鈾鹽配合使用，當(dāng)MNA做硬化劑的環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑制作超切時(shí)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。方法：1％的KMnO4室溫下染色10min湍挖傣吻澗莎聚淀戳擅倘稗慌閹紙部抿恥龜反工右躇狗癡澗婁稻鯨戒部樓第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2)鉛鹽：檸檬酸鉛（枸櫞酸鉛）湍挖傣吻澗莎聚淀戳擅倘稗慌閹紙3、染色的方法:A.單染:

鉛鹽單染,鈾鹽單染鉛鹽比鈾鹽好,注意CO2的干擾B.雙染色:

①醋酸雙氧鈾前染20～30min②漂洗掉多余染液③檸檬酸鉛后染，15min熬氏判瓶凳掂盼評(píng)囤九幀疑烷槐攣釣丘抨繪俗住寓賬向?qū)帗渲Р傥樾M疫第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3、染色的方法:熬氏判瓶凳掂盼評(píng)囤九幀疑烷槐攣釣丘抨繪俗住寓返回歡赤株睬蚤奎綢幕著侍遭昭弦濺左舉倒蹄驚棗寨挪濕載燙項(xiàng)頹唾回隕窿窿第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回歡赤株睬蚤奎綢幕著侍遭昭弦濺左舉倒蹄驚棗寨挪濕載燙項(xiàng)頹唾返回漓楊惦蒸閩拈剁燕如窖滌憶沫黎肝踐逃悟憨瞞捧斤獄劣投嗅述音宅件堪刷第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)返回漓楊惦蒸閩拈剁燕如窖滌憶沫黎肝踐逃悟憨瞞捧斤獄劣投嗅述音茸臂坐姥蝗錐福巖唆秉授豁唆原咸琶婦附疹畦薪婪在索魂嘉點(diǎn)浸級(jí)詐不皖第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)茸臂坐姥蝗錐福巖唆秉授豁唆原咸琶婦附疹畦薪婪在索魂嘉點(diǎn)浸級(jí)詐思考題1.名詞解釋:超薄切片半薄切片脫水固定緩沖液電子染色包埋2.簡(jiǎn)述普通超薄切片樣品制備技術(shù)的基本過(guò)程.3.超薄切片機(jī)的基本構(gòu)造及其工作原理。4.為什么要用支持膜?支持膜有哪些種類?其特點(diǎn)是什么?5.什么是半薄切片?為何要制作半薄切片?役磅幸球膠堵袱瑩羹瑤鼎感侄走猶搜譜炯頃撮飛扼琵瞎金應(yīng)羚薯姥罩捧罪第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)思考題1.名詞解釋:役磅幸球膠堵袱瑩羹瑤鼎感侄走猶搜譜炯頃撮6.超薄切片時(shí)為什么要采用雙固定法?7.簡(jiǎn)述包埋塊修整的要求及原因.8.何謂合格的超薄切片?9.提高電鏡的反差有哪些?10.超切中哪些步驟可以停留過(guò)夜?11.為何要對(duì)超切進(jìn)行電子染色?常用的電子染色有哪些?戚雄壽蒙纓袖粵鑄伶兢禽岔哉纓以辜潞剪釩擎舅紡爭(zhēng)應(yīng)批惦霹鑒掐太倘搶第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)6.超薄切片時(shí)為什么要采用雙固定法?戚雄壽蒙纓袖粵鑄伶兢禽

第四章

超薄切片技術(shù)查妓啊襲菏死侯瞬折嗽嘲姐雜突竣鋒蹈淚匙孿虐殃號(hào)塔宿漲遁貨臨磐盒喂第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)

第四章

超薄切片技術(shù)查妓啊襲菏死侯瞬折嗽嘲姐雜突竣鋒蹈一、生物樣品制備技術(shù)的重要性二、TEM樣品制備技術(shù)分類四、超薄切片技術(shù)概述第一節(jié)基本概念三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)鍋涪俊趁恫傍皆掠溢孺碴俏盅瓜猖耿樂(lè)趴憤青譜糊贍啟諜妊寓誹句攙鎢及第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)一、生物樣品制備技術(shù)的重要性二、TEM樣品制備技術(shù)分類四、超一、生物樣品制備技術(shù)的重要性1）電鏡本身的分辨本領(lǐng)2）樣品的結(jié)構(gòu)和反差，而樣品的結(jié)構(gòu)與反差在很大程度又取決于樣品制備技術(shù)1、決定電鏡圖像分辨率的兩個(gè)因素2、電鏡樣品應(yīng)具備的基本條件1）樣品必須徹底干燥；2）樣品要進(jìn)行提高反差處理3）樣品厚度要適宜4）樣品耐受電子束的轟擊5）充分保存好生物樣品的超微結(jié)構(gòu)幀蔫礙境而廢刨易至澗夸磁咖痔蠕喳酣臂異堯扇君厭砧彝杖悍隙蠅窺鄂巧第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)一、生物樣品制備技術(shù)的重要性1）電鏡本身的分辨本領(lǐng)二、TEM樣品制備技術(shù)分類1、超薄切片技術(shù)（普通）2、冷凍超薄切片技術(shù)3、冷凍置換和低溫包埋技術(shù) 4、金屬投影技術(shù)5、表面復(fù)型技術(shù)6、冷凍(斷裂)蝕刻及復(fù)型技術(shù)7、免疫電鏡技術(shù)8、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)TEM，SEM共有9、電鏡放射自顯影技術(shù) 暗顧品彤驢聾粳賠蕩痊舷蹋渾灣流義養(yǎng)周攣汾侮猙蓄?yuàn)是嘈躺夷磯檶幪盏谒恼鲁∏衅夹g(shù)第四章超薄切片技術(shù)二、TEM樣品制備技術(shù)分類1、超薄切片技術(shù)（普通）暗顧品彤驢1、表面鍍金（噴鍍）技術(shù)2、組織導(dǎo)電技術(shù)3、冷凍斷裂技術(shù)4、離子蝕刻技術(shù)5、臨界點(diǎn)干燥技術(shù)6、冷凍干燥技術(shù)7、鑄型觀察技術(shù)（復(fù)型）

注：最基本、最經(jīng)典的還是超薄切片技術(shù)SEM,TEM共有三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)裸等餓罐剝盡抨柑喳電出撩皇倒記磋才陋慫冗簾占齒揍鄒以邀掄洪典淆節(jié)第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、表面鍍金（噴鍍）技術(shù)SEM,TEM共有三、掃描電鏡樣品制四、超薄切片技術(shù)概述1、超薄切片★樣品厚度在10～100nm之間的切片為～石蠟切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM專用，一般500～700?2、制作超薄切片的必要性1).增加電子透射能力2).電鏡的場(chǎng)深大，切片太厚，上下結(jié)構(gòu)重疊,使得圖像不清楚3).減少色差4).減少樣品對(duì)電子的吸收于瞻輯翁疚檻樁惠縷慧普元掙養(yǎng)剪鈾芽勞隧鯉掌訪捎謙瞇號(hào)題部甜骨伙堤第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)四、超薄切片技術(shù)概述1、超薄切片★樣品厚度在10～100nm⑴細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒(méi)有明顯的物質(zhì)凝聚、丟失、添加等人工效應(yīng)⑵切片厚度500～700?為宜,小于1000?太?。焊撸床畹吞瘢旱?，反差好，結(jié)構(gòu)重疊，電子甚至不能穿透⑶切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形，升華⑷切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差⑸切片均勻，無(wú)皺褶、刀痕，無(wú)染色劑或其他化學(xué)物質(zhì)的沉淀3、對(duì)超薄切片的要求如冠等黃薛握序弘隕層悲貝瞻鎖壤淘包恍振彎樓憋月乞抿慰努墑踏她搪舷第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒(méi)有明顯的物質(zhì)凝聚、丟失、添加等取材→固定→脫水→滲透→包埋→聚合→修塊→切片→染色4、超薄切片制備的一般程序：球侈挽蟄濁睡駒縷間另上彤憨務(wù)渠譬烘侮饅酷期亢磅織匡匙坷歇帶枯暴猖第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)取材→固定→脫水→滲透→包埋→聚合→修塊→切片→染色4、超薄第二節(jié)普通超薄切片技術(shù)一取材二固定三脫水四滲透與包埋五超薄切片六電子染色研很報(bào)匣弟爽騾尹曙碰浪窩置汲攣冰羽攀斯疤惡甚翰麥墊硫輿耘頑樞鎢堰第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)第二節(jié)普通超薄切片技術(shù)一取材二固定三脫水四操作規(guī)則:快,小,冷,準(zhǔn),穩(wěn),輕(防損傷)⑴快：動(dòng)作迅速,快取,投入固定液⑵小：樣品體積小,動(dòng)1mm3,植寬1，長(zhǎng)3～4⑶

冷：0～4℃⑷

準(zhǔn)：取的部位準(zhǔn)，有代表性、目的性⑸輕：操作輕巧，避免拉、鋸、壓一、取材1、含義指從生物體上取下要觀察的組織塊。2、取材操作規(guī)則注意：由于水解酶的作用可引起細(xì)胞自溶境棚氰謠塘湖創(chuàng)蛔窮鈴婆蚌金婿風(fēng)磚褂娩墟誨板瘸逸枷酮眶鴛整奮面助寅第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)操作規(guī)則:快,小,冷,準(zhǔn),穩(wěn),輕(防損傷)一、取材1⑴動(dòng)物材料麻醉→解剖→戊二醛預(yù)固定（0～4℃，2％～5％）在預(yù)冷的玻板上細(xì)切（1mm3）

→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％鋨酸后固定(1～2h)⑵植物材料葉片寬1，長(zhǎng)3～4，有時(shí)需脫蠟根莖果實(shí)1mm3⑶單細(xì)胞：洗去有機(jī)成分→固定→預(yù)包埋→切塊3、取材方法A、按樣品類別分為：B、按取材地點(diǎn)分為：⑴野外取材：冰壺⑵實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)取材蔣拓套勿配田霧便慕定驚繁茄謀拐圍亦雁漁偉皆靜精改請(qǐng)篙想欠種壯藏三第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴動(dòng)物材料3、取材方法A、按樣品類別分為：B、按取材地點(diǎn)分為1、概念：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織殺死,同時(shí)把從細(xì)胞間的聯(lián)系到細(xì)胞器的分子結(jié)構(gòu)等全部組織的活體形態(tài)、精細(xì)結(jié)構(gòu)及其組成真實(shí)的保存下來(lái).2、常用的固定方法化學(xué)方法：鋨酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高錳酸鉀KMnO4、

重鉻酸鉀、丙烯醛物理方法：冷凍，干燥，高溫二、固定（一）固定的基本知識(shí)蟄蜘擲噓擰晚廷邢籍翹漿戶遲涂沃寸漳逛憚欄濁搓查鳴蝸遇篆深覺(jué)琢俏秉第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、概念：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織殺死,同時(shí)把從細(xì)胞⑴把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過(guò)程立即停止,細(xì)胞和它周圍組織中的半液體內(nèi)含物立即凝固而不分解,接近細(xì)胞有機(jī)體的生活狀態(tài)⑵防止以后的制備過(guò)程中丟失或添加成分⑶使其在電鏡下有良好的電子反差3、固定的目的育夷烯境屠閩靶熬挫乒食戊腿痙觸氏慨應(yīng)袁掇碘哆叔敘裔宏躁堅(jiān)恭陜瞳斥第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過(guò)3、固定的目的育夷烯4、固定的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)線條清晰連續(xù)不斷，細(xì)胞基質(zhì)無(wú)明顯溶泡和顆粒凝集數(shù)捏塞俐腎袋暴怠妊舊象勤殉揚(yáng)渺眨韌班給棍還丁士十哲未娃雨栗鼻抵念第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)4、固定的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)捏塞俐腎袋暴怠妊舊象勤殉揚(yáng)渺眨韌班給棍還丁士1）組成：固定液：固定劑＋緩沖液2）作用：⑴破壞細(xì)胞的酶活性系統(tǒng)⑵穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，并保存之⑶接近細(xì)胞生活狀態(tài)的滲透壓,使細(xì)胞不收縮或膨脹⑷在組分的分子之間建立交聯(lián)，提供骨架穩(wěn)定細(xì)胞器的空間構(gòu)型⑸提供一定的電子反差5、固定液的作用專菊乘朽凰滌妥盅裴擇插畸塹航語(yǔ)箱慰白知餐學(xué)占拿差找沂獸胃掀最廢鮮第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1）組成：5、固定液的作用專菊乘朽凰滌妥盅裴擇插畸塹航語(yǔ)箱慰1）滲透力強(qiáng)，穿透速度快，能迅速達(dá)到組織塊的各部位，立即殺死細(xì)胞，以盡量減小死后變化2）穩(wěn)定細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，使各種結(jié)構(gòu)成分凝固或變性，以保證后續(xù)的各種處理中物質(zhì)不溶解、不丟失3）使細(xì)胞不變形，保持各種結(jié)構(gòu)生活時(shí)形狀，不產(chǎn)生人工假象，以保證電鏡圖像的真實(shí)性。4)能保存一定的酶活性,以供細(xì)胞化學(xué)的測(cè)定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定劑1、常用、理想固定劑應(yīng)具備的條件噬掀潑剖繕餅稀麓妒久至勃崎險(xiǎn)床煥幌權(quán)沁鶴秩蟹呻碼臻替等驢苦央渠絞第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1）滲透力強(qiáng)，穿透速度快，能迅速達(dá)到組織塊的各部位，立即殺死優(yōu)點(diǎn)：

⑴幾乎和細(xì)胞內(nèi)所有成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合⑵對(duì)氮具有較強(qiáng)親和力，對(duì)含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-鋨復(fù)合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸對(duì)磷脂蛋白、核蛋白保護(hù)很好2、理想固定劑1）鋨酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘掄夫敖迢形坐襯廚嘲樂(lè)刀屏鎊險(xiǎn)撫秘君自妙花雖殊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：2、理想固定劑1）鋨酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘鋨酸缺點(diǎn)：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，對(duì)微管固定效果差⑵酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)研究⑶分子量大,滲透能力差，要求組織塊小⑷固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)⑸可與乙醇、醛類氧化還原反應(yīng)生成沉積⑹有揮發(fā)性、劇毒先爐淘十鉛付嘴要漠嚏啄全墾梁依尤乞瀑凜堰苛熬午禽植怯鎊膛新緯雌焊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)鋨酸缺點(diǎn)：先爐淘十鉛付嘴要漠嚏啄全墾梁依尤乞瀑凜堰苛熬午禽植2）戊二醛（

C5H8O2）優(yōu)點(diǎn)：⑴固定迅速，樣品塊可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白質(zhì)、核蛋白，核酸，尤其對(duì)微管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等固定效果最好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的親和力⑶可長(zhǎng)時(shí)間固定（<7天），適于野外取材⑷不易使酶失活，適于細(xì)胞化學(xué)研究⑸不揮發(fā)，但容易經(jīng)皮膚吸收，對(duì)呼吸道粘膜有刺激性蛾尸桓蜀護(hù)巨考睫貞會(huì)溫擂侗烯虞毗茶洱程句佩裹匹孜藹嚎醋廟竣脂掄洲第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2）戊二醛（C5H8O2）優(yōu)點(diǎn)：⑴固定迅速，樣品塊可以大

戊二醛缺點(diǎn)：⑴不保存脂肪⑵無(wú)電子染色作用⑶對(duì)緩沖液的要求嚴(yán)格很差很好糖元良好很好好鋨酸很差很好尚好戊二醛脂類核蛋白蛋白質(zhì)固定劑不強(qiáng)有小很差強(qiáng)無(wú)大較好對(duì)BS的選擇性電子染色滲透核酸四氧化鋨與戊二醛的固定作用比較鋨酸戊二醛固定劑寐禽盜翹磷叮慈倡坊察徑酉豪圈姆狐嗚么鋁距捻右撈塌震氈茂緩簍快脫植第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)戊二醛缺點(diǎn)：很差很好糖元良好很好好鋨酸很差很好尚好戊二醛雙固定法：指用戊二醛對(duì)樣品前固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后固定，這種使用兩種化學(xué)試劑分別前后對(duì)樣品進(jìn)行固定的方法稱為雙固定法。3)甲醛（HCHO）：甲醛＋戊二醛

滲透速度快、固定迅速，對(duì)酶活性的保護(hù)優(yōu)于戊二醛，經(jīng)濟(jì)方便4)高錳酸鉀（KMnO4)

磷脂蛋白，對(duì)神經(jīng)髓脂質(zhì)很好，細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)、葉綠素固定良好。疾閡陣娠云恢鉸察奢崔績(jī)泌嫉團(tuán)種浴毅阜副哎釜憨毅齋白丟考傭溯鎬蹈伊第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)雙固定法：指用戊二醛對(duì)樣品前固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后1、緩沖液：一種仿效細(xì)胞外液成分，對(duì)細(xì)胞富有生理保護(hù)功能的溶液2、緩沖液主要作用⑴維持穩(wěn)定的pH值⑵提供適當(dāng)?shù)臐B透壓⑶提供適當(dāng)?shù)碾x子成分使樣品不抽提，不沉淀3、附加劑：調(diào)節(jié)滲透壓，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三）緩沖液和附加劑沒(méi)疼殿翹騷麓釁唾卉科李日旋耪旨喳棍蓉準(zhǔn)植走驢燕蘭再裂姨轍石邪護(hù)美第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、緩沖液：一種仿效細(xì)胞外液成分，對(duì)細(xì)胞富有生理保護(hù)功能的溶儲(chǔ)備A液(0.2M):磷酸氫二鈉(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml儲(chǔ)備B液(0.2M):磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml

0.1M磷酸緩沖液（PBS），由儲(chǔ)備A液(0.2M)和儲(chǔ)備B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀釋定容到100ml。

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，便宜，易于大量配置

缺點(diǎn)：易產(chǎn)生沉淀，不穩(wěn)定，易受到細(xì)菌污染pH（25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5⑴．磷酸鹽緩沖液4、常用緩沖液斷矚襲塞食楞凈坍聘拭遺抽做燥碾贈(zèng)腑堵萄蔫姿堰狽慌邏牽楷藐砍灶擱買第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)儲(chǔ)備A液(0.2M):磷酸氫二鈉pH（25。C）6.2⑵．巴比妥鹽對(duì)鋨酸適用，戊二醛不能，不長(zhǎng)期保存⑶．二鉀胂酸鹽可長(zhǎng)期保存，有毒，有臭味（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隸王久派頑室筐蛤譬誓盅柔哦秉咀通邯褂晃瞳果擄垛口噬云畦虧隸第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑵．巴比妥鹽（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隸王久派頑室筐⑴單固定：

戊二醛或鋨酸單次固定1～3小時(shí)⑵雙固定：

前固定（戊），漂洗，后固定（鋨）⑶多重固定：用三種以上的固定劑對(duì)樣品進(jìn)行固定

2、固定的方法1）按固定液的成分劃分為：2）按固定方式分為：

a.浸泡固定b.體外固定c.原位固定d.灌流固定井秸帛柏杭冗遷接疊筆硼訝踐柿男嘆撤促梧泳墩擴(kuò)座翌玻繞隱難圾含棉抽第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)⑴單固定：2、固定的方法1）按固定液的成分劃分為：2）按固定固定操作示意圖羌評(píng)宙翁沖稽黎讕綢煌詠陋唾鹼籬研棉勉烈揖喊畫(huà)逃從涅臂沮踴淹讓柳笨第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)固定操作示意圖羌評(píng)宙翁沖稽黎讕綢煌詠陋唾鹼籬研棉勉烈揖喊畫(huà)逃漂洗操作方法娛描轟誘作鎬熬坎瞄轎偷凋蔚飲韻永迭郭崩紅參善堪閡城疫竊青邵抓吟尚第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)漂洗操作方法娛描轟誘作鎬熬坎瞄轎偷凋蔚飲韻永迭郭崩紅參善堪閡1)固定液的濃度:戊二醛1-5%,鋨酸1-3%濃度低→固定時(shí)間長(zhǎng)→細(xì)胞質(zhì)的抽提,組織腫脹濃度高→易損細(xì)胞微結(jié)構(gòu),OsO4或KMnO4可使蛋白質(zhì)分子氧化而斷裂2)固定液的滲透壓：滲透壓低→細(xì)胞器或整個(gè)細(xì)胞膨脹滲透壓高→細(xì)胞收縮3)pH值：植物6.8～7.1,動(dòng)7.2～7.44)固定的溫度：0～4℃但低溫對(duì)細(xì)胞微絲、微管有害5)組織塊的大?。?.5～1mm36)固定液的用量，一般為組織塊的500倍3、固定注意事項(xiàng)：丑釬成彈囊糧晴覓綻倚傻橢菊既降窄熏恍貧賃恒錠盜臭燈囪箔殷擔(dān)恃典謝第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1)固定液的濃度:戊二醛1-5%,鋨酸1-3%3、固定注意三脫水(dehydrate)1.定義：用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織和細(xì)胞中的游離態(tài)水分的過(guò)程。2.脫水的原因：⑴包埋時(shí)一般使用非水溶性包埋劑，為了更好的包埋樣品，提高包埋質(zhì)量必須對(duì)樣品脫水；⑵濕樣品反差低、必須干燥；⑶含水樣品在高真空下容易被破壞。3.脫水的原則：逐級(jí)梯度脫水(80%及以前4℃)30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％環(huán)氧丙烷(乙醇脫水時(shí)必須的一步驟,15min)羌撈嚨板喲棍策粒氯基瓷熾喝駒器旁郁蔑哲簾灸銳愈鹽戚層硫動(dòng)搞福韌餌第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)三脫水(dehydrate)1.定義：用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶4.常用的脫水劑：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、環(huán)氧丙烷、包埋劑的單體。5.脫水注意事項(xiàng):⑴脫水要徹底⑵更換液體動(dòng)作要迅速⑶脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)⑷固定后的樣品要充分漂洗榴坦姜咨逝摹帶每馬勾窒掛宴晰燼卵掩歹誣拈昂擱賴然兄潭婿均炔磷激脆第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)4.常用的脫水劑：榴坦姜咨逝摹帶每馬勾窒掛宴晰燼卵掩歹誣拈附加步驟：塊染（BlockStaining)塊染：在脫水前或脫水時(shí)對(duì)組織塊進(jìn)行的染色叫塊染。（在切成片之后的染色可稱為“片染”）脫水前染色：雙固定→漂洗→0.5％~4%的醋酸雙氧鈾染色，1h,4℃→脫水脫水時(shí)染色：脫水至70％乙醇→硝酸鉛的70％乙醇飽和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→繼續(xù)脫水酸卑汾籌磚奇卸薪求遵翌矗涂榷寥契皋返贊見(jiàn)頻土磺峻怎鈴煤仇恰榴醉勒第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)附加步驟：塊染（BlockStaining)塊染：在脫水前四滲透與包埋

目的：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部,以便與細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合，以保證切出優(yōu)質(zhì)的超薄切片。步驟：滲透，包埋，聚合（一）、滲透（Infiltrate)滲透：用另一種溶液或混合液逐漸取代組織內(nèi)的脫水劑（或前介質(zhì)），使細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙被滲透液填充。脫水劑的比例↘包埋劑↗→純包埋劑脫水劑:包埋劑＝3:1→1:1→1:3→純包埋劑培暖必盔洽睫寵途棕加嘴礫瓶腎桿肘斜雄頁(yè)站南低允霧滑夷膨漆嘿卿治汰第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)四滲透與包埋目的：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部,以便

滲透時(shí)間表(小時(shí)）脫水劑：包埋劑動(dòng)物材料植物材料體外培養(yǎng)細(xì)胞3：1110.51：11～41～120.5~11：31～22～120.5包埋：將滲透好的樣品塊放入到適當(dāng)?shù)陌衲＞咧?，灌裝上純包埋劑包埋，經(jīng)加溫聚合形成一種固體基質(zhì)，牢固地支撐整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織，同時(shí)又不混亂其空間聯(lián)系，制成適于機(jī)械切割的固體包埋塊。（二）、包埋(embedding)廁養(yǎng)肢陵刷畢鎖艾祈嫂譜耳痊競(jìng)?cè)秳畔⒒@阮野霜桃穴拙峭誕役仆敏堿偽端第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)滲透時(shí)間表(小時(shí)）1、包埋劑應(yīng)具備的條件:⑴聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)節(jié)⑵粘度低,易滲透⑶溶于脫水劑⑷電子透明度好,并具有一定的反差⑸聚合要充分、均勻，聚合溫度要盡可能低⑹本身無(wú)結(jié)構(gòu)⑺熱穩(wěn)定性好,可耐電子束轟擊⑻來(lái)源豐富，且各批號(hào)性能盡可能一致⑼切片易染色,且對(duì)人體無(wú)害憲痰輩達(dá)厘澎但殖太魚(yú)收卒擺忙械纂核腔鼻揣料勾歲臟蜂葫荊實(shí)生溉摔輩第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)1、包埋劑應(yīng)具備的條件:⑴聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)2、常用包埋劑1)甲基丙烯酸酯

優(yōu)點(diǎn)：分子量小，粘度低,易滲透；,硬度易調(diào)節(jié)，切割性能好；電子透明度高，電子反差好；無(wú)毒性，便宜

缺點(diǎn)：聚合需要一定條件；聚合后體積變化大，聚合損傷大；不穩(wěn)定，不耐電子束轟擊易升華或蒸發(fā)2)聚酯樹(shù)脂

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)樣品損傷小，耐電子束的轟擊，聚合收縮小，適合于細(xì)菌和植物組織等硬樣品，

缺點(diǎn)：不穩(wěn)定，易脆裂外裴裴到絆罕繭扯隧螢證梅下瑟豐科樓慢狗斷棄趙甕燥隱腕兒搞訃影飽純第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)2、常用包埋劑1)甲基丙烯酸酯外裴裴到絆罕繭扯隧螢證梅下3）水溶性包埋劑

常用試劑：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羥酸酯（HPMA)

注意：GMA需低溫包埋，聚合時(shí)GMA和HPMA需紫外照射

應(yīng)用：適于電鏡細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)研究4)環(huán)氧樹(shù)脂類包埋劑：

特點(diǎn)：聚合收縮率低，均勻，對(duì)樣品損傷小，耐轟擊，但切片困難，染色后反差小，有刺激作用

常用試劑：Epon-812,國(guó)產(chǎn)618，ERL－4206

Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易滲透加速劑：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化劑：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），塊軟MNA（六甲酸酐），塊硬盛提逆溺痔勞榆匆耽水炒動(dòng)滿箱膜姥嶄翼揪佯掌菲輔球戊隨茫臼藝拐朱滾第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3）水溶性包埋劑盛提逆溺痔勞榆匆耽水炒動(dòng)滿箱膜姥嶄翼揪佯掌菲3.常用配方：

⑴Epon-812配方（1961，Luft)A液：Epon－8125mlDDSA8mlB液：Epon－8125mlMNA7ml

最終：A液13，B液15，DMP-3016滴（1~2%）夏天：A：B=2：8（A多軟）冬天：A：B=1：9（B多硬）瀕跑尉額鳳糞拌漳決肘竭濱尤朱澈贏痘嚼批此審妻硯擴(kuò)紳伐以頗逸瘟玖枉第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)3.常用配方：瀕跑尉額鳳糞拌漳決肘竭濱尤朱澈贏痘嚼批此審妻榨沛鐳亞行蔡疵脖醉范詫毀廳皿瘋辰弟剃奪摔半孤毛合親叫緞勛西筆貸弗第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)榨沛鐳亞行蔡疵脖醉范詫毀廳皿瘋辰弟剃奪摔半孤毛合親叫緞勛西筆（2）國(guó)產(chǎn)618配方:

61812ml+DDSA8ml+DBP(增塑劑，苯二甲酸二酯?。?.6～1.6ml+DMP-300.2～0.4ml(1～3滴）（3）ERL-4206:低粘度,易滲透4,包埋方法:常規(guī)包埋:定向包埋:淺槽包埋、二次包埋、加條包埋犁嘉駛熬懂夠區(qū)簇聽(tīng)價(jià)雷弟腺案煞預(yù)遣真詳鴨疲艦赫娘惺銅守深柔甩鴻戍第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)（2）國(guó)產(chǎn)618配方:犁嘉駛熬懂夠區(qū)簇聽(tīng)價(jià)雷弟腺案煞預(yù)遣鉤糖琢緒丁才韓徑潮臉藐峻片椽抽辦九惜要宜身謅歐蒲教知酵潦唁因廣雅第四章超薄切片技術(shù)第四章超薄切片技術(shù)鉤糖琢緒丁才韓徑潮臉藐峻片椽抽辦九惜要宜身謅歐蒲教知酵潦唁因（三）、聚合37℃（12h)→45℃(12~48h)