DB37-T 4363-2021 偽狂犬病毒與水貂腸炎病毒雙重?zé)晒釶CR檢測方法

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4363—2021檢測方法Duplexreal-timePCRdetectionmethodforpseudorabiesvirusandminkDuplexreal-timePCRdetectionmethodforpseudorabiesvirusandminkenteritisvirus2021031120210411山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。偽狂犬病毒與水貂腸炎病毒雙重?zé)晒釶CR檢測方法范圍（）PCR（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。PCRDNAPBS5試劑或材料GB/T6682A.52～8KA.6RNAA.75.675A.8，-20氯仿，44TEA.9gBVP2PCR（）13000r/min6.3冰箱，2～8205μL、10μL、100μL1000μL。1.5mL樣品121℃，15min——棉拭子；——剪刀、鑷子；1.5mL——研缽或組織研磨儀。有咽喉拭子樣品和肛門拭子樣品：3～51.0mLPBS1.5mL肛門拭子采樣，采樣時(shí)將拭子深入肛門轉(zhuǎn)一圈并沾取少量糞便；然后將拭子插入裝有1.0PBS1.5mLh302.010mLPBS000r/min離心15min1.5mL或者用專用儀器設(shè)備處理待檢組織樣品。2～82470（凍融不超過三次）。熒光PCR檢測方法的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范應(yīng)符合GB19489和GB/T27401要求。樣品病毒核酸DNA1.5mL2001.0mLDNAμLK210μLRNA1h200μL10min413000r/min15min（10min413000r/min15min1.0mL7548000r/min、10min5min50μLTEDNA，-20DNADNAPCRPCR+1+2μL熒光PCR反應(yīng)液。按B.2配制反應(yīng)液，為避免移液器取樣損失，建議按n+1個(gè)反應(yīng)配PCR20μL，加樣PCR8.2.7DNA5500r/min離心PCRPCRPCRPCR94/3℃/15℃/60sec共40402min60PCRFAMCy5CtCt28。注：Ct陰性雙檢測通道均無Ct值，且無特征性擴(kuò)增曲線，表明樣品中無偽狂犬、水貂細(xì)小病毒核酸。陽性CtCy5Ct30.0FAMCt9.3.3可疑Cy5Ct30.0FAMCt9.3.3可疑Ct30.0～38.0 附錄A（0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)稱取6.055gTris置于100mL80mLHCl調(diào)節(jié)pH8.0，定容至100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液稱取18.61gNa2EDTA·2H2O置于100mL80mL10NaOHpH8.0，100mL10%SDS稱取10gSDS80mL100mL5mol/LNaCl稱取29.25gNaCl80mL100mL定容至100mL。20mg/mLK0.210mL，20RNA將1定容至100mL。20mg/mLK0.210mL，20RNA將1RNA酶溶于6mL1001510-2075量取75mL25mLTE將0.5mL10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0pH8.0，加ddH2O50mL，4附錄B（資料性）引物探針序列及熒光PCR反應(yīng)液配方引物和探針序列表見表B.1。表B.1引物和探針序列表病毒名稱序列名稱序列偽狂犬病毒上游引物GCCAACCCGCTCGTGCTC下游引物CACGAACACGCAGTCGCAGTA探針FAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC-BHQ1水貂腸炎病毒上游引物CGTCTACACAAGGGCCATTTA下游引物CCATGTTGTCTACCAAATGCAT探針Cy5-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQ3PCR表B.2表B.2PCR注：Taq酶，TaqDNA聚合酶。組分1個(gè)檢測體系的加入量5×PCR緩沖液5.0μLTaq酶(5U/μL)0.5μLdNTPs(10mmol/L)1.0μLMgCl2(25mmol/L)3.0μL偽狂犬病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL偽狂犬病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL偽狂犬病毒探針(10μmol/L)0.5μL水貂腸炎病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL水貂腸炎病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL水貂腸炎病毒探針(10μmol/L)0.5μLdd