DB37-T 3754-2019 動(dòng)物產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測(cè)方法　實(shí)時(shí)熒光PCR法-（高清版）

ICS 65.020.01B40

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3754—2019Qualitativedetectionofhorse,donkeyandmulederivedmaterialsinfeedandrelativeproducts—Qualitativedetectionofhorse,donkeyandmulederivedmaterialsinfeedandrelativeproducts—Real-timePCRmethod2019-12-052020-01-05山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局提出、歸口并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。引 言動(dòng)物相關(guān)產(chǎn)品中騾源性成分的檢測(cè)目前沒有國家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，且現(xiàn)有的基于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的驢、馬源性成分鑒定無法排除騾源性成分的干擾。動(dòng)物產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍本標(biāo)準(zhǔn)不適用于動(dòng)物深加工產(chǎn)品（如阿膠及其附屬產(chǎn)品）的檢測(cè)，本方法的最低檢出限（LOD）為100mg/kg。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)SN/T1193基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語和定義3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1熒光定量PCR技術(shù)在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。3.2Ct值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。3.3已知來源于單一動(dòng)物源性成分的樣品（4原理TaqManPCR（creatinekinase（）DNAPCRDNAPCRPCRPCR0.01g（10μL、20μL、100μL、1000μL）5.84℃，-20PCR6試劑和材料PCR6試劑和材料GB/T27403SN/T1193GB/T6682DNA檢測(cè)用引物和Taqman1）表1檢測(cè)用引物和Taqman推薦賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成的Taqman-MGB探針，或等效試劑。名稱序列（5’—3’）目的基因內(nèi)參照5’端引物內(nèi)參照3’端引物內(nèi)參照探針F:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’R:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’P:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TRAMA-3’真核生物18SrRNA基因馬成分5’端引物馬成分3’端引物馬成分探針F:5'-CCTGGTATGGAAACATTGGAATC-3'R:5'-CTTGGAGAGCGAGCACAGC-3'P:5’-FAM-CCGGAAACAAAGTGAG-MGBNFQ-3’馬核基因組ckm基因驢成分5’端引物驢成分3’端引物驢成分探針F:5'-CCTGGTATGGAAACATCGGAATC-3'R:5'-CTCGGAGAGCGAGCACAGC-3'P:5’-FAM-CCCGACACAAAGTGAG-MGBNFQ-3’驢核基因組ckm基因CTAB55mmol/LCTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTrispH20minTE10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0K：20mg/μLRNA5μg/μLTris6.12706.132PCR）PremixExTaq、南AceQqPCRProbeMasterMixDNADNA稱取0.2g～0.32mL1000μLCTAB40μLK，6530min，10min12000g10min，吸取1mL2mL離50025:24:112000離心12min，12000g離心10min65DNA5μLRNA酶，37℃溫浴30minμL24:11200012min12000g離心10min，12000g離心min50μLTEDNA，-20DNA提取也可使用等效的DNA提取試劑盒替代，推薦南京諾唯贊生物科技有限公司的FastPureTMTissueDNAIsolationMiniKit，或等效試劑盒。DNA取適量的DNA模板溶液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，DNA濃度計(jì)算按式（1）計(jì)算： C=A×N×50 (1)式中：C——DNA（ng/μL）；A——260nmN——核酸稀釋倍數(shù)；50——吸光值A(chǔ)260為1時(shí)，相對(duì)應(yīng)雙鏈DNA的濃度常數(shù)。當(dāng)A260/A280比值在1.8～2.0之間時(shí)，DNA模板適宜熒光定量PCR擴(kuò)增。DNAPCRDNAPCRPCR實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表2。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系試劑成分體積（單位：μL）2PCR引物F（10μM）引物R（10μM）P（5μM）樣品DNA（10ng/μL～100ng/μL）ddH2012.51111補(bǔ)至25PCR95℃預(yù)變性5min；95℃變性5s，60℃退火30s，45個(gè)循環(huán)。DNADNADNADNA以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無效，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Ct40.0；Ct40.0；Ct＜30.0；Ct＜30.0；Ct30.0在符合第9部分的情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：Ct≤35.0Ct≤35.0Ct40.035.0＜CtDNADNATEPCRPCRCt40.0CtPCRDNA。檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。附錄A（資料性附錄）擴(kuò)增產(chǎn)物序列馬ckmPCRDNA（93bp）F P1 AAACATTGGAATCAGCGCCGGAAACAAAGTGAGCTCTCGGGACCTGACAG61 TGGT