電泳和色譜分離技術(shù)(應(yīng)用)

關(guān)于電泳和色譜分離技術(shù)(應(yīng)用)第1頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)第一節(jié)．電泳基本概念

1、電泳是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核甘酸等)在惰性支持介質(zhì)中(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)在電場(chǎng)作用下向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。電泳技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室中分析、鑒定和分離技術(shù)之一。第2頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)第一節(jié)．電泳基本概念2、電泳分類(lèi)：第3頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)第二節(jié)電泳分離基本原理

帶電粒子在電場(chǎng)中產(chǎn)生定向遷移，引起其遷移所受力（F)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶凈電荷（Z)成正比:粒子在電場(chǎng)中所受力與溶液黏度、分子半徑、及穩(wěn)態(tài)下移動(dòng)速度有關(guān)第4頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五各種不同分子量的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)內(nèi)遷移速率與它的凈電荷數(shù)成正比，而與其分子半徑及溶液黏度成反比。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)的電泳遷移速率與蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系第5頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五根據(jù)此性質(zhì)，可對(duì)具有相同電荷，不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第6頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五電泳技術(shù)分類(lèi)影響電泳遷移率的因素

①電場(chǎng)強(qiáng)度。電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位長(zhǎng)度(cm)的電位降．也稱電勢(shì)梯度。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度不同，將電泳分為常壓電泳(2-10V/cm)和高壓電泳(20-200V/cm)。電場(chǎng)強(qiáng)度高，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速，因此省時(shí)，但會(huì)產(chǎn)生大量熱量。

第7頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五②溶液的pH值。溶液的pH值決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。對(duì)于帶有兩性基團(tuán)的電解質(zhì)，溶液存在一pH值，此時(shí)，溶液所帶正負(fù)電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此時(shí)，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，這一pH值稱為電解質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelectricpoint,PI)。若溶液pH值處于等電點(diǎn)酸側(cè)，即pH＜pI，則蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)；若溶液pH值處于等電點(diǎn)堿側(cè)，即pH＞pI，則蛋內(nèi)質(zhì)帶負(fù)電荷,向正極移動(dòng)。溶液的pH值離pI越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。第8頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五③溶液的離子強(qiáng)度一方面，電泳液中的離子濃度增加時(shí)會(huì)引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低。帶電質(zhì)點(diǎn)吸引相反電荷的離子聚集其周?chē)?，形成一個(gè)與運(yùn)動(dòng)質(zhì)點(diǎn)電荷相反的離子氛(ionicatmosphere),離子氛不僅降低質(zhì)點(diǎn)的帶電量，同時(shí)增加質(zhì)點(diǎn)前移的阻力，甚至使其不能泳動(dòng)。另一方面，離子濃度過(guò)低，會(huì)降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的pH值，影響質(zhì)點(diǎn)的帶電量，改變泳動(dòng)速度。第9頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五④電滲。在電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲(electro—osmosis)。由于電滲的影響，質(zhì)點(diǎn)遷移的表觀速度不同于其固有速度。因固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時(shí)，紙上纖維素吸附OH-帶負(fù)電荷，而與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+，帶正電荷移向負(fù)極，若質(zhì)點(diǎn)原來(lái)在電場(chǎng)中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表觀速度比其固有速度要快；若質(zhì)點(diǎn)原來(lái)移向正極，表觀速度比其固有速度要慢。因此．應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。第10頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五電泳的技術(shù)問(wèn)題和對(duì)策：影響遷移速率的主要因素（1）各組分的分子凈電荷數(shù);(2)分子量;(3)電泳系統(tǒng)介質(zhì)的有效黏滯度。（1）一般控制溶液pH4.5-9.5范圍內(nèi)。（2）選擇適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)。（3）表面活性劑（4）控制電泳系統(tǒng)介質(zhì)的有效黏滯度第11頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五（5）電泳過(guò)程的產(chǎn)熱問(wèn)題A、蛋白質(zhì)變性;B、引起區(qū)帶擴(kuò)散，降低分辨率。最常采用的辦法是將電泳產(chǎn)生的熱量從電泳系統(tǒng)中移出，保持電泳溫度恒定。第12頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)第11章色譜分離過(guò)程色譜法指多種成分的混合物，由于在流動(dòng)相和固定相中有不同的分配，在流動(dòng)過(guò)程中，經(jīng)多次分配后而獲得分離。同其他傳統(tǒng)分離純化方法相比，色譜分離過(guò)程具有如下特點(diǎn)。1、應(yīng)用范圍廣2、分離效率高3、操作模式多樣4、高靈敏度在線檢測(cè)第13頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程的基本原理

色譜分離過(guò)程的實(shí)質(zhì)是溶質(zhì)在不互溶的固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次的交換過(guò)程，它借各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等差異而使不同的溶質(zhì)分離。即混合物中各個(gè)組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱而得到分離。第14頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五第15頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)固定相

色譜柱填料分為球形顆粒填料和不規(guī)則形狀顆粒填料。具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，不易破碎，柱的填裝重視性好，并可增加樣品在柱中的滲透性。色譜分離過(guò)程常用柱填料有以下幾種。（1）硅膠衍生的固定相;（2）活性炭;（3）離子交換樹(shù)脂;（4）大孔吸附樹(shù)脂;（5）凝膠;（6）手性固定相.第16頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜柱及柱技術(shù)

色譜柱是色譜技術(shù)的核心，色譜柱的性能依賴于三個(gè)因素：色譜柱填充技術(shù)、柱設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。（1）色譜柱填裝方法第17頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)（2）色譜柱設(shè)計(jì)以使被分離物質(zhì)以“面進(jìn)樣”而不是“點(diǎn)進(jìn)樣”的方式分布在柱頭截面上，形成平整的活塞流，減少譜帶擴(kuò)張。

第18頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜的分類(lèi)

1、按兩相狀態(tài)分類(lèi)按流動(dòng)相狀態(tài)分類(lèi)氣相色譜（GC);液相色譜（LC);超臨界流體色譜（SFC)。按固定相狀態(tài)分類(lèi)氣-固色譜（GSC);氣-液色譜（GLC)液-固色譜（LSC);液-液色譜（LLC）第19頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜的分類(lèi)

2、按處理量分類(lèi)根據(jù)分離樣品量的不同，以分離純化為目的的色譜可分為：半制備（semi-preparative，微克級(jí)至克級(jí)）、大規(guī)模（Largescale，克級(jí)至千克級(jí)）、生產(chǎn)型（industrialscaleorprocess，克級(jí)至千克級(jí)）幾種類(lèi)型色譜。第20頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜的分類(lèi)3、按分離機(jī)制分類(lèi)①分子排阻色譜或凝膠過(guò)濾色譜（sizeexclusionchromatography，SEC或gelfiltrationchromatography，GC）。②離子交換色譜（ionexchangechromatography，IEC）。第21頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜的分類(lèi)3、按分離機(jī)制分類(lèi)③疏水作用色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）。④親和色譜（affinitychromatography，AC）。⑤正相/反相色譜（normal/reversedphasechromatography，N/RPC第22頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜的分類(lèi)3、按使用目的分類(lèi)①分析用色譜②制備用色譜③流程用色譜第23頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論

保留值、分離度和柱效應(yīng)（1）保留值保留值通常以保留時(shí)間及容量因子來(lái)表示。保留值是色譜過(guò)程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。它也是色譜定性的基本依據(jù)。從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時(shí)間為保留時(shí)間，與固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)、柱溫、流速、柱體積等因素有關(guān)。

第24頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論容量因子指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量之比。它與柱尺寸及流速無(wú)關(guān)，而與溶質(zhì)在兩相間的分配性質(zhì)、柱溫及固定相和流動(dòng)相之體積比有關(guān)。第25頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論

保留值、分離度和柱效應(yīng)（1）分離度相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以兩色譜峰的平均寬度。

當(dāng)R=1時(shí)，兩色譜峰的分離程度可達(dá)94%；當(dāng)R=1.5時(shí)，兩個(gè)色譜峰已完全分離。第26頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論

保留值、分離度和柱效應(yīng)（1）柱效應(yīng)：用塔板高度和塔板數(shù)衡量色譜柱效應(yīng)。

有效塔板數(shù)和有效塔板高度

第27頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論

色譜理論模型（1）速度方程理論

A、B、C分別代表渦流擴(kuò)散系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)系（2）平衡色譜理論假定在整個(gè)過(guò)程中，色譜柱中不存在傳質(zhì)阻力，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配平衡能瞬間完成。第28頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論

即在色譜柱內(nèi)任何時(shí)刻和位置，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度均符合等溫方程由于忽略了非理想流動(dòng)及各種傳質(zhì)阻力的存在，這個(gè)模型是比較粗略的。

第29頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論（3）塔板理論塔板理論將色譜過(guò)程比擬為蒸餾過(guò)程，不同色譜柱看成是由一系列理論塔板所組成。在一個(gè)理論板當(dāng)量高度HETP的柱高內(nèi)，溶質(zhì)在兩相間達(dá)到一次平衡。由塔板理論可計(jì)算理論塔板數(shù)及塔板高度.但它是半經(jīng)驗(yàn)式理論，不能揭示色譜過(guò)程本質(zhì)。第30頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)色譜分離過(guò)程基礎(chǔ)理論（4）軸向擴(kuò)散理論在色譜過(guò)程中，組分在流動(dòng)相中的軸向擴(kuò)散是影響色譜區(qū)域譜帶擴(kuò)張的主要因素，而有限的傳質(zhì)速率對(duì)區(qū)域譜帶擴(kuò)張沒(méi)有影響。軸向擴(kuò)散理論的基本方程為

軸向擴(kuò)散理論考慮了溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相間的傳質(zhì)速率及流動(dòng)相的流動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)傳質(zhì)速率較快而軸向擴(kuò)散為區(qū)域擴(kuò)張的主要因素時(shí)，該理論具有較好的指導(dǎo)意義。第31頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)氣相色譜及其應(yīng)用氣相色譜儀以惰性氣體（載氣）作為流動(dòng)相，以固定液或固體填充劑作為固定相的色譜設(shè)備。處理的對(duì)象是低分子量或易揮發(fā)化合物。不適宜高分子化合物及熱敏性化合物的分離和分析。第32頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)氣相色譜及其應(yīng)用氣相色譜儀氣路系統(tǒng)(氣源、凈化器、氣流控制裝置）;進(jìn)樣系統(tǒng)(注射器、六通閥、自動(dòng)進(jìn)樣器）;分離系統(tǒng)(色譜柱、柱箱）;檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。第33頁(yè)，共37頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)49分，星期五概述——過(guò)程特點(diǎn)高效液相色譜及其應(yīng)用高效液相色譜儀以液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)，具有以下特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度且分析使用樣品量小。組成：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱分離系統(tǒng)、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)