生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)

關(guān)于生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)第1頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五發(fā)酵工程制藥第一節(jié)：微生物細(xì)胞工程（發(fā)酵工程制藥）生產(chǎn)原理第二節(jié)：利用微生物進(jìn)行藥物的生產(chǎn)實(shí)例

第2頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五第一節(jié)：微生物工程（發(fā)酵工程制藥）生產(chǎn)原理人工培養(yǎng)的微生物，通過體內(nèi)的特定酶系，經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程和代謝作用，最終合成人們所需要的藥物如抗生素、氨基酸、有機(jī)物、維生素。這種方法稱為微生物細(xì)胞工程。第3頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五一：最常用的工業(yè)微生物二：微生物的培養(yǎng)技術(shù)三：細(xì)胞濃度的測(cè)量四：微生物發(fā)酵的工藝學(xué)原理五：工業(yè)微生物菌種的制備和改良六：發(fā)酵生產(chǎn)過程七：滅菌技術(shù)八：分離純化技術(shù)九：干燥技術(shù)講解分章節(jié)內(nèi)容第4頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五一：最常用的工業(yè)微生物1：細(xì)菌2：放線菌3：霉菌4：酵母

青霉菌第5頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1：細(xì)菌（1）醋桿菌屬--------醋化醋桿菌（Acetobacteraceti）可以將酒精轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿?。弱氧化醋桿菌（Acetobactersuboxydans）可以將山梨糖醇轉(zhuǎn)變?yōu)樯嚼嫣恰＃?）乳桿菌屬--------德氏乳桿菌（Lactobacillusdelbriiekii）可以將糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樘?。?）鏈球菌屬（Streptococcus）-------用來生產(chǎn)乳酸。（4）片球菌屬（Pediococcus）-------用來生產(chǎn)乳酸。（5）串珠菌屬（Leuconostoc）-------用來生產(chǎn)乳酸。（6）芽孢桿菌屬-------枯草桿菌（Bacillussubtilis）可以用來生產(chǎn)α-淀粉酶、肌苷、鳥苷等核苷。（7）梭菌屬------丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylium）用來生產(chǎn)丙酮、丁醇。（8）大腸桿菌（Escherichiacoli）用來作為基因工程的克隆菌。第6頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2：放線菌有以下分類紅霉素鏈霉菌（S.enytnreus）能產(chǎn)生紅霉素?？敲顾劓溍咕⊿.kanamycetieus）能產(chǎn)生卡那霉素金霉素鏈霉菌（S.aureofaciens）能產(chǎn)生金霉素。委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（S.veneznelae）能產(chǎn)生氯霉素第7頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3：霉菌（1）曲霉屬-------米曲霉（Aspergillusoryzae）能產(chǎn)生高峰淀粉酶。（2）黑霉屬（A.niger）------能產(chǎn)生酸性蛋白酶、蛋白酶。（3）青霉屬--------點(diǎn)青霉（Penicillium.notatum）、產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）能產(chǎn)生青霉素。橘青霉（P.citrinum）可產(chǎn)生核酸酶P1。第8頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4：酵母酵母屬-------最常用的是釀酒酵母，用于進(jìn)行酒精發(fā)酵。第9頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五二：微生物的培養(yǎng)技術(shù)（一）培養(yǎng)基組成（二）培養(yǎng)基的分類（三）培養(yǎng)方法（四）培養(yǎng)條件

第10頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（一）培養(yǎng)基組成1、碳源一般為蔗糖、葡萄糖。工業(yè)用碳源為淀粉水解液、糖蜜、干薯粉、甲醇、乙醇、石油、醋酸等等材料。2、氮源主要有硫酸銨、尿素、豆餅水解液。3、無機(jī)鹽磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀七水硫酸鎂。4、微量生長因子生物素硫銨素玉米漿最常用第11頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（二）培養(yǎng)基的分類1、細(xì)菌用培養(yǎng)基以肉湯+蛋白胨+酵母膏作為其組成物質(zhì)。2、酵母、霉菌用培養(yǎng)基--------以曲汁和麥芽汁為最常用將米曲（或者麥芽汁）添加適量水，在55℃下糖化2小時(shí)，經(jīng)過過濾，濾液稀釋至糖度10度，備用。3、培養(yǎng)霉菌則專用蔡氏霉菌培養(yǎng)劑蔗糖20-30g、硝酸鈉3g、磷酸二氫鉀1g、氯化鉀0.5g、七水硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蒸餾水1L。4、工業(yè)用培養(yǎng)基---------定量組成培養(yǎng)基配方第12頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（三）培養(yǎng)方法按培養(yǎng)基類型分為----------固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法。按操作方式分為---------分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)。按氧氣供應(yīng)分為--------需氧培養(yǎng)、厭氧培養(yǎng)。下面分別介紹其中重要的5種方法：第13頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、淺盤培養(yǎng)該方法選用于固體培養(yǎng)法、也適用于液體培養(yǎng)法。其方法是將固體或者液體培養(yǎng)基盛于不銹鋼制的淺盤內(nèi)，接種菌種，在保溫室內(nèi)培養(yǎng)。第14頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、厚層通風(fēng)培養(yǎng)此方法用于固體培養(yǎng)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)量大，并且節(jié)省勞動(dòng)力。國內(nèi)醬油廠多采用此法。所用設(shè)備是在水面建造大型水泥槽水泥槽底部鋪上多孔板板上放置固體培養(yǎng)基接種之后將空氣由多孔板下部通入培養(yǎng)基內(nèi)第15頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、液體通風(fēng)深層培養(yǎng)簡稱深層培養(yǎng)法，是最先進(jìn)的方法。在我國，抗生素、檸檬酸的生產(chǎn)常常采用此法。第16頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4、厭氧培養(yǎng)（1）簡單的方法是，用一般的發(fā)酵槽，撤去通風(fēng)設(shè)備。

（2）真正的方法是必須把氧氣抽除，采用真空泵來抽去氧氣。

較為先進(jìn)的方法是加拿大的BBLGasPak150的厭氧培養(yǎng)器采用由水發(fā)生氫氣的方法此氫氣與氧氣反應(yīng)，遂形成真空。第17頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五5、大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)一般采用幾千升、幾萬升的培養(yǎng)罐。采用逐步擴(kuò)大法生產(chǎn)將酵母進(jìn)行斜面培養(yǎng)

移至500L的種子罐作為工業(yè)發(fā)酵的種醪

移至含5ml曲汁的試管之中30℃培養(yǎng)24小時(shí)。

移至10L的曲汁卡瓦罐中30℃培養(yǎng)48小時(shí)。

移至500ml的巴士瓶中30℃培養(yǎng)48小時(shí)最后進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)第18頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（四）培養(yǎng)條件1、培養(yǎng)基濃度2、溫度3、PH值4、氧氣5、氮源6、微量因子第19頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、培養(yǎng)基濃度一般為含葡萄糖10%最高可以通過流加法達(dá)到15%。第20頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、溫度一般為30-33℃超過33℃時(shí)應(yīng)該進(jìn)行冷卻。第21頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、PH值（1）酵母菌為PH=4.0--6.0（2）細(xì)菌的PH=6.0--7.5（3）霉菌生產(chǎn)的PH值則在4.0--9.0之間。第22頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4、氧氣微生物的類別有需氧菌、厭氧菌、兼性菌三種。各自需要不同的氧氣條件。測(cè)定培養(yǎng)劑的溶解氧是一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵。第23頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五5、氮源一般情況下，是以使用尿素為最適合，因?yàn)橐粍t尿素可以維持發(fā)酵液的PH值不變，同時(shí)又能夠供給氮源的需要。使用硫酸銨時(shí)，由于其殘留的硫酸根使得發(fā)酵液PH值變小必須用堿性物質(zhì)中和第24頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五6、微量因子主要是指維生素，它是微生物生長所不可缺少的營養(yǎng)成份所需。很多天然的碳源與氮源之中一般均含有眾多的維生素物質(zhì)配制培養(yǎng)基時(shí)一般不需另外添加第25頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五三：細(xì)胞濃度的測(cè)量（一）直接測(cè)定法（二）間接測(cè)量法第26頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（一）直接測(cè)定法特點(diǎn)是直觀精確4濁度法3平板計(jì)數(shù)法2顯微計(jì)數(shù)法1細(xì)胞干重法第27頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、細(xì)胞干重法將一定體積的培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞，洗滌、干燥、進(jìn)行稱重。不足之處是此方法不適用于統(tǒng)計(jì)含有不溶性沉淀物的培養(yǎng)液。

第28頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、顯微計(jì)數(shù)法利用顯微鏡和血球計(jì)數(shù)器、測(cè)定單位體積內(nèi)培養(yǎng)液中的細(xì)胞個(gè)數(shù)。缺點(diǎn)是：

（1）不適用于絲狀生物體的計(jì)數(shù)。

（2）不能區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

（3）由于細(xì)菌太小，不適于進(jìn)行計(jì)數(shù)。第29頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、平板計(jì)數(shù)法將樣品用無菌生理鹽水進(jìn)行逐一數(shù)量級(jí)的稀釋然后取一定量的稀釋液涂于瓊脂平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，從平板上長出的菌落數(shù)量，可以計(jì)算出原培養(yǎng)液中微生物的濃度。其優(yōu)點(diǎn)是可用于測(cè)定活細(xì)胞的濃度第30頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4、濁度法由于培養(yǎng)液的濁度和光密度與培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度成正比關(guān)系，因此，可以通過分光光度計(jì)法用600-700nm波長進(jìn)行測(cè)定。其優(yōu)點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確。第31頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（二）間接測(cè)量法1、測(cè)定細(xì)胞成份------可以通過測(cè)定培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)、DNA、RNA的含量來確定細(xì)胞的濃度。2、培養(yǎng)液中細(xì)胞虛體積的測(cè)定------將一定體積的培養(yǎng)液在一定速度下離心，由于不溶性成份的密度較大，經(jīng)過離心后，一般均沉入底部，而活細(xì)胞則呈現(xiàn)出半懸浮狀態(tài)，因此，沉降物總量-沉淀物的數(shù)量=細(xì)胞的估算量。3、粘度------培養(yǎng)液的粘度與所含的細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。4、利用培養(yǎng)過程中產(chǎn)生熱量的多少來測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量。5、利用發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗量來測(cè)定細(xì)胞的濃度。6、利用最終產(chǎn)物的合成數(shù)量，來測(cè)定培養(yǎng)液中細(xì)胞的數(shù)量。7、利用熒光素測(cè)定細(xì)胞中ATP的數(shù)量，測(cè)定活細(xì)胞的濃度。第32頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五四：微生物發(fā)酵的工藝學(xué)原理（一）分批培養(yǎng)（二）連續(xù)培養(yǎng)（三）其它培養(yǎng)方法第33頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（一）分批培養(yǎng)3點(diǎn)1、分批培養(yǎng)的定義2、分批培養(yǎng)的生長過程3、分批培養(yǎng)過程中影響細(xì)胞生長的因素第34頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、分批培養(yǎng)的定義分批培養(yǎng)是一種間歇式的培養(yǎng)方法，在每一批次的培養(yǎng)過程中，不再加入其它營養(yǎng)物料。待生物反應(yīng)進(jìn)行到一定程度之后，將全部培養(yǎng)液倒出、進(jìn)行后道工序的處理。為了提高生物反應(yīng)器在分批培養(yǎng)中的效率通常采用多級(jí)分批培養(yǎng)的辦法。即在小型生物反應(yīng)器中接入少量種子經(jīng)過分批培養(yǎng)，來獲得較大數(shù)量的細(xì)胞作為種子再轉(zhuǎn)入到大型生物反應(yīng)器中分批培養(yǎng)的設(shè)備要求較少操作也較簡單工業(yè)微生物生產(chǎn)中經(jīng)常采用第35頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、分批培養(yǎng)的生長過程培養(yǎng)中的細(xì)胞經(jīng)過4個(gè)生長階段：（1）延遲期（2）指數(shù)生長期（3）靜止期（4）衰亡期

第36頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、延遲期（1）種齡越長，延遲期越長，

（2）接種量越少、延遲期越長4、衰亡期營養(yǎng)物質(zhì)消耗貽盡培養(yǎng)液中有害物質(zhì)積累太多導(dǎo)致培養(yǎng)液中的細(xì)胞開始死亡，稱為衰亡期。

3、靜止期隨著營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗、細(xì)胞的生長速率開始下降，最終細(xì)胞濃度不再增加，稱為靜止期。2、指數(shù)生長期細(xì)胞的倍增時(shí)間指細(xì)胞濃度增長一倍所需要的時(shí)間。微生物的倍增時(shí)間一般為0.5—1小時(shí)。第37頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、分批培養(yǎng)中影響細(xì)胞生長的因素共有以下5種影響因素：（1）營養(yǎng)物質(zhì)濃度（2）溫度（3）PH值（4）溶解氧濃度（5）產(chǎn)物第38頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）營養(yǎng)物質(zhì)濃度營養(yǎng)物質(zhì)的限制性濃度-------當(dāng)某一種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度下降到一定程度之后，就會(huì)影響細(xì)菌的生長，此時(shí)的濃度就稱為營養(yǎng)物質(zhì)的限制性濃度。營養(yǎng)物質(zhì)的最大濃度-------當(dāng)某一種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度超過一定程度之后，也會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制作用。第39頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）溫度當(dāng)培養(yǎng)溫度偏低時(shí)，細(xì)胞的生長速率較低，隨著溫度的升高，細(xì)菌的生長速率也隨之加快，當(dāng)溫度超出一定范圍時(shí)，由于蛋白質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變性，導(dǎo)致細(xì)菌生長速率的急速下降。微生物細(xì)胞的最適生長溫度并不等于其代謝產(chǎn)物的最佳生產(chǎn)溫度。因此在具體的生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)的前期常常將溫度調(diào)控在有利于細(xì)胞生長的區(qū)域，而在后期則常常將溫度轉(zhuǎn)到最佳的生產(chǎn)溫度，以獲得較多的產(chǎn)物第40頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求的不同，可以將微生物分成----低溫菌，中溫菌，高溫菌。采用高溫菌生產(chǎn)有許多優(yōu)點(diǎn)：

（1）高溫菌所生產(chǎn)出的酶，其熱穩(wěn)定性較好。

（2）高溫菌的培養(yǎng)溫度較高，細(xì)胞的生長速率較大。

（3）不容易發(fā)生雜菌污染。

（4）在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可以節(jié)約冷卻水、同時(shí)能夠減少動(dòng)力消耗。發(fā)酵溫度調(diào)控技術(shù)第41頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）PH值細(xì)菌適宜于在中性、弱堿性的條件下生長。酵母菌、霉菌則喜酸性環(huán)境。乳酸菌、醋酸菌對(duì)于低PH值環(huán)境有著很好的耐受性。第42頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（4）溶解氧濃度不同的培養(yǎng)過程對(duì)于溶解氧有著不同的要求應(yīng)該根據(jù)具體情況來加以控制。

空氣過濾片第43頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（5）代謝產(chǎn)物的抑制作用細(xì)胞的代謝產(chǎn)物會(huì)影響到細(xì)胞的生長，這種現(xiàn)象稱作產(chǎn)物抑制作用。

而代謝產(chǎn)物多數(shù)就是生物制物的原材料。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中要設(shè)法定期收集細(xì)胞的代謝產(chǎn)物第44頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（二）連續(xù)培養(yǎng)1、連續(xù)培養(yǎng)方法的優(yōu)缺點(diǎn)2、連續(xù)培養(yǎng)法的分類第45頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五細(xì)菌連續(xù)培養(yǎng)的設(shè)備簡化示圖

第46頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、連續(xù)培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)（1）細(xì)胞生長速率較高。（2）連續(xù)培養(yǎng)可發(fā)使得培養(yǎng)液達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)2、連續(xù)培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)（1）連續(xù)培養(yǎng)延續(xù)的時(shí)間長，發(fā)生雜菌污染的概率也就增加（2）長時(shí)期進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)生變異、質(zhì)粒丟失、基因突變、（3）細(xì)菌株生產(chǎn)性能退化的現(xiàn)象也就比較突出第47頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、連續(xù)培養(yǎng)法的分類可以分為以下3類：（1）單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)（2）細(xì)胞回流式的單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)（3）多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)第48頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)新鮮培養(yǎng)基的加入速率=培養(yǎng)之后的物料抽出速率。這種培養(yǎng)方法稱為單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)法。

在單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)方法之中，發(fā)酵液體積保持恒定，生物反應(yīng)器中各組分分布均勻。

單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)是一種最簡單的連續(xù)培養(yǎng)方法。第49頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）細(xì)胞回流式的單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)將單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)流出液中的細(xì)胞加以濃縮，然后再送回到生物反應(yīng)器中，這種方法稱為細(xì)胞回流式的單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞回流式的單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)相當(dāng)于不斷地對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行接種，有利于提高連續(xù)培養(yǎng)的效率。第50頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)將幾個(gè)生物反應(yīng)器串聯(lián)起來，第一個(gè)反應(yīng)器的流出液作為第二個(gè)反應(yīng)器的流入液，第二個(gè)反應(yīng)器的流出液又作為第三個(gè)反應(yīng)器的流入液，這種培養(yǎng)方式就稱為多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)法。第51頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（三）其它培養(yǎng)方法共有5種方法：1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)2、透析培養(yǎng)3、萃取培養(yǎng)4、閃蒸培養(yǎng)5、離子交換培養(yǎng)下面著重介紹1、2二種方法第52頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)法是介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的一種操作方法。是指在進(jìn)行分批培養(yǎng)中間，向生物反應(yīng)器中加入營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)料，但同時(shí)不取出培養(yǎng)液的方法。

（1）方法改良（2）補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)（3）補(bǔ)料分批培養(yǎng)的缺點(diǎn)由于補(bǔ)料，使得培養(yǎng)液的體積逐漸擴(kuò)大，到一定時(shí)間之后，再將培養(yǎng)液從反應(yīng)器中一次性放出第53頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）方法改良連續(xù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)法-------在進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)，如果所取出的培養(yǎng)液數(shù)量少于補(bǔ)進(jìn)的物料數(shù)量，反復(fù)進(jìn)行多次的放料和補(bǔ)料操作，這種方法稱為連續(xù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)。第54頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

（1）通過流加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)罐內(nèi)的細(xì)胞濃度可以達(dá)到非常高的程度這對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)十分有利（3）通過補(bǔ)料，能夠解除某些營養(yǎng)物的低濃度限制效應(yīng)提高產(chǎn)物的合成效率。（2）通過補(bǔ)料和放料的連續(xù)進(jìn)行，能夠解除某些基質(zhì)、產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的抑制作用第55頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）補(bǔ)料分批培養(yǎng)的缺點(diǎn)（1）要考慮到生物反應(yīng)器的供氧能力（2）要考慮培養(yǎng)過程中大量代謝產(chǎn)物積累后的細(xì)胞毒性第56頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、透析培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞的生長，在培養(yǎng)液中會(huì)積累起各種代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)常常會(huì)抑制細(xì)胞的生長。此時(shí)，采用透析膜把一些代謝產(chǎn)物排出反應(yīng)器之外，這種方法稱為------透析培養(yǎng)。（1）方法改良（2）透析培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)第57頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）方法改良如果采用微孔過濾膜把一些代謝產(chǎn)物排出反應(yīng)器之外，這種方法稱為過濾培養(yǎng)。第58頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）透析培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)透析培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)--------對(duì)于消除產(chǎn)物的抑制效應(yīng)十分有效。透析培養(yǎng)的缺點(diǎn)和問題---------經(jīng)常遇到的困難是膜易被堵塞。第59頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五五：工業(yè)微生物菌種的制備和改良1：菌種及其來源2：抗生素菌種的改良技術(shù)

第60頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1：菌種及其來源菌種，是進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵、生產(chǎn)產(chǎn)品的重要條件。優(yōu)良的菌種能夠提高發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量、提高發(fā)酵液的利用效率、縮短生產(chǎn)周期。自然界是生產(chǎn)菌種的主要來源，但是，直接從自然界分離得到的菌種往往不能立即用于生產(chǎn)‘目前，生產(chǎn)上所需要的菌種常常是從保存的菌種中篩選所獲得的。第61頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2：抗生素菌種的改良技術(shù)具體有3種方法--------（1）人工誘變法（2）原生質(zhì)體融合法（3）體外DNA重組法第62頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）人工誘變法抗生素產(chǎn)生菌用紫外線、γ射線、X射線、快中子等物理方法，或者用亞硝酸、秋水仙素、氮芥子氣、硝基胍等化學(xué)誘變劑處理，來提高抗生素的產(chǎn)量。第63頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）原生質(zhì)體融合法Pesti于1979年提出用原生質(zhì)體融合法來提高青霉素的產(chǎn)量。我國四川抗生素研究所于1983年通過原生質(zhì)體融合法生產(chǎn)麥迪霉素，產(chǎn)量提高40%。第64頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）體外DNA重組法采用體外DNA重組技術(shù)來改良抗生素生產(chǎn)菌。英國D.Flopwood首次在鏈霉菌之間進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)移。產(chǎn)生出世界首創(chuàng)的雜合抗生素-------麥迪紫紅素。第65頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五六：發(fā)酵生產(chǎn)過程生產(chǎn)用菌種--------原始材料--------培養(yǎng)基------程序-------生產(chǎn)細(xì)則-------以青霉素為例講解第66頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）青霉素（penicillin）所用菌種---黃青霉菌原始材料---α-氨基已二酸、半胱氨酸、纈氨酸。發(fā)酵方法----加前體物質(zhì)的深層發(fā)酵法。青霉素發(fā)現(xiàn)者弗萊明第67頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五沙土管菌種↓轉(zhuǎn)移到固體瓊脂斜面培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)5-6天，獲得芽孢↓芽孢懸浮于無菌水中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)↓進(jìn)入移種瓶培養(yǎng)↓進(jìn)種子罐，接種量為5%-10%↓進(jìn)繁殖罐，28℃培養(yǎng)48-96小時(shí)↓進(jìn)入發(fā)酵罐，開始生產(chǎn)?！氖竭^濾↓第一次萃取器↓純化柱↓第二次萃取器↓第三次萃取器↓真空結(jié)晶釜↓瓷過濾器↓結(jié)晶洗滌釜↓真空干燥器（結(jié)束）程序第68頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）使用消沫劑，由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的CO2，會(huì)產(chǎn)生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫劑進(jìn)行消沫處理。（2）溫度控制在24-30℃、PH值控制在6.8--7.2。（3）應(yīng)該注意控制殘?zhí)橇?、還原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。（4）發(fā)酵過程中要注意通氣攪拌，所通入的空氣必須是無菌的。（5）發(fā)酵罐必須保持正壓（20-30kPa），以防罐外不潔凈的空氣流入。（6）目前國際上青霉素發(fā)酵的水平已經(jīng)達(dá)到8萬多單位/ml，相當(dāng)于50g/L。生產(chǎn)細(xì)則第69頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五七：滅菌技術(shù)滅菌操作是為了保證雜菌不進(jìn)入工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)。（一）滅菌項(xiàng)目（二）滅菌方法（三）滅菌的矛盾之處（四）具體的滅菌技術(shù)第70頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（一）滅菌項(xiàng)目1、在投入生產(chǎn)之前，必須對(duì)設(shè)備、管道進(jìn)行徹底清洗、和嚴(yán)格滅菌。2、對(duì)通入的培養(yǎng)基、通入的空氣進(jìn)行先行滅菌。

第71頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（二）滅菌方法

2、化學(xué)法1、加熱法3、輻射法4、過濾法第72頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（三）滅菌的矛盾之處對(duì)殺滅細(xì)菌的同時(shí)1、培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也隨之遭到分解和破壞。

2、殺死雜菌的同時(shí)也殺死了工程細(xì)菌。

第73頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（四）具體的滅菌技術(shù)可分為6種技術(shù)：1、間歇滅菌法2、加熱滅菌法3、連續(xù)滅菌法4、空氣加熱滅菌法5、空氣過濾滅菌法6、營養(yǎng)物質(zhì)瞬時(shí)高溫殺菌法第74頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1：間歇滅菌法又稱為分批滅菌，是指將培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐內(nèi)，然后連罐加熱到規(guī)定的滅菌溫度。

（1）滅菌方法（2）注意事項(xiàng)（3）間歇滅菌法的優(yōu)點(diǎn)第75頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）滅菌方法間歇滅菌的操作過程分為3個(gè)過程：加熱----保溫維持----冷卻。這些不同的階段，均能夠起到滅菌的作用。然而，在滅菌過程中，保溫殺菌的作用是主要的，冷卻殺菌的作用最小。第76頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）注意事項(xiàng)應(yīng)當(dāng)避免過長的加熱時(shí)間，否則常常會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)。系統(tǒng)經(jīng)過滅菌操作之后，必須達(dá)到不留1個(gè)雜菌，否則，只要經(jīng)過1晝夜的增殖，1個(gè)雜菌就會(huì)增加到272個(gè)雜菌，最后會(huì)導(dǎo)致整批發(fā)酵液的失敗。

第77頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）間歇滅菌法的優(yōu)點(diǎn)設(shè)備造價(jià)低廉。便于進(jìn)行手動(dòng)操作。

第78頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2：加熱滅菌法隧道滅菌箱設(shè)備第79頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3：連續(xù)滅菌法（1）定義（2）技術(shù)分類（3）連續(xù)滅菌法的優(yōu)點(diǎn)（4）連續(xù)滅菌法的不足第80頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）定義連續(xù)滅菌法是指滅菌的操作的加熱、保溫維持、冷卻這三個(gè)過程，在同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。因此，在連續(xù)滅菌系統(tǒng)中，需要分別設(shè)置加熱設(shè)備、保溫維持設(shè)備、冷卻設(shè)備。第81頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）技術(shù)分類連續(xù)滅菌法可以分為2種：（1）加熱、冷卻緩慢交替進(jìn)行方法。（2）迅速升溫+閃急冷卻方法-----這種方法稱為HTST方法，這對(duì)于保證營養(yǎng)物質(zhì)極為有利。第82頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）連續(xù)滅菌法的優(yōu)點(diǎn)（1）可減少培養(yǎng)劑中營養(yǎng)物質(zhì)的損失、提高產(chǎn)物收率。（2）由于操作條件恒定，可以獲得穩(wěn)定的滅菌質(zhì)量。（3）容易實(shí)現(xiàn)自控操作。（4）能夠避免系統(tǒng)的反復(fù)加熱和冷卻，可提高熱利用率。是目前很多制藥廠經(jīng)常采用的方法。第83頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（4）連續(xù)滅菌法的不足（1）投資較大，

（2）需要同時(shí)設(shè)置加熱、冷卻裝置。

第84頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4：空氣加熱滅菌法利用空氣壓縮時(shí)產(chǎn)生的高溫，使得微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，而達(dá)到殺菌目的，這種方法稱為空氣加熱滅菌法。

不同溫度下的空氣細(xì)菌存活時(shí)間：

200℃/15.1s，250℃/5.1s，

300℃/2.1s，350℃/1.05s。干熱殺菌的流程通常是：先采用廢熱，將空氣預(yù)熱到60-70℃，然后進(jìn)入壓縮機(jī)壓縮，并在200℃以上的溫度維持一段時(shí)間。以便殺死雜菌，然后再進(jìn)入發(fā)酵罐之中。第85頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五5：空氣過濾滅菌法是指讓空氣通過過濾介質(zhì)，以阻截空氣中所含的微生物，取得無菌空氣的目的。

空氣過濾分為2種：（1）絕對(duì)過濾（2）深層過濾陶瓷過濾機(jī)第86頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）絕對(duì)過濾如超濾膜過濾就屬于絕對(duì)過濾是指所用濾膜的孔徑小于空氣中的固體顆粒。從而把顆粒截留。第87頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）深層過濾是憑借濾層內(nèi)的曲折通道，而將顆粒截留的方法。它不要求濾膜的孔徑小于空氣中的固體顆粒。這是目前發(fā)酵工業(yè)常用的過濾除菌方法。深層過濾所用的過濾介質(zhì)-------棉花、活性碳、玻璃纖維、合成纖維、各種有機(jī)或無機(jī)的燒結(jié)材料（燒結(jié)金屬、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)塑料、蒙乃爾合金粉燒結(jié)板）、超細(xì)玻璃纖維、超細(xì)玻璃纖維過濾紙，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA過濾板、PVA燒結(jié)板等已經(jīng)在日本的發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用）。第88頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五6：營養(yǎng)物質(zhì)瞬時(shí)高溫殺菌法一般來說，當(dāng)溫度升高時(shí)，微生物死亡速率的增加>>營養(yǎng)物質(zhì)遭到破壞的速率。因此，對(duì)于瞬時(shí)的高溫，細(xì)菌常常被殺死，而營養(yǎng)物質(zhì)則破壞得不多。根據(jù)這一原理，可以采用營養(yǎng)物質(zhì)瞬時(shí)高溫殺菌法進(jìn)行殺菌操作。第89頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五八：分離純化技術(shù)微生物的發(fā)酵產(chǎn)物是一種混合物，里面除了含有主要產(chǎn)物以外，還含有未能轉(zhuǎn)化的基質(zhì)和底物、殘余的原料、大量的水、微生物細(xì)胞、各種雜質(zhì)。因此，必須對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化。

分離和純化過程被稱作“下游加工過程”，需要經(jīng)過以下這幾個(gè)階段：

（一）固體物質(zhì)的去除，

（二）初步分離，

（三）產(chǎn)品提純，

（四）產(chǎn)品的最終分離。第90頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（一）固體物質(zhì)的去除1、目的2、常用的方法有3、常用的設(shè)備

4、固體物質(zhì)的前期預(yù)處理技術(shù)第91頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、目的（1）分離出完整的細(xì)胞。（2）將細(xì)胞進(jìn)行溶菌處理，提取細(xì)胞內(nèi)的生物產(chǎn)品。（3）除去細(xì)胞有殘留碎片。（4）除去沒有轉(zhuǎn)化的不溶性基質(zhì)。（5）一部分細(xì)胞返回到反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行再循環(huán)操作。第92頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、常用的方法（1）過濾法------分批過濾、連續(xù)真空過濾、錯(cuò)流流動(dòng)過濾。

錯(cuò)流流動(dòng)過濾法------使液體平等于過濾膜的表面進(jìn)行流動(dòng)，這樣能夠不斷地移去在濾膜表面積累的細(xì)胞物質(zhì)，從而獲得近似于恒定的過濾速率。（2）離心分離法------垂直式離心、水平式離心。（3）沉降法------與一般的自由沉降不同，工業(yè)生產(chǎn)過程的沉降都屬于干擾式沉降。第93頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、常用的設(shè)備（1）過濾設(shè)備------板框過濾機(jī)、回轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)（2）離心設(shè)備-------轉(zhuǎn)籃式離心過濾機(jī)（三足式離心過濾機(jī)）、刮刀卸料式離心過濾機(jī)、沉降式離心過濾機(jī)、噴霧離心過濾機(jī)、間斷排料式離心過濾機(jī)、傾析式離心過濾機(jī)。（3）沉降設(shè)備------管式離心沉降機(jī)。第94頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五不銹鋼板框壓濾機(jī)第95頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五澄清型管式分離機(jī)SSC600-NG三足式沉降離心機(jī)第96頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五19XKZ全自動(dòng)壓濾機(jī)第97頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4、固體物質(zhì)的前期預(yù)處理技術(shù)由于生物反應(yīng)液的粘度很大，直接分離往往比較困難，因此，常常對(duì)其進(jìn)行預(yù)先的前期處理，來提高分離效果。常見的預(yù)處理技術(shù)有：

（1）使細(xì)胞老化凝聚成團(tuán)，

（2）加熱，

（3）改變PH值，

（4）添加化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)凝聚，如加入高分子電解質(zhì)、氯化鈣、膠態(tài)粘士。第98頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（二）初步分離進(jìn)一步把已經(jīng)分離的溶液濃縮，提高目的產(chǎn)物濃度的方法，稱為初步分離。初步分離的具體方法可以分為：1、蒸發(fā)2、萃取3、沉淀4、膜分離第99頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、蒸發(fā)蒸發(fā)是通過加熱，使溶液中的水經(jīng)過汽化除去要提高溶質(zhì)濃度、為溶質(zhì)的析出創(chuàng)造條件的一種操作方法。各種代謝物，如氨基酸、抗生素、酶都可以進(jìn)行蒸發(fā)操作。由于生物產(chǎn)品大多數(shù)是熱敏性物質(zhì)，所以物料在蒸發(fā)器內(nèi)的停留時(shí)間必須盡可能短，同時(shí)，還應(yīng)該晝避免局部液體過熱。第100頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五LG系列離心式刮板薄膜蒸發(fā)器示意圖蒸發(fā)設(shè)備

（1）連續(xù)流動(dòng)膜式蒸發(fā)器，

（2）長管膜式蒸發(fā)器，

（3）強(qiáng)制膜式蒸發(fā)器，

（4）離心膜蒸發(fā)器。第101頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、萃取萃取是通過物質(zhì)在2種溶液之間不同的溶解度，來實(shí)現(xiàn)分離的操作方法。萃取的分類（1）有機(jī)溶劑萃?。?）雙水相萃取第102頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）有機(jī)溶劑萃取許多抗生素都能夠溶解在有機(jī)溶劑之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通過萃取，可使得抗生素從水相進(jìn)入有機(jī)相之中，從而實(shí)現(xiàn)分離。由于抗生素在有機(jī)溶劑之中極不穩(wěn)定，因此，在保證萃取效率的前提條件下，必須盡量縮短操作時(shí)間。有機(jī)溶劑萃取設(shè)備可使用Podbielniak離心萃取機(jī)。第103頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五SFT-150超臨界萃取反應(yīng)儀利用萃取法來提取抗生素，具有質(zhì)量好、收率高、速度快的優(yōu)點(diǎn)。雙水相萃取法，目前用于進(jìn)行酶、和蛋白質(zhì)的提取工藝。第104頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）雙水相萃取使用2種互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分別將它們?nèi)苡谒行纬呻p水相，利用目的產(chǎn)物在雙水相中不同的分配系數(shù)而實(shí)現(xiàn)分離的方法，稱為雙水相萃取。萃取之后的目的產(chǎn)物可以通過超濾法進(jìn)行提純。雙水相萃取材料--------（1）PEG--葡聚糖萃取系統(tǒng)，（2）PEG—磷酸鉀萃取系統(tǒng)。第105頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、沉淀蛋白質(zhì)在溶液中具有“等電點(diǎn)”的特性，而且其等電點(diǎn)與溶液PH值有關(guān)，PH值大，蛋白質(zhì)呈負(fù)電，PH值小，蛋白質(zhì)呈正電，當(dāng)PH=pI（等電點(diǎn)）時(shí)，蛋白質(zhì)不帶電荷。蛋白質(zhì)在PI時(shí)的溶解度最小。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在水中有均勻分布是由于同性電荷相斥的緣故，當(dāng)PH=pI時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子不帶電荷，于是開始相互凝聚、產(chǎn)生沉淀。第106頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五NSG-630濃縮分離機(jī)ZHN系列真空濃縮罐第107頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五沉淀和鹽折的結(jié)合由于沉淀常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性而失效。而利用鹽溶液就能避免蛋白質(zhì)的變性，這種方法就稱為------鹽析法。在不同的鹽溶液之中，蛋白質(zhì)有鹽析效應(yīng)有所不同。按下列順序遞減：

（1）陰離子------檸檬酸鹽-3、酒石酸鹽-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸鹽-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。

（2）陽離子-------Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。從離子物性來看，硫酸銨并不是鹽析效應(yīng)最強(qiáng)的鹽類，但是由于它在水中的溶解度極大，對(duì)鹽析十分有利，因此硫酸銨是目前最常用的鹽析劑。第108頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4、膜分離膜分離技術(shù)是基于一種半透性薄膜，它能夠使得溶液中的某些組分通過，而阻止和截留其它組分的分離方法。膜分離的優(yōu)點(diǎn)

（1）由于膜分離是純粹物質(zhì)粒度大小這一幾何特性來進(jìn)行分離，它不必象萃取、沉淀法那樣需加入其它化學(xué)物質(zhì)、也不必象蒸發(fā)那樣進(jìn)行加熱。因此，產(chǎn)物的生物學(xué)特性能夠得到完好的保存，

（2）產(chǎn)物的損失量很少，有利于提高得率。膜分離的分類（1）反滲透法（2）超濾法第109頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）反滲透法根據(jù)物理化學(xué)的原理，當(dāng)含有溶質(zhì)A的溶液B與另一滲透液C之間被半透膜隔開的時(shí)候，由于系統(tǒng)滲透壓的作用，滲透液C便會(huì)進(jìn)入到溶液B之中，這種現(xiàn)象稱為滲透現(xiàn)象。形成這種滲透的壓力就自然稱為滲透壓（π）如果在溶液B一方施加壓力（⊿P），發(fā)現(xiàn)滲透液C進(jìn)入溶液B的速率就會(huì)減小。

當(dāng)壓力（⊿P）=滲透壓（π）時(shí)，滲透現(xiàn)象就會(huì)停止。當(dāng)壓力（⊿P）>滲透壓（π）時(shí)，就會(huì)看到溶液B開始反向進(jìn)入滲透液C之中，這種現(xiàn)象就稱為反滲透現(xiàn)象。根據(jù)溶液所具有的反滲透特性，可以實(shí)現(xiàn)溶液的濃縮。第110頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）超濾法是指在反滲透的基礎(chǔ)之上，將隔離膜由原來的半透膜，改成帶有較大孔徑的薄膜。這樣一來，在反滲透操作過程中，不但是溶劑進(jìn)入到滲透液之中，就連那些許多小分子的雜質(zhì)也連帶一起進(jìn)入到滲透液之中。

與反滲透法相比，超濾法明顯具有其優(yōu)點(diǎn)-------反滲透法只能起到濃縮作用，而超濾法在濃縮的同時(shí)，還具有純化作用。第111頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五反滲透法+超濾法的實(shí)際應(yīng)用（1）主要用于蛋白質(zhì)溶液的濃縮、脫鹽等步驟，

（2）在疫苗、血漿等生產(chǎn)中也常被使用。

膜分離裝置的分類

（1）中空纖維束，

（2）板-框膜分離裝置，

（3）螺旋狀膜分離裝置反滲透裝置第112頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（三）產(chǎn)品提純層析法，是指在一根層析柱內(nèi)，填充某種特殊的載體物質(zhì)，稱為固定相。含有待分離產(chǎn)物的溶液則稱為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流過固定相的時(shí)候，由于流動(dòng)相中不同的物質(zhì)與固定相之間產(chǎn)生了不同強(qiáng)度的結(jié)合力，因此各種物質(zhì)在層析柱內(nèi)停留的時(shí)間也各不相同，結(jié)果，它們將依次序的先后流出層析柱。層析法的分類

1、吸附層析法

2、離子交換層析法

3、凝膠層析法（分子篩）

4、親的層析法第113頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、吸附層析法吸附層析法是利用各種物質(zhì)與固定相之間由于吸附力的差異、而產(chǎn)生不同的結(jié)合力的原理，所進(jìn)行的層析操作。固定相對(duì)溶質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合力，這種結(jié)合力是以離子鍵、氫鍵、范德華力所產(chǎn)生的。而流動(dòng)相的洗脫作用又對(duì)溶質(zhì)和固定相之間產(chǎn)生脫離作用。這樣，吸附—脫離—再吸附—再脫離，導(dǎo)致溶質(zhì)沿著洗脫液的方向移動(dòng)。其移動(dòng)速率取決于固定相對(duì)溶質(zhì)的吸附能力，吸附力弱，移動(dòng)就快，吸附力強(qiáng)，移動(dòng)就慢。第114頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、離子交換層析法（1）基本原理（2）離子交換過程（3）常用的離子交換樹脂（4）離子交換層析法的應(yīng)用第115頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）基本原理采用離子交換樹脂作為固定相，離子交換樹脂本身具有正離子基團(tuán)和負(fù)離子基團(tuán)，

酸性電離基團(tuán)可以交換陽離子，稱為陽離子交換樹脂。

堿性電離基團(tuán)可以交換陰離子，稱為陰離子交換樹脂。

離子交換樹脂同時(shí)具備極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)。極性基團(tuán)不斷地與溶液中的離子進(jìn)行交換，而非極性基團(tuán)則構(gòu)成樹脂分子的骨架，起支撐作用。第116頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）離子交換過程是一個(gè)同時(shí)包含吸附+吸收+穿透+擴(kuò)散+離子交換+離子親和，等等物理化學(xué)過程的綜合作用的結(jié)果。溶液中的溶質(zhì)離子擴(kuò)散到樹脂的表面溶質(zhì)離子穿透樹脂的表面擴(kuò)散到樹脂顆粒的內(nèi)部溶質(zhì)離子與樹脂離子發(fā)生交換樹脂離子穿透樹脂的表面樹脂離子擴(kuò)散到溶液之中第117頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）常用的離子交換樹脂（1）羧甲基纖維素陽離子交換樹脂（CM-纖維素）------當(dāng)陽離子蛋白質(zhì)流經(jīng)交換樹脂時(shí)，由于靜電吸引的作用，蛋白質(zhì)將與樹脂結(jié)合，然后用緩沖液進(jìn)行沖洗交換柱，結(jié)合力最弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。不同的緩沖液將各處洗脫“撿到”其中的某一蛋白質(zhì)組分。（2）二乙氨乙基纖維素陰離子交換樹脂（DEAE-纖維素）--------原理與CM-纖維素交換原理相同。第118頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（4）離子交換層析法的應(yīng)用離子交換層析法具有收率高、質(zhì)量好、周期短、成本低、設(shè)備簡單、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)普遍應(yīng)用于生物化學(xué)制藥行業(yè)。離子交換柱第119頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五3、凝膠層析法（1）基本原理（2）常用的凝膠層析材料（3）凝膠層析的應(yīng)用價(jià)值第120頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）基本原理凝膠層析也稱為凝膠過濾、分子篩層析、排陰層析、凝膠滲透層析等等。凝膠是一種具有多孔的、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。每一個(gè)顆粒就相當(dāng)于一個(gè)篩子。當(dāng)樣品通過凝膠層析柱時(shí)，分子量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔，它們沿著凝膠顆料的間隙流動(dòng)，因此速度較快而首先流出層析柱。相反，分子量較小的物質(zhì)可以自由地進(jìn)出凝膠網(wǎng)孔，它們不斷地在凝膠顆粒之中來回流動(dòng)，從而導(dǎo)致進(jìn)出速度下降。第121頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）常用的凝膠層析材料（1）葡聚糖凝膠，

（2）聚丙烯酰胺凝膠。AM90-1型凝膠層析儀第122頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（3）凝膠層析的應(yīng)用價(jià)值（1）可用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物質(zhì)。能徹底分離分子量相差只有25%的二種蛋白質(zhì)。

（2）凝膠層析具有設(shè)備簡單、分離迅速、不影響產(chǎn)物的分子生物學(xué)特性等優(yōu)點(diǎn)。第123頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五4、親和層析法是利用生物分子之間所具有的專一親和力而設(shè)計(jì)出的一種層析方法。（1）親和層析的原理（2）親和層析的例子

第124頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（1）親和層析的原理（1）載體活化------將載體在堿性條件下用溴化氫（CNBr）進(jìn)行活化。

（2）通過偶聯(lián)反應(yīng)制成親的吸附劑-------將某一種能夠與生物分子進(jìn)行可逆性結(jié)合的物質(zhì)（稱作配基）通過偶聯(lián)反應(yīng)聯(lián)結(jié)到載體上，

（3）含有生物分子的樣品通過層析柱。

（4）生物分子與配基結(jié)合而被吸附，

（5）未能進(jìn)行特異性結(jié)合的其它雜蛋白，通過洗滌而流出層析柱。第125頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（2）親和層析的例子層析目的----分離DNA解聚酶層析方法----以珠狀的瓊脂糖、或者聚丙烯酰胺作為載體，以DNA解聚酶的抑制物作為配基層析結(jié)果----

（1）DNA解聚酶被特異性地結(jié)合在層析柱上，

（2）其它物質(zhì)全部流出

（3）最后用適當(dāng)?shù)南疵撘和ㄟ^層析柱，可獲得純度極高的DNA解聚酶第126頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五九：干燥技術(shù)干燥操作往往是生物產(chǎn)品生產(chǎn)的最后一步，干燥的目的就在于除去物料中的水分，便于保藏和運(yùn)輸。干燥注意事項(xiàng)--------由于生物產(chǎn)品多數(shù)為熱敏性物質(zhì)，所以干燥過程必須注意使用那些干燥時(shí)間不太長、干燥溫度不過高的設(shè)備。干燥技術(shù)和設(shè)備---------（一）噴霧干燥（二）氣流干燥（三）沸騰干燥（四）鼓式干燥（五）冷凍干燥第127頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（一）噴霧干燥噴霧干燥是利用不同的噴霧裝置，如噴嘴、或者轉(zhuǎn)盤，將濃縮液或者懸浮液噴成霧狀，使它們形成具有極大表面積的分散液滴，在干燥室內(nèi)緩緩沉降，并與熱空氣流發(fā)生強(qiáng)烈的熱交換，在幾秒到幾十秒之內(nèi)得到迅速干燥的方法。噴霧干燥由于干燥時(shí)間極短、避免了生物產(chǎn)品活性的破壞，適用于抗生素、酶制劑、熱不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的干燥。高速離心噴霧干燥機(jī)第128頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（二）氣流干燥是利用顆粒在氣流中能夠自由流動(dòng)的特性，使物料與氣流一起流經(jīng)一段長的管道，顆粒物料在與氣流一起流動(dòng)的過程中，水分得到迅速汽化，因此，等到到達(dá)干燥管道出口處時(shí)，顆粒物料已經(jīng)被干燥。

PG系列氣流干燥機(jī)第129頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（三）沸騰干燥是利用流態(tài)化技術(shù)，被干燥物料由最上層逐層往下移動(dòng)，而熱空氣則自下而上，與物料呈現(xiàn)逆向流動(dòng)，在每層面上，使物料呈現(xiàn)出“沸騰狀態(tài)。”稱為沸騰干燥法。沸騰干燥的缺點(diǎn)-----

（1）干燥時(shí)間過短，則干燥不透。

（2）干燥時(shí)間過長，則生物產(chǎn)品的活性遭到破壞。GFG型高效沸騰干燥機(jī)第130頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（四）鼓式干燥這種干燥器有二個(gè)相向轉(zhuǎn)動(dòng)的鼓，鼓內(nèi)通入熱空氣，當(dāng)溶液被加入到鼓面上流動(dòng)時(shí)，就得到了汽化。最后，干燥的物料由刮刀刮下。鼓式干燥的應(yīng)用范圍-------只能對(duì)那些熱穩(wěn)定性良好的藥物進(jìn)行干燥。HZG型直接加熱式回轉(zhuǎn)滾筒干燥機(jī)第131頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五（五）冷凍干燥1、基本原理2、冷凍干燥的程序3、冷凍干燥的應(yīng)用4、冷凍干燥的設(shè)備第132頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五1、基本原理又稱升華干燥。將濕的物料在-50℃到-10℃之間凍結(jié)成固態(tài)，然后在高真空（1--0.001mmHg、1mmHg=133.332Pa）條件下，將其中的水分直接升華成氣態(tài)，從而達(dá)到脫水、干燥的目的。第133頁，共149頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期五2、冷凍干燥的程序（1）凍結(jié)-----一般生物制品的共晶點(diǎn)在-20℃，因此，通常將制品凍結(jié)在-35℃到40℃之間。再維持1—2小時(shí)，以保證凍結(jié)完全徹底。（2）升華-----在低溫-30℃到-10℃之間，利用高真空度（13.3—30Pa）時(shí)，將溶劑變成氣體直接用真空泵抽走。通過升華過