傳染病-實習(xí)報告

傳染病-實習(xí)報告實習(xí)報告院:動物醫(yī)學(xué)院院:程:獸醫(yī)傳染病學(xué)實習(xí)程:獸醫(yī)傳染病學(xué)實習(xí)級:號：級:號：動醫(yī)10*班171102**名：**指導(dǎo)教師:王先煒職稱：副教授實習(xí)時間2013年5月26日至2013年5月31日實習(xí)地點逸夫樓40172013年6月南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處制實習(xí)報告、實習(xí)目的以副豬嗜血桿菌病和藍(lán)耳病為模型，學(xué)習(xí)傳染病的臨床診斷技術(shù)；liiJ通過對感染豬體內(nèi)病毒和細(xì)菌的分離鑒定，學(xué)習(xí)掌握細(xì)菌性豬病、病毒性豬病的實驗室診斷方法。liiJ掌握畜禽傳染病的臨床診斷技術(shù)。掌握畜禽傳染病實驗室診斷方案的設(shè)計、診斷試劑的準(zhǔn)備和檢測結(jié)果分析判定。1^1掌握畜禽細(xì)菌與病毒混合感染的病原分離與鑒定技術(shù)。1^1掌握細(xì)菌藥敏試驗指導(dǎo)畜禽臨床用藥。二、實習(xí)安排時間地點內(nèi)容星期一5月26日白天逸夫樓4017診斷試劑的配制；器皿的準(zhǔn)備以及火菌的處理星期二5月27日白天逸夫樓4017病料的采取與處理；細(xì)菌的涂片檢查與分離培養(yǎng)星期三5月28日白天逸夫樓4017病毒的分離接種（病料過濾和接種細(xì)胞）；分離細(xì)菌鏡檢和增殖星期四5月29日晚上逸夫樓4017細(xì)菌的生化試驗、藥敏試驗和細(xì)菌鑒定；觀察接種細(xì)胞星期五5月30日江浦農(nóng)場參觀學(xué)習(xí)星期六5月31日下午逸夫樓4017病毒細(xì)胞病變觀察、菌落鑒定三、實習(xí)內(nèi)容日期：2014.5.26 星期：星期一白天王先煒老師講解本周傳染病學(xué)實習(xí)的主要內(nèi)容和實習(xí)目的，包括傳染病臨床診斷的主要方法及及操作，實習(xí)過程中的注意事項，將48名同學(xué)分為12小組，本組為第12組。分組進(jìn)行實驗器材的領(lǐng)取和準(zhǔn)備。準(zhǔn)備實驗器

采集病畜病 1, 實驗準(zhǔn)備（一） 滅菌消毒用品：手術(shù)刀片、手術(shù)刀柄、剪刀、大鑷子、小鑷子、剪刀、黃色槍頭一盒、用錫箔紙包好小濾器、玻璃勻漿器、1?5mL離心管、PCR管。（二） 其他用品：解剖盤、酒精燈、酒精棉球、解剖刀、記號筆、注射器、染色缸、乳膠手套、接種環(huán)、載玻片、細(xì)菌涂布棒、倒置顯微鏡等。（三） 試劑及配制TSA平板（6塊以上）成分：TSA：8g 瓊脂粉：0.08g去離子水 200mL121°C,15-20min, 冷卻至50°C左右，加入5mL的小牛血清，2?5mLNADTSB液體培養(yǎng)基（10管）成分：TSB：1.8g去離子水：50ml混勻后可分裝小試管內(nèi)（每管3mL）121C,15-20min用之前每只試管加1UL血清，1ULNAD血清：用前要滅能（56C,40min）生理鹽水：0.45gNaCI加入50mL去離子水，然后高壓滅菌細(xì)胞維持液：在50ml的DMEM液中加入1ml的血清和1ml的雙抗（青、鏈霉素）（研究生配制）；TE緩沖液（一起配置）：10*TEbuffer（100ml）1MTris-HClbuffer（PH=8）10ml500mMEDTA（PH=8）2ml定容至100ml,高壓保存1MTris-HCl（PH=8）（100ml）12.11gTris至80ml去離子水，加4.2ml濃HCl,定容至100ml,高壓滅菌500mMEDTA（PH=8）18.61gNa2EDTA?H2O至80ml去離子水，加2gNaOH，定容至100ml（四） 倒TSA平板2將TSA溶液高壓后冷卻至60C左右，加入小牛血清和NAD。然后將平板邊沿用酒精燈外焰灼燒消毒，將TSA溶液倒入平板中，均勻鋪滿整個平板，待其冷卻凝固后，標(biāo)記好班級，組名和時間等備用。日期：2014.5.27 星期：星期二細(xì)菌學(xué)檢查和病毒學(xué)檢查病料取樣。細(xì)菌的分離培養(yǎng)：取病豬肺臟（冰凍組織需充分解凍），用酒精棉球點燃消毒肺臟表面，無菌手術(shù)刀切口，將接種環(huán)伸入于肺臟肺泡內(nèi)，無菌劃線接種TSA平板。具體操作如下：a） 右手執(zhí)筆式持接種環(huán)，在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，待冷；b） 左手抓緊瓊脂培養(yǎng)基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿的蓋略抬起一些，進(jìn)行接種?；蛘撸瑢⑵矫笊w放在試驗臺上，盡量直立平皿靠近酒精燈火焰；c） 右手接種環(huán)在瓊脂的一端涂布，劃線時，接種環(huán)與瓊脂表面是30°-40°的角度輕輕接觸，利用腕力動作，切忌劃破瓊脂表面；d） 接種完畢，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號筆注明接種時間，接種者等，然后將平皿的底朝上，放置在37°溫箱內(nèi)培養(yǎng)24-48小時（培養(yǎng)后可出現(xiàn)多種菌落，注意區(qū)分不同培養(yǎng)時間點不同類型菌類形態(tài)）。組織觸片和染色觀察：a） 觸片：取一小塊肺臟組織，在潔凈的載玻片上輕輕地作2?3個壓跡，制成觸片；b） 干燥：將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形；c） 固定：在酒精燈處快速的來回通過2-3秒鐘，并不時以載玻片背面接觸皮膚，不覺過燙為宜（不超過60°0,放置待冷后，進(jìn)行染色；d） 初染:在涂片薄膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min；e） 水洗：用洗瓶中自來水沖洗，直至洗下的水呈無色為止；f） 媒染：用100-1000^移液槍吸取約300pL碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約1min；g） 水洗：用洗瓶中自來水沖洗，直至洗下的水呈無色為止；h） 脫色：斜置載玻片，滴加95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20-30S，隨即水洗；i） 復(fù)染：滴加沙黃染液1-2滴，使染色液覆蓋觸片約1min；j） 水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止；k） 干燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)及顏色，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。3.病毒學(xué)病料處理a）臨床上各種疾病的癥狀非常相似，而且極易發(fā)生混合感染，因此確診需依賴于實驗室的診斷。病毒性疾病的實驗室檢驗的大致程序如下：臨床標(biāo)本f分離培養(yǎng)f初步鑒定f最后鑒定。b） 用剪刀剪取病變明顯的肺臟部位，置于小青瓶或平皿中，用小剪刀剪成大小約1mm3的碎塊，然后加入等量滅菌生理鹽水或PBS，置于玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿，組織勻漿液倒入小青瓶中，置于-20°C冰箱凍存?zhèn)溆?。c） 老師幫助我們反復(fù)凍融三次。日期：2014.5.28 星期：星期三白天（一）細(xì)菌的鏡檢和增殖培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)24h，挑取疑似菌落（HPS為無色或淡灰色，半透明小菌落），制備細(xì)菌涂片，革蘭氏染色，鏡檢，將疑似菌落進(jìn)行再次劃板純化。（鏡檢：革蘭氏染色陰性，兩極著色，桿菌）挑取單個純培養(yǎng)的菌落，用接種環(huán)接種到TBS液體培養(yǎng)基中，37C，振搖培養(yǎng)16-32h。

（二） 病毒細(xì)胞接種1顯微鏡觀察母細(xì)胞的生長狀態(tài)：在顯微鏡下觀察母細(xì)胞的生長密度和生長狀況。2.細(xì)胞接種：在細(xì)胞板中加入過濾后的組織上清液，使其鋪滿細(xì)胞表面，置于37°。二氧化碳培養(yǎng)箱孵育1h；棄去組織濾液，在細(xì)胞中加入細(xì)胞維持液，37。。二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長情況和有無病變。（三） RNA的提取取100ul分離病毒液，加入ImlTrizol試劑，勻漿，室溫靜置2-3min；加入200ul氯仿，劇烈震蕩，室溫靜置2-3min；4°C12000rpm離心15min；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；4C12000rpm離心10min；棄上清，加入1?0ml75%乙醇，振搖，4C12000rpm離心5min；棄上清，干燥沉淀物（室溫約5min）；加入20ulDEPC水溶解沉淀。（四） RT-PCR（鑒別高致病性和非高致病性毒株）上游引物：5,-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3,下游引物：5，-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3'PCR反應(yīng)體系（總體系為25ul）模板 4ul（上述RNA提取備用液）2.5ul2.0ul1.0ul0?5u】0.5u】0.3ul14.2ul10*Mg2+freebutter2.5mmol?L-1Mg2+25mmol?2.5ul2.0ul1.0ul0?5u】0.5u】0.3ul14.2ul20pmol?L-1Dnsp116120pmol?L-1Dnsp1928TaqDNA聚合物滅菌雙蒸水反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94C3min，48C45s，72C75s，進(jìn)行5個循環(huán)；然后94C1min，54C45s，72C75s，?行34個循環(huán)；72C延伸10min。取8.0ul的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。日期：2014.5.28 星期：星期四 晚上6:00——9:30（一）細(xì)菌學(xué)實驗實驗材料：生化反應(yīng)管：商品化的葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麥芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶生化反應(yīng)管。商品化試劑：藥敏試紙、PCR試劑、引物、瓊脂糖細(xì)菌：商品化金黃色葡萄球菌細(xì)菌的生化試驗用接種針（無菌）取分離的細(xì)菌24h純培養(yǎng)物分別接種到含葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麥芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶的生化反應(yīng)管中，開口向下，放到滅菌培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并記錄。同時進(jìn)行脲酶試驗、氧化酶試驗和接觸酶試驗。（1）糖類分解試驗原理：接種細(xì)菌若發(fā)酵某種糖或醇，可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；如發(fā)酵的同時又產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色的同時，在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果。產(chǎn)酸，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色，并在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。（2） 脲酶試驗原理：細(xì)菌分解尿素產(chǎn)生兩分子氨，培養(yǎng)基pH升高，指示劑酚紅顯示出紅色，即證明細(xì)菌有脲酶。接種方法及結(jié)果判定:用接種環(huán)將細(xì)菌培養(yǎng)物接種與尿素瓊脂斜面，不要穿刺到底，下部留作對照。1?6h觀察，有時需要24h到6d。陽性反應(yīng)，則瓊脂斜面有粉紅到紫紅色。陰性反應(yīng)，不變色。（3） 氧化酶試驗原理：氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗時，此酶首先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。接種方法及結(jié)果判定：取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深，再加a-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。（4） 接觸酶試驗（也叫做觸媒實驗或者過氧化氫酶實驗）原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。接種方法及結(jié)果判定：取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。（5） 硫化氫試驗原理：細(xì)菌分解含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，與培養(yǎng)基中的醋酸鉛或硫酸亞鐵發(fā)生反應(yīng)，形成黑色的硫化氫或硫化亞鐵。結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果，培養(yǎng)液變黑為陽性，不變色為陰性藥敏試驗藥敏試紙種類：頭抱喹肟、頭抱曲松、阿米卡星、青霉素G、氨芐西林、頭孢唑林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、阿奇霉素、慶大霉素、新霉素、氯霉素、紅霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明。用涂布棒將分離細(xì)菌涂布與TSA或鮮血平板上，將各種抗菌藥物圓紙片（任選7種）分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等，37C培養(yǎng)，培養(yǎng)24h檢查。結(jié)果判定：根據(jù)藥物紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，來判斷對藥物的敏感程度。無抑菌圈，細(xì)菌對該抗生素不敏感；抑菌圈小于10mm，對該抗生素低度敏感。細(xì)菌在血平板上的初步鑒定將副豬嗜血桿菌水平劃線接種鮮血瓊脂平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37°C培養(yǎng)24-48h，呈現(xiàn)出典型的“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象，并且不出現(xiàn)溶血。（二） DNA提取取適量菌液（1/3EP管），12000rpm、5-6min，棄上清；加400ulTE溶液重懸細(xì)菌，離心12000rpm、5-6min；棄上清，加400ulTris（0.1mTris、8.5PH）重懸；加6ul蛋白酶K，56C水浴30-45min；5.100C煮沸20min，-20C保存?zhèn)溆?；（三?DNA的PCR檢測引物HSP1：GTGATGAGGAAGGGTGGTGTHSP2：GGCTTCGTCACCCTCTGTPCR反應(yīng)體系（總體系為25ul）模板3ul（上述DNA提取備用液）10*Mg2+freebutter2.5ul2.5mmol?L-1Mg2+2.0ul25mmol?L-1Mg2+1.0u!20pmol?L-1Dnsp11610.5u】20pmol?L-1Dnsp19280.5u!TaqDNA聚合物0.3ul火菌雙蒸水15.2ul反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94°C3min,48°C45s,72°C75s,進(jìn)行5個循環(huán)；然后94°C1min,54°C45s,72C75s，進(jìn)行34個循環(huán)；72C延伸10min。（四）觀察病毒液接種的細(xì)胞，是否有細(xì)胞病變?nèi)掌冢?014.5.30星期：星期五晚上注：因為農(nóng)場主母親去世，不能按照原先計劃參觀江浦農(nóng)場，故先將周六晚上的實驗計劃提前到周五晚上。（一） DNA的PCR瓊脂糖凝膠電泳和RNA的RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳取8.0ul的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，二者操作相同。（二） 老師小結(jié)關(guān)于本次實習(xí)的總結(jié)。包括操作中的注意事項及需要糾正的操作方法，如何分析實驗結(jié)果，不同實驗的失敗原因分析思路及實習(xí)報告的寫法等。四、實習(xí)結(jié)果及分析（1） 觸片檢查肺部組織觸片和支氣管觸片觀察到少量兩極革蘭氏陰性染色短小桿，還觀察到一些長桿菌和小球菌。（2） 增殖和鏡檢TBS管均渾濁，有菌生長。鏡檢有兩極革蘭氏陰性染色短小桿菌。（3） 衛(wèi)星試驗待檢和陽性對照兩塊血平板均無明顯的衛(wèi)星生長現(xiàn)象。試驗項目待檢組標(biāo)準(zhǔn)組試驗項目待檢組標(biāo)準(zhǔn)組結(jié)果分析糖類分解葡萄糖+++可能待檢樣品和陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品還是被污染了，所得結(jié)果有一定相似性卻并不完全一致，也有可能是在接種過程中接種針溫度過高使樣品菌受損所致。也 炊M a■99 ——蔗糖+■?果糖■++半乳糖■++D-核糖+■+麥芽糖■■+硫化氫■■■乙胺酰胺■■■鳥氨酸■■■脲酶試驗―r■■■(4)生化試驗注：“+頃表示產(chǎn)酸；“?！北硎井a(chǎn)氣；穹”表示既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣；“一”表示不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。(5(5)藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)菌共做3塊板，16種藥物，僅兩塊板有針尖大小透明菌落生長；待檢菌共做兩塊板，12種藥物，均無菌落生長。記錄為標(biāo)準(zhǔn)菌組中有效抑菌圈，其中紅霉素和復(fù)方新諾明的為平均值。藥物抑菌圈半徑結(jié)果結(jié)果分析阿米卡星12mm敏感所做待檢樣品菌對七種抗生素均敏感程度與副豬嗜血桿菌基本相同。紅霉素8mm不敏感氯霉素19mm敏感新霉素12mm敏感頭抱唑啉21mm敏感林可霉素7mm不敏感復(fù)方新諾明10mm敏感阿奇霉素15mm敏感排序：頭孢唑啉>氯霉素>阿奇霉素〉新霉素=阿米卡星〉復(fù)方新諾明〉紅霉素>林可霉素陽性條帶，可判斷沒有病毒。陽性條帶，可判斷沒有病毒。（6）RT-PCR（RNA病毒）和PCR（DNART-PCR和PCR產(chǎn)物的電泳圖像中均無RT-PCR和PCR電泳結(jié)果圖（7）細(xì)胞病變情況正常細(xì)胞，細(xì)胞大小基本相等，均勻平鋪生長（圖一）；接毒24h后有出現(xiàn)細(xì)胞病變，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀（圖二）；接毒48h后細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀，相較于第二天聚集更明顯，因為一般要盲傳三代才可出現(xiàn)明顯的CPE，此次實驗一代在顯微鏡下已有病變，因此可確認(rèn)有病毒增殖（圖三）。五、討論實驗無菌意識不足：應(yīng)在酒精燈15cm范圍內(nèi)操作，不可將平板蓋子完全打開接種，要注意規(guī)范操作，取用無菌實驗物品，勿碰觸槍頭尖頭部或是容器瓶口等。觸片：制作觸片時，沾一下即可，不要涂布，在開放環(huán)境下即可進(jìn)行操作。涂片：涂片操作時，先滴加生理鹽水，生理鹽水要適量，涂布均勻后在酒精燈上間斷過幾下，不可太燙，以不燙手背為原則。染色：HE染色時需注意每一步的染色時間，用蒸餾水沖洗時要將載玻片傾斜，從一頭緩緩沖洗，以防將樣品洗脫，每次加試劑時要完全覆蓋樣品表面，使其充分染色。倒平板：需注意要灼燒瓶口，倒1