植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交幻燈片

第七章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

原生質(zhì)體概括原生質(zhì)體的培養(yǎng)體細(xì)胞雜交植物原生質(zhì)體(protoplast)：植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后所剩下的部分。即是沒有細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞一、原生質(zhì)體概況亞原生質(zhì)體在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成的一些較小的原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核，也可不具有細(xì)胞核。核質(zhì)體:由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體。胞質(zhì)體:不含細(xì)胞核，而僅含有細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。應(yīng)用：1.體細(xì)胞雜交（somatichybridization）：實現(xiàn)遠(yuǎn)緣物種的體細(xì)胞雜交，再通過植株再生就可能創(chuàng)造出新的植物個體2.遺傳轉(zhuǎn)化：實現(xiàn)外源DNA或細(xì)胞器的導(dǎo)入，通過植株再生就可以得到轉(zhuǎn)基因植物3.分離細(xì)胞器的理想材料4.無性系變異及突變體的篩選植物原生質(zhì)體研究進展1960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。1968年，Takebeetal.首次獲得煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。1985年，F(xiàn)ujimuraetal.世界第一例禾谷類作物－水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。（一）原生質(zhì)體的分離與收集

高產(chǎn)量、高質(zhì)量的原生質(zhì)體是進行原生質(zhì)體培養(yǎng)和操作的前提。

步驟：

1.材料的選擇；

2.酶解處理；

3.原生質(zhì)體的分離、純化；

4.原生質(zhì)體的活力檢測。1、材料的選擇1）取材細(xì)胞分裂旺盛的材料雙子葉植物：幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉單子葉植物（禾本科植物）：愈傷組織或懸浮細(xì)胞

2）預(yù)處理：有菌材料，必須進行表面消毒處理；暗處理；葉片萎蔫處理，撕去下表皮；質(zhì)壁分離處理；懸浮細(xì)胞or愈傷組織預(yù)培養(yǎng)。2、酶解處理⑴配制酶解液⑵酶解⑴酶解液酶酶溶劑（膜穩(wěn)定劑，pH穩(wěn)定劑）滲透壓穩(wěn)定劑①

酶類植物細(xì)胞壁的主要成分：纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)（連接細(xì)胞中間層）分離植物原生質(zhì)體的酶根據(jù)作用分為:纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶

酶Enzyme來源纖維素酶類Onozuka綠色木霉MeicelaseP綠色木霉Cellulysin綠色木霉DriselaseIrpexlutens果膠酶類Pectinase黑曲霉PectolyaseY-23日本黑曲霉MacerozymeR-10根霉半纖維素酶類RhozymeHP-150黑曲霉Hemicelluase黑曲霉成分用量（mg·L-1）KH2PO427.2KNO3101.0CaCl2·2H2O148.0MgSO4·7H2O246.0KI0.16BSA（牛血清白蛋白）MESpH=5.8②酶溶劑(CPW溶液:細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液

)無機離子：提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性；也可以提高原生質(zhì)體活力牛血清白蛋白：防止酶解過程對細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞pH緩沖劑：保持酶解液的酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，增加原生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。

③滲透壓調(diào)節(jié)劑目的：維持等滲環(huán)境，保證釋放出來的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性常用物質(zhì)：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度一般為0.35-0.8mol/L。具體用什么濃度，要根據(jù)材料的特點來確定。酶解液配制好后，要用過濾滅菌的方法進行滅菌，并且隨配隨用

⑵酶解將無菌材料放入酶解液中處理以釋放出原生質(zhì)體的過程原則：利用盡可能低的酶濃度和酶解時間獲得大量而有活力的原始質(zhì)體條件：材料與酶解液的比例為1g/10-20ml酶解液；一般在pH5.4~6.0、25-30℃、黑暗中振蕩（30～50r/m）酶解30min~幾十hours。苜蓿葉片的酶解法分離原生質(zhì)體3、原生質(zhì)體的收集與純化⑴目的：除去未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、葉綠體、微管成分和細(xì)胞團等組織殘渣；殘余酶液⑵預(yù)處理：酶解結(jié)束后，將酶解物通過孔徑為20-70μm的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去未被酶解的組織塊和細(xì)胞團，收集濾液于離心管中⑶純化方法：沉降法：用甘露醇作滲透壓調(diào)節(jié)劑和離心介質(zhì)，將收集的濾液低速離心，使原生質(zhì)體沉于管底漂浮法：用蔗糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑和離心介質(zhì)，將收集的濾液提高速度離心，使原生質(zhì)體漂浮于溶液表面，細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉于管底界面法：利用比重不同的溶液，經(jīng)離心后使完整無損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間，而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉于管底。苜蓿葉片原生質(zhì)體的純化完整的原生質(zhì)體苜蓿葉片的原生質(zhì)體4、原生質(zhì)體活力的測定熒光素雙醋酸酯（fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA）染色法原生質(zhì)體活力（%）=發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100%FDA活細(xì)胞脂酶分解有極性熒光素積累紫外光照射綠色熒光胞質(zhì)環(huán)流檢測法：以胞質(zhì)環(huán)流作為進行活躍代謝的指標(biāo)（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體制備好后，用培養(yǎng)基將原生質(zhì)體調(diào)至一定的密度（最低起始細(xì)胞密度以上），及時地進行培養(yǎng)。

1、培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)基基本上是參照植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。茄科植物：MS、NT十字花科和豆科：B5、KM8P禾本科：MS、N6、KM8P⑴無機鹽：大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的濃度低；由于Ca2+影響到膜的穩(wěn)定性，因此較高『Ca2+』的對原生質(zhì)體分裂有利。

⑵有機成分：原生質(zhì)體培養(yǎng)時要求培養(yǎng)基豐富的有機成分，如氨基酸、維生素、CM，YE，LH，CH、小牛血清等。成分?jǐn)?shù)量（mg·L-1）成分?jǐn)?shù)量（mg·L-1）成分?jǐn)?shù)量（mg·L-1）NH4NO3600KNO31900KCL300MgSO4·7H2O300CaCL2·2H2O600KH2PO4170KI0.75H3BO33.00ZnSO4·7H2O2.00MnSO4·H2O10.00Na2MO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.025CoCL2·6H2O0.025NaFe·EDTA28葡萄糖68400甘露糖125蔗糖125鼠李糖125果糖125纖維二糖125核糖125山梨醇125木糖125甘露醇125丙酮酸鈉5蘋果酸10檸檬酸10延胡索酸10肌醇100生物素0.005尼克酰胺1氯化膽堿0.5鹽酸吡哆醇1核黃酸0.1鹽酸硫胺素10抗壞血酸1D-泛酸鈣0.5維生素A0.005葉酸0.2維生素D30.005P-對氨基苯甲酸0.01維生素B120.01水解酪蛋白125椰子汁10

KM-8P（3）激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長素。⑷滲透壓穩(wěn)定劑：培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑，以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。等滲或者低于細(xì)胞內(nèi)的滲透壓（5）碳源----葡萄糖2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方式：

⑴固體培養(yǎng)（平板培養(yǎng)）瓊脂培養(yǎng)基與原生質(zhì)體溶液混合搖勻，倒平板，薄層培養(yǎng)。特點：容易觀察、統(tǒng)計原生質(zhì)體的分裂情況，但操作比較復(fù)雜。進行平板培養(yǎng)時，要注意混合時培養(yǎng)基的溫度；平板培養(yǎng)在以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物方面也要復(fù)雜些。⑵液體淺層培養(yǎng)將含原生質(zhì)體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其成一薄層，封口后進行培養(yǎng)。特點：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，而且方便以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連，從而影響其進一步的生長、分裂原生質(zhì)體的位置不能固定，所以不能跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的生長過程。⑶液體—固體結(jié)合培養(yǎng)①液體淺層—固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。特點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中如果在固體培養(yǎng)基中加入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)物分泌的有毒物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的生長和分裂。

（4）瓊脂糖珠培養(yǎng)：用移液管吸取含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基，滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入適量的液體培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)。特點：改進了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進可以促進原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團的形成。3、培養(yǎng)條件⑴植板密度：104～105個/mL⑵散射光或黑暗⑶溫度：25～30℃（三）原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生原生質(zhì)體→形成新的細(xì)胞壁→第一次分裂→小細(xì)胞團→愈傷組織→再生苗1細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體數(shù)小時后開始形成新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細(xì)胞壁2細(xì)胞分裂和生長在細(xì)胞分裂開始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸降低，否則會影響細(xì)胞的繼續(xù)生長、分裂。新細(xì)胞2-7d第一次分裂2w后多細(xì)胞的細(xì)胞團3w后小細(xì)胞克隆約6w后直徑1mm的小愈傷組織低滲透壓3植株再生將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。愈傷組織將通過形態(tài)發(fā)生的兩條途徑即器官發(fā)生或胚胎發(fā)生形成再生植株。

Plantregenerationfromleafprotoplastsofeveningprimrose

（夜來香）1d5d7d10d4周5周7周苜蓿原生質(zhì)體分裂6weeksafterisolation8weeksafterisolation苜蓿原生質(zhì)體形成細(xì)胞團苜蓿原生質(zhì)體再生植株植物體細(xì)胞雜交（somatichybridization）又稱為原生質(zhì)體融合（protoplastfusion），指將植物不同種、屬、甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。三體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交主要集中以下植物 茄科植物 十字花科 禾本科 豆科體細(xì)胞雜交過程：原生質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體的融合；雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)；雜種植株的再生和鑒定1、原生質(zhì)體的制備2、原生質(zhì)體的融合：自發(fā)融合：在原生質(zhì)體分離過程中發(fā)生誘發(fā)融合：人為手段誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法Protoplastfusion誘發(fā)融合物理融合化學(xué)融合NaNO3法高鈣高PH法PEG法電融合微融合①PEG誘導(dǎo)融合法----1974，Kao等提出PEG即聚乙二醇，用于融合的PEG相對分子量一般在6000左右，是一種高效融合劑。優(yōu)點：融合成本低，不需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率高；融合過程不受物種限制缺點：融合過程繁瑣；PEG可能對細(xì)胞有毒害主要步驟如下：①融合液配制②融合原生質(zhì)體的密度和比例將兩親本A和B調(diào)整到1×104個/mL，并按1：1混合，靜置2min后開始融合③融合向原生質(zhì)體混合液中加入等體積的PEG誘導(dǎo)融合劑，輕輕搖勻后，放置10min。離心（100×g，10min），棄去上清液，用培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體。重復(fù)（３）２－４次，最后用培養(yǎng)基調(diào)至適當(dāng)?shù)拿芏扰囵B(yǎng)（液體淺層培養(yǎng)、平板培養(yǎng)等）②高鈣高pH法高鈣高pH法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的步驟與PEG法基本相同，只是誘導(dǎo)劑是Ca2+濃度較高的強堿溶液，誘導(dǎo)融合時要保溫（30-37℃）。③電融合法（