084NatCommun前沿高通量超快速磷酸化分析新方向

NatCommun前沿：高通量超快速磷酸化分析新方向蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的翻譯后修飾（PTM）之一，廣泛參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育等幾乎所有生理過(guò)程中；此外大量研究證實(shí)，異常磷酸化修飾是引發(fā)動(dòng)植物病變的重要原因，深入探究磷酸化變化對(duì)揭示生命活動(dòng)、疾病發(fā)病機(jī)制等非常重要。2019、2020年連續(xù)多篇蛋白基因組熱點(diǎn)研究的研究報(bào)道中，利用高通量蛋白組、磷酸化組技術(shù)，描繪大隊(duì)列組織樣本的蛋白質(zhì)組表達(dá)和磷酸化蛋白質(zhì)組表達(dá)變化，實(shí)現(xiàn)了疾病分型，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了精準(zhǔn)治療新靶點(diǎn)。因此，大規(guī)模、大樣本的磷酸化修飾組學(xué)解決方案必將成為未來(lái)磷酸化研究的主要方向之一。今天給大家?guī)?lái)的研究成果是自中國(guó)臺(tái)灣中央研究院的陳玉如教授課題組優(yōu)化的一種磷酸化高深度研究的新策略——基于DIA-MS構(gòu)建的全局磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（GlobalPhosphoproteomicsSystem，GPS）。采用此方法，人細(xì)胞樣本單次2h上機(jī)可檢測(cè)到36350個(gè)磷酸化位點(diǎn)，與傳統(tǒng)的耗時(shí)40天，采集270個(gè)數(shù)據(jù)，獲得38229個(gè)磷酸化位點(diǎn)的方法比，效率顯著提升。主要結(jié)果Proteomics1.

基于DIA-MS構(gòu)建全局磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)流程以非小細(xì)胞肺癌為例，作者使用多個(gè)NSCLC細(xì)胞系和癌組織，結(jié)合DDA和DIA兩方面的數(shù)據(jù)，構(gòu)建全局性的混合磷酸化蛋白譜圖庫(kù)。該庫(kù)共包含了88107個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)比單一樣本僅采用DDA方法建立的庫(kù)，數(shù)據(jù)量提升超過(guò)50%?；诖藥?kù)，采用DIA采集模式，單個(gè)人細(xì)胞樣本可檢測(cè)到36350個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)超高深度的檢測(cè)。圖1.混合譜圖庫(kù)的構(gòu)建及磷酸化定量實(shí)驗(yàn)流程2.

基于GPS譜圖庫(kù)的DIA磷酸化定量準(zhǔn)確性測(cè)試為了評(píng)價(jià)新策略鑒定磷酸化位點(diǎn)定位和定量的準(zhǔn)確性，作者合成了166條與肺癌信號(hào)通路相關(guān)的磷酸化肽段進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)表明，DIA策略構(gòu)建的譜圖庫(kù)具有很高的質(zhì)量，可實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)的精確定位和準(zhǔn)確定量。圖2.DIA策略的定性及定量準(zhǔn)確性測(cè)試3.

基于GPS譜圖庫(kù)的DIA磷酸化定量的重現(xiàn)性測(cè)試接著，作者比較了常規(guī)DDA、分級(jí)的DDA、無(wú)需建庫(kù)的dirDIA和GPS-libDIA四種方法在磷酸化蛋白質(zhì)組覆蓋率、CV%和單針三重復(fù)DIA數(shù)據(jù)完整性三方面的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）libDIA鑒定到的磷酸化位點(diǎn)數(shù)量接近DDA（RP），明顯優(yōu)于DDA和dirDIA；（2）libDIA和dirDIA結(jié)果的定量CV值均小于DDA；（3）libDIA和dirDIA的缺失值顯著少于DDA。這些結(jié)果表明DIA的數(shù)據(jù)質(zhì)量更佳，重現(xiàn)性更好，更適合大樣本量的蛋白組學(xué)分析。圖3.DIA和DDA的比較4.應(yīng)用1：用于肺癌細(xì)胞耐藥機(jī)制研究應(yīng)用全新的DIA定量策略比較TKI敏感的PC9細(xì)胞和耐TKI的CL68細(xì)胞在磷酸化水平上的差異，共6例樣本鑒定到30138個(gè)磷酸化位點(diǎn)。對(duì)其中16199個(gè)I類磷酸化位點(diǎn)，4122個(gè)磷酸化蛋白進(jìn)行差異分析、皮爾遜相關(guān)性系數(shù)分析、KEGG分析、激酶分析、motif分析等，揭示了NSCLC的耐藥機(jī)制。圖4.肺癌細(xì)胞耐藥機(jī)制分析5.應(yīng)用2：用于肺癌組織中深度磷酸化蛋白質(zhì)組分析應(yīng)用全新的DIA定量策略比較癌和癌旁組織在磷酸化水平上的差異，共10例樣本鑒定到32,407個(gè)磷酸化位點(diǎn)。高深度的鑒定、全方位的分析，為潛在的藥物靶點(diǎn)提供了新的方向。圖5.肺癌磷酸化蛋白質(zhì)組分析結(jié)論P(yáng)roteomics本文給大家介紹了磷酸化研究的新方法，該方法在檢測(cè)深度和檢測(cè)效率之間找到了