DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制課件

第四節(jié)DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制

第四節(jié)1一．DNA的限制酶反應(yīng)

1.酶單位定義:

使1μg某種DNA在最適反應(yīng)條件下和1小時內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。

2.酶切反應(yīng)類型

1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)

2)部分酶切

3.酶切反應(yīng)最適條件

1)DNA分子的組成

i.堿基組成與排列方式

ii.識別位點兩側(cè)的堿基組成與排列方式，同一DNA分子中不同識別位點的酶切速度可相差10倍（如λ中的EcoRI位點）

2)反應(yīng)條件

i.DNA溶液的純度和濃度（反應(yīng)濃度）依實驗?zāi)康亩℉paI(CCGG)126ThaI(CGCG)023一．DNA的限制酶反應(yīng)依實驗?zāi)康亩℉paI(CCGG)2

ii.限制酶的純度和穩(wěn)定性

i)純度：盡可能保持廠家推薦的反應(yīng)條件

ii)穩(wěn)定性：保存和反應(yīng)

iii.反應(yīng)緩沖液：常用三種核心緩沖液，即高（H），中（M），低（L）鹽緩沖液，不同溫度下的pH值

iv.反應(yīng)溫度：大多數(shù)為37℃

v.

雙酶切和多酶切反應(yīng)同時酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使用的緩沖液和反應(yīng)溫度必須相同，即使相同時，一旦發(fā)生部分酶切反應(yīng)，便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者--分別酶切。

i)第一種酶切電泳檢查酚/氯仿純化第二種酶切?？刹豢紤]酶切先后順序，但操作步驟多。

ii)采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切電泳檢查采用高濃度鹽緩沖液的限制酶切。操作簡單，但要分先后。假如兩酶切位點相距很近（如多克隆位點區(qū)），首先考慮的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時，其結(jié)果大不相同。

如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)ii.限制酶的純度和穩(wěn)定性3二、限制酶圖譜的繪制

1.完全酶切作圖法

1）單酶切作圖法一長度為5Kb的線狀DNA分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電泳結(jié)果和各位點的可能性排列。要確定其位置，可采用下述輔助方法之一。

i.單酶部分酶切：部分酶切時，各種可能性均存在，但只有相鄰的兩個DNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。二、限制酶圖譜的繪制4ii.末端標記完全酶切

DNA片段末端標記完全酶切凝膠電泳EtBr染色觀察放射自顯影

2)

雙酶切作圖法單酶切結(jié)果只能確定一種酶的位點，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時則不行ii.末端標記完全酶切2)雙酶切作圖法5分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當作在一張圖上時，上述兩種可能性中只有一種是對的，因此必須進行雙酶切反應(yīng)，其結(jié)果見圖根據(jù)上述的原理和步驟，前述的5Kb片段酶I與酶II的定位結(jié)果可用兩種方法之一：

i)單酶切分離DNA片段第二種酶切凝膠電泳

ii)單酶切第二種酶切凝膠電泳*如果要同時將兩種限制酶定位在一條DNA上時，單酶完全酶切作圖就沒必要了。

分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當作在一張圖上時6

2.末端標記-部分酶切作圖法（Smith-Brinstiel法）

DNA片段末端標記酶1切分離帶標記DNA片段酶2部分酶切電泳EtBr染色照相放射自顯影結(jié)果單端標記方法:

人工合成單端標記法

限制酶切單端標記法2.末端標記-部分酶切作圖法（Smith-Brinsti7單端標記方法1

人工合成單端標記法單端標記方法18單端標記方法2

限制酶切單端標記法單端標記方法29

3.末端標記雙相作圖法方法2仍存在兩個不足之處：①酶1的選擇不能靠近DNA中央；②需先分離DNA片段，該法可克服上述缺點?，F(xiàn)假設(shè)有一片段長10Kb，其中RE1有三個切點，RE2有一個切點，其圖譜可能是:3.末端標記雙相作圖法104.Bal31順序酶解作圖法

DNA片段Bal31處理不同時間取樣終止反應(yīng)限制酶切凝膠電泳染色觀察結(jié)果5.切口移位作圖法(可檢測出100bp片段)

雙鏈DNA切口移位限制酶切電泳放射自顯影4.Bal31順序酶解作圖法5.切口移位作圖法(可檢測出116.大尺度限制酶作圖

1)

條件

i.

電泳方法脈沖場凝膠電泳

ii.

樣品制備原位DNA制備和酶解

iii.

人工染色體構(gòu)建pYAC載體構(gòu)建

iv.

脊椎動物基因組中的CpG和植物基因組中的CpXpG序列存在

2)

一般作圖程序原位DNA樣品制備原位DNA限制酶切脈沖場凝膠電泳染色觀察

3)

大尺度作圖用酶

i.

稀有識別序列內(nèi)切酶I型內(nèi)含子內(nèi)切酶(真菌細胞核和線粒體基因組,T4噬菌體,衣藻葉綠體和線粒體)；酵母HO內(nèi)切酶；大腸桿菌recA

雖然這些內(nèi)切酶識別的序列都很長：10-19bp，但高等動植物基因組中含有這類位點卻極少，因而很少使用6.大尺度限制酶作圖12

ii.

II型限制酶人基因組有45,000個CpG島,一個長度約為1.5kb富含GC的DNA片段,其中只有25%的CpG島未被甲基化,這些CpG島常位于基因的5’-端,未被甲基化的CpG島平均長約270kb

可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識別8或6bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列

i)

AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGCii)

FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGCiii)

SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)

CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)

BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGGvi)

NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)

MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,

SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3ii.

II型限制酶CH3CH3CH3CH313三.

限制酶圖譜的用途

1.

基因工程中的應(yīng)用

1)

克隆載體圖譜,便于DNA重組;2)

克隆片段圖譜可用于次克隆,體外突變,基因定位,核酸定序.

2.

突變體檢測遺傳學(xué)圖譜必須依賴各種突變體存在,因此必然發(fā)生了基因型和表型的變化.

限制酶圖譜不必依賴表型變化,酶譜的變化一定是基因型發(fā)生了變化,但不一定發(fā)生了表型變化,即表型的變化不一定會導(dǎo)致酶譜變化.1)

缺失突變體的檢測:某DNA片段消失,代之以一較小DNA片段.2)

插入突變體的檢測:某DNA片段消失,代之以一較大DNA片段.三.

限制酶圖譜的用途14缺失和插入突變體的檢測（I）III點突變的檢測（II）缺失和插入突變體的檢測（I）I153）點突變的檢測:某DNA片段消失,代之以兩較小的DNA片段.前者的長度等于后兩者長度之和(位點增加)；某兩DNA片段消失,代之以一較大DNA片段，前者的長度之和等于后者長度(位點消失).

3.

重組頻率的測定同一染色體座位上的等位基因可能具有不同的表型,從而構(gòu)成遺傳多型性.等位基因的限制酶譜也可能具有多型性,這就是限制酶片段長度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不同個體總DNA限制酶完全酶切Southern印跡雜交結(jié)果分析3）點突變的檢測:某DNA片段消失,代之以兩較小16

當不同個體交配時,除自由組合外,也可發(fā)生重組,如不同果蠅交配時,其后代的表型和限制酶譜可為:表型紅:白=1:1,限制酶譜30%個體已發(fā)生了重組.4.

遺傳疾病的診斷分析正常人與遺傳病患者的某些DNA片段的限制酶譜,便可發(fā)現(xiàn)其差異,并總結(jié)出各種遺傳疾病的限制酶長度多態(tài)性圖。臨床診斷時，將遺傳病可疑患者的限制酶譜與之比較,便可判斷其是否患有此病.當不同個體交配時,除自由組17第五節(jié)DNA的連接

第五節(jié)18一.DNA的連接方法兩種不同的DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNA結(jié)構(gòu).1.直接連結(jié)法該法適用于:1)

同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相同粘性末端

重組DNA可用同種酶再切開,但識別簡并序列的限制酶除外(如AraI)2)不同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相容性末端

i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI3)PCR產(chǎn)物與特定載體的連接

4)限制酶和其他方式產(chǎn)生的平整末端.一.DNA的連接方法192.人工接頭連接法1)人工接頭（linker）的結(jié)構(gòu)

i.中軸對稱互補,可自行退火形成雙鏈.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶識別位點

iii.某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保持同相.如:

八聚體d(GGAATTCC)

十聚體d(CGGAATTCCG)

十二聚體d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端的連接(各種結(jié)構(gòu)的DNA末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火2.人工接頭連接法2X5'-CCGGAATTCCGG-320ii.產(chǎn)生新的克隆位點

iii.合成匹配接頭3)連接方法

人工接頭磷酸化退火形成雙鏈與目的DNA相連限制酶切兩DNA分子相連4)適用范圍

人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡便,快速,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結(jié)構(gòu).為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連.ii.產(chǎn)生新的克隆位點213.匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時,便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接頭的結(jié)構(gòu)特點

i.

由兩個低聚核苷酸組成

ii.部分區(qū)域可以互補

iii.退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端2)

匹配接頭的種類3.匹配接頭連接法22i.

預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端)

人工接頭+匹配接頭預(yù)制匹配接頭

ii.轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接頭退火轉(zhuǎn)換匹配接頭二人工接頭連接酶雙酶切轉(zhuǎn)換匹配接頭

iii.單鏈匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾連接法在兩個不同的DNA分子末端各加上一個可互補的同聚物,即AT或GC.5.連接方法的選擇方法選擇的依據(jù):1)兩DNA分子的末端結(jié)構(gòu)

2)DNA分子的限制酶譜

3)是否需要回收DNA片段i.

預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端)23連接方式的選擇載體末端外源DNA末端常規(guī)連接脫磷酸化同聚物平端連接補齊,人工接頭

結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)載體加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二選擇第一選擇不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能結(jié)合使用接頭不能不能第一選擇

3’-突起相容3’-突起唯一選擇不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一選擇不能第二選擇

(補齊后)

平端平端不能可能可能第一選擇可能平端3’-或5’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇連接方式的選擇24二.DNA的連接反應(yīng)

1.

連接反應(yīng)理論當兩種DNA分子相連時,它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果,這些結(jié)果與以下因素有關(guān):1)

連接反應(yīng)系統(tǒng)中的總DNA濃度i2)

一個DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j,該值與DNA的長度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化)3)

兩種不同DNA分子的克分子濃度之比值.2.

連接反應(yīng)條件

1)

評估連接反應(yīng)結(jié)果的方法

i.

瓊脂糖凝膠電泳

ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化

2)

反應(yīng)條件二.DNA的連接反應(yīng)25i.

溫度

ii.ATP濃度

iii.時間

iv.連接酶濃度

v.克分子比率DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制課件26

第六節(jié)

PCR技術(shù)第六節(jié)

27一．DNA體外擴增技術(shù)

1.

PCR反應(yīng)體系

1)基本原理(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶鏈式反應(yīng))

一個DNA經(jīng)n次擴增后,一個DNA分子可變?yōu)?n個分子DNA擴增需要對待擴增的DNA序列有所了解，至少要對其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物

2)基本操作待擴增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl緩沖液+兩引物90℃變性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′進入第二次循環(huán)25-30次循環(huán)一．DNA體外擴增技術(shù)28PCR原理示意圖PCR原理示意圖292.PCR產(chǎn)物的鑒定

1)PCR產(chǎn)物的大小和限制酶譜分析2)寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）

OR分析對于PCR產(chǎn)物的限制酶位點上發(fā)生了點突變的檢測極其有用2.PCR產(chǎn)物的鑒定2)寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析30PCR產(chǎn)物的OR鑒定PCR產(chǎn)物的OR鑒定313)分子雜交適合于檢測PCR產(chǎn)物的非限制酶位點上堿基突變。它是利用兩條引物鏈間的特異性DNA片段作探針(常為人工合成的一段低聚核苷酸，約20n.t.).當這種探針的核苷酸序列與待測的DNA核苷酸序列完全互補時才能雜交。如果利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針（allele-specificOligonucleotide,ASO）與PCR產(chǎn)物進行雜交，可檢測出PCR產(chǎn)物的堿基突變。可直接利用斑點雜交方法用于基因型分析3)分子雜交324)核苷酸序列分析

DNA擴增產(chǎn)物變性與末端標記的擴增引物或定序引物退火雙脫氧核苷酸鏈終止反應(yīng)，測定DNA序列4)核苷酸序列分析33二．TaqDNA聚合酶的特點

TaqDNA聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌YT-1中分離純化而得。該酶的分子量為63-68kD

1.無磷酸單酯酶、磷酸二酯酶以及單鏈外切酶活性，無內(nèi)切酶活性，但具有依賴于聚合酶活性的5’3’外切酶活性

2.最適反應(yīng)溫度為80℃

3.最適pH8.0和最佳反緩沖液Tris·HCl

4.最佳二價陽離子Mg2+

（10mM）

5.具良好的熱穩(wěn)定性：在90℃下連續(xù)反應(yīng)30分鐘仍有70%的酶活二．TaqDNA聚合酶的特點34TaqDNA聚合酶的特性TaqDNA聚合酶的特性35當采用TaqDNA聚合酶進行DNA體外擴增時，必須考慮到以下五個參數(shù)：

1）熱穩(wěn)定性：在PCR循環(huán)中DNA的變性時間常為30-60″，若循環(huán)30次，其累計加熱變性時間為15-30′。TaqDNA聚合酶在90℃下保溫30′仍具有70%酶活性，可大大減少操作步驟，易于實現(xiàn)自動化*2）模板與引物的特異性：當退火溫度和DNA鏈延伸時溫度偏低時，引物與模板配對的特異性大大降低，從而導(dǎo)致一些不需要的DNA片段被擴增。顯然，其產(chǎn)物的專一性大大降低，使結(jié)果無法分析。由于TaqDNA聚合酶最適反應(yīng)溫度為80℃，退火溫度可提高到55℃以上，由此大大減少了引物與模板的非專一性結(jié)合，使產(chǎn)物均一性大大增加**3）合成產(chǎn)率：反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反應(yīng)進入平臺期，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進行20次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當采用TaqDNA聚合酶時，擴增25次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可大4×106***4）延伸長度：有時為了獲取較長DNA片段的擴增，這就要求DNA聚合酶具有較強的延伸能力。當擴增片段大于250bp時，Klenow片段和T4聚合酶擴增產(chǎn)率大大降低。利用T7DNA聚合酶，可使擴增片段達2Kb。當利用TaqDNA聚合酶時，最長延伸長度為4.4Kb.當采用TaqDNA聚合酶進行DNA體外擴增時，必須考慮到以36

經(jīng)改造的TaqDNA聚合酶可擴增出40kb的DNA片段.5）擴增產(chǎn)物的可靠性：評估DNA聚合酶的一個重要指標是它復(fù)制DNA的可靠性，即摻入錯誤堿基的頻率。這對于PCR技術(shù)的可靠性是至關(guān)重要的。Klenow片段的錯誤摻入率為10-4，TaqDNA聚合酶的錯誤摻入率為5×10-3

，而T4聚合酶的錯誤摻入率為10-7。

*注：1）退火溫度常與引物的長度和堿基組成有直接相關(guān)關(guān)系，引物越長或GC含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低些。退火溫度越高，引物與模板（即擴增的DNA）結(jié)合的特異性越高，這可大大減少非特異性DNA片段的擴增。引物的長度常為20-28聚體，其中有50%以上的GC含量，無自身互補序列，特別是3'末端不應(yīng)有內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)，引物加量為每100μll20pmol.**2)出現(xiàn)平臺期的原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。***3）鏈延伸長度與延伸時間有關(guān)，對于TaqDNA聚合酶，每分鐘可形成2000n.t.或更多。如果要擴增3-4Kb的DNA，在72℃下需將酶延伸時間增至3-4分鐘。經(jīng)改造的TaqDNA聚合酶可擴增出437三．PCR方法

1.

強化PCR（BoostedPCR）將PCR分為兩個階段：

1）引物與模板之比為107，擴增20個周期

2）引物與模板之比為1012–1013，再擴增10個周期該法適合于待擴增DNA濃度較低時。

2.混合寡核苷酸引物PCR（mixedoligonucleotideprimedamplificationofcDNA,MOPAC）根據(jù)各氨基酸最常用的密碼子合成一系列引物，對某一特定cDNA進行擴增。

3.錨定PCR(AnchoredPCR，A-PCR)三．PCR方法384.連結(jié)PCR(ligationmediatedPCR)

該法可用于核苷酸序列測定,DNA足跡分析技術(shù)和測定甲基化作用4.連結(jié)PCR(ligationmediatedPCR395.不對稱PCR(AsymmetricalPCR)采用不同引物濃度比率，如50：1，100：1，可得大量拷貝的ssDNA用于測序6.GC串PCR(GCclampPCR)應(yīng)用變性劑梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)可檢測出DNA片段中一對堿基的變化，在DNA分子一端加上一GC串（約40n.t.）利用它的高解鏈溫度特性，在梯度變性膠上可檢測出原DNA鏈中最高解鏈區(qū)內(nèi)的點突變5.不對稱PCR(AsymmetricalPCR)6.40

7.競爭引物PCR(competitiveoligonucieotideprimerPCR,COP-PCR)

有一個堿基變化的兩種引物在較寬松的復(fù)性條件下競爭DNA模板，其中只有完全互補的引物才能大量配對。該法可用于測定某一DNA片段上是否帶有某一已知堿基置換。7.競爭引物PCR(competitiveoligo418.等位基因?qū)Ｒ籔CR(AllelespecificPCR,ASPCR)

該法可用于檢測點突變。如用于檢測鐮刀形貧血癥。9.反轉(zhuǎn)PCR(inverserarinvertedPCR)

該法可用于擴增已知序列兩側(cè)的未知序列8.等位基因?qū)Ｒ籔CR(AllelespecificPC4210.反向PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

主要用于mRNA的PCR擴增

10.反向PCR(reversetranscription43

11.加端PCR(Add-onPCR)

在合成引物時加上研究者所需要的核苷酸序列，如某種限制酶的識別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列

12.錯配PCR（mismatchedPCR)

利用該法可在一已知DNA序列中引起點突變，缺失突變和插入突變。11.加端PCR(Add-onPCR)4413.重組PCR(RecombinantPCR)

利用該法可將不同基因的DNA片段連接在一起。13.重組PCR(RecombinantPCR)4514.基因克隆PCR

利用該法可獲一完整的cDNA克隆。四.定量PCR技術(shù)

1.

基本原理

N=N0(1+eff)nN-最終拷貝數(shù)；N0-起始拷貝數(shù)；eff-擴增效率；n-擴增次數(shù)

2.

測定方法

競爭PCR法(加入已知量的標準物)；RT-PCR-轉(zhuǎn)錄法14.基因克隆PCR四.定量PCR技術(shù)46五．PCR技術(shù)的應(yīng)用

1.遺傳疾病的診斷人類鐮刀型貧血癥是因第六個密碼子的第二個字母發(fā)生了A→T的改變，從而導(dǎo)致該位點的谷氨酸為纈氨酸所取代。A→T突變還導(dǎo)致限制酶OxaNI位點的消失。利用PCR技術(shù)和限制酶譜分析診斷此分子疾病大致過程如下：

DNA擴增PAGE染色觀察比較不同個體的結(jié)果限制酶切PAGE染色觀察此法可在3-4h獲得結(jié)果，比常規(guī)的Southern雜交法簡便、快速。五．PCR技術(shù)的應(yīng)用472.傳染病的診斷如果已知某種病原菌(體)中的特異性DNA片段的核苷酸序列，這個片段就可以用于DNA擴增，并利用DNA雜交或凝膠電泳的方法診斷病原體的存在與否。例如AIDS的診斷，常規(guī)方法是利用血清背景和病毒培養(yǎng)，往往需要3-4個星期，采用PCR技術(shù)則只需一天左右，且準確率高3.基因的快速克隆根據(jù)已知基因序列設(shè)計PCR引物,可直接在不同的樣品中進行PCR擴增,而不必分離純化生物樣品4.基因突變

1）缺失突變

2）插入突變

3）點突變單點和多點突變2.傳染病的診斷3.基因的快速克隆48六.等溫3SR(self-substainedsequencereplication)反應(yīng)系統(tǒng)七.等溫鏈取代擴增反應(yīng)系統(tǒng)(SDA,stranddisplacementamplification)六.等溫3SR(self-substainedseque49等溫3SR反應(yīng)系統(tǒng)(self-substainedsequencereplication)等溫3SR反應(yīng)系統(tǒng)50等溫鏈取代擴增反應(yīng)系統(tǒng)

(SDA,stranddisplacementamplification)等溫鏈取代擴增反應(yīng)系統(tǒng)51DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制課件52第四節(jié)DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制

第四節(jié)53一．DNA的限制酶反應(yīng)

1.酶單位定義:

使1μg某種DNA在最適反應(yīng)條件下和1小時內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。

2.酶切反應(yīng)類型

1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)

2)部分酶切

3.酶切反應(yīng)最適條件

1)DNA分子的組成

i.堿基組成與排列方式

ii.識別位點兩側(cè)的堿基組成與排列方式，同一DNA分子中不同識別位點的酶切速度可相差10倍（如λ中的EcoRI位點）

2)反應(yīng)條件

i.DNA溶液的純度和濃度（反應(yīng)濃度）依實驗?zāi)康亩℉paI(CCGG)126ThaI(CGCG)023一．DNA的限制酶反應(yīng)依實驗?zāi)康亩℉paI(CCGG)54

ii.限制酶的純度和穩(wěn)定性

i)純度：盡可能保持廠家推薦的反應(yīng)條件

ii)穩(wěn)定性：保存和反應(yīng)

iii.反應(yīng)緩沖液：常用三種核心緩沖液，即高（H），中（M），低（L）鹽緩沖液，不同溫度下的pH值

iv.反應(yīng)溫度：大多數(shù)為37℃

v.

雙酶切和多酶切反應(yīng)同時酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使用的緩沖液和反應(yīng)溫度必須相同，即使相同時，一旦發(fā)生部分酶切反應(yīng)，便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者--分別酶切。

i)第一種酶切電泳檢查酚/氯仿純化第二種酶切?？刹豢紤]酶切先后順序，但操作步驟多。

ii)采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切電泳檢查采用高濃度鹽緩沖液的限制酶切。操作簡單，但要分先后。假如兩酶切位點相距很近（如多克隆位點區(qū)），首先考慮的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時，其結(jié)果大不相同。

如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)ii.限制酶的純度和穩(wěn)定性55二、限制酶圖譜的繪制

1.完全酶切作圖法

1）單酶切作圖法一長度為5Kb的線狀DNA分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電泳結(jié)果和各位點的可能性排列。要確定其位置，可采用下述輔助方法之一。

i.單酶部分酶切：部分酶切時，各種可能性均存在，但只有相鄰的兩個DNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。二、限制酶圖譜的繪制56ii.末端標記完全酶切

DNA片段末端標記完全酶切凝膠電泳EtBr染色觀察放射自顯影

2)

雙酶切作圖法單酶切結(jié)果只能確定一種酶的位點，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時則不行ii.末端標記完全酶切2)雙酶切作圖法57分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當作在一張圖上時，上述兩種可能性中只有一種是對的，因此必須進行雙酶切反應(yīng)，其結(jié)果見圖根據(jù)上述的原理和步驟，前述的5Kb片段酶I與酶II的定位結(jié)果可用兩種方法之一：

i)單酶切分離DNA片段第二種酶切凝膠電泳

ii)單酶切第二種酶切凝膠電泳*如果要同時將兩種限制酶定位在一條DNA上時，單酶完全酶切作圖就沒必要了。

分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當作在一張圖上時58

2.末端標記-部分酶切作圖法（Smith-Brinstiel法）

DNA片段末端標記酶1切分離帶標記DNA片段酶2部分酶切電泳EtBr染色照相放射自顯影結(jié)果單端標記方法:

人工合成單端標記法

限制酶切單端標記法2.末端標記-部分酶切作圖法（Smith-Brinsti59單端標記方法1

人工合成單端標記法單端標記方法160單端標記方法2

限制酶切單端標記法單端標記方法261

3.末端標記雙相作圖法方法2仍存在兩個不足之處：①酶1的選擇不能靠近DNA中央；②需先分離DNA片段，該法可克服上述缺點?，F(xiàn)假設(shè)有一片段長10Kb，其中RE1有三個切點，RE2有一個切點，其圖譜可能是:3.末端標記雙相作圖法624.Bal31順序酶解作圖法

DNA片段Bal31處理不同時間取樣終止反應(yīng)限制酶切凝膠電泳染色觀察結(jié)果5.切口移位作圖法(可檢測出100bp片段)

雙鏈DNA切口移位限制酶切電泳放射自顯影4.Bal31順序酶解作圖法5.切口移位作圖法(可檢測出636.大尺度限制酶作圖

1)

條件

i.

電泳方法脈沖場凝膠電泳

ii.

樣品制備原位DNA制備和酶解

iii.

人工染色體構(gòu)建pYAC載體構(gòu)建

iv.

脊椎動物基因組中的CpG和植物基因組中的CpXpG序列存在

2)

一般作圖程序原位DNA樣品制備原位DNA限制酶切脈沖場凝膠電泳染色觀察

3)

大尺度作圖用酶

i.

稀有識別序列內(nèi)切酶I型內(nèi)含子內(nèi)切酶(真菌細胞核和線粒體基因組,T4噬菌體,衣藻葉綠體和線粒體)；酵母HO內(nèi)切酶；大腸桿菌recA

雖然這些內(nèi)切酶識別的序列都很長：10-19bp，但高等動植物基因組中含有這類位點卻極少，因而很少使用6.大尺度限制酶作圖64

ii.

II型限制酶人基因組有45,000個CpG島,一個長度約為1.5kb富含GC的DNA片段,其中只有25%的CpG島未被甲基化,這些CpG島常位于基因的5’-端,未被甲基化的CpG島平均長約270kb

可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識別8或6bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列

i)

AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGCii)

FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGCiii)

SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)

CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)

BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGGvi)

NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)

MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,

SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3ii.

II型限制酶CH3CH3CH3CH365三.

限制酶圖譜的用途

1.

基因工程中的應(yīng)用

1)

克隆載體圖譜,便于DNA重組;2)

克隆片段圖譜可用于次克隆,體外突變,基因定位,核酸定序.

2.

突變體檢測遺傳學(xué)圖譜必須依賴各種突變體存在,因此必然發(fā)生了基因型和表型的變化.

限制酶圖譜不必依賴表型變化,酶譜的變化一定是基因型發(fā)生了變化,但不一定發(fā)生了表型變化,即表型的變化不一定會導(dǎo)致酶譜變化.1)

缺失突變體的檢測:某DNA片段消失,代之以一較小DNA片段.2)

插入突變體的檢測:某DNA片段消失,代之以一較大DNA片段.三.

限制酶圖譜的用途66缺失和插入突變體的檢測（I）III點突變的檢測（II）缺失和插入突變體的檢測（I）I673）點突變的檢測:某DNA片段消失,代之以兩較小的DNA片段.前者的長度等于后兩者長度之和(位點增加)；某兩DNA片段消失,代之以一較大DNA片段，前者的長度之和等于后者長度(位點消失).

3.

重組頻率的測定同一染色體座位上的等位基因可能具有不同的表型,從而構(gòu)成遺傳多型性.等位基因的限制酶譜也可能具有多型性,這就是限制酶片段長度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不同個體總DNA限制酶完全酶切Southern印跡雜交結(jié)果分析3）點突變的檢測:某DNA片段消失,代之以兩較小68

當不同個體交配時,除自由組合外,也可發(fā)生重組,如不同果蠅交配時,其后代的表型和限制酶譜可為:表型紅:白=1:1,限制酶譜30%個體已發(fā)生了重組.4.

遺傳疾病的診斷分析正常人與遺傳病患者的某些DNA片段的限制酶譜,便可發(fā)現(xiàn)其差異,并總結(jié)出各種遺傳疾病的限制酶長度多態(tài)性圖。臨床診斷時，將遺傳病可疑患者的限制酶譜與之比較,便可判斷其是否患有此病.當不同個體交配時,除自由組69第五節(jié)DNA的連接

第五節(jié)70一.DNA的連接方法兩種不同的DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNA結(jié)構(gòu).1.直接連結(jié)法該法適用于:1)

同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相同粘性末端

重組DNA可用同種酶再切開,但識別簡并序列的限制酶除外(如AraI)2)不同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相容性末端

i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI3)PCR產(chǎn)物與特定載體的連接

4)限制酶和其他方式產(chǎn)生的平整末端.一.DNA的連接方法712.人工接頭連接法1)人工接頭（linker）的結(jié)構(gòu)

i.中軸對稱互補,可自行退火形成雙鏈.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶識別位點

iii.某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保持同相.如:

八聚體d(GGAATTCC)

十聚體d(CGGAATTCCG)

十二聚體d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端的連接(各種結(jié)構(gòu)的DNA末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火2.人工接頭連接法2X5'-CCGGAATTCCGG-372ii.產(chǎn)生新的克隆位點

iii.合成匹配接頭3)連接方法

人工接頭磷酸化退火形成雙鏈與目的DNA相連限制酶切兩DNA分子相連4)適用范圍

人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡便,快速,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結(jié)構(gòu).為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連.ii.產(chǎn)生新的克隆位點733.匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時,便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接頭的結(jié)構(gòu)特點

i.

由兩個低聚核苷酸組成

ii.部分區(qū)域可以互補

iii.退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端2)

匹配接頭的種類3.匹配接頭連接法74i.

預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端)

人工接頭+匹配接頭預(yù)制匹配接頭

ii.轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接頭退火轉(zhuǎn)換匹配接頭二人工接頭連接酶雙酶切轉(zhuǎn)換匹配接頭

iii.單鏈匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾連接法在兩個不同的DNA分子末端各加上一個可互補的同聚物,即AT或GC.5.連接方法的選擇方法選擇的依據(jù):1)兩DNA分子的末端結(jié)構(gòu)

2)DNA分子的限制酶譜

3)是否需要回收DNA片段i.

預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端)75連接方式的選擇載體末端外源DNA末端常規(guī)連接脫磷酸化同聚物平端連接補齊,人工接頭

結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)載體加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二選擇第一選擇不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能結(jié)合使用接頭不能不能第一選擇

3’-突起相容3’-突起唯一選擇不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一選擇不能第二選擇

(補齊后)

平端平端不能可能可能第一選擇可能平端3’-或5’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇連接方式的選擇76二.DNA的連接反應(yīng)

1.

連接反應(yīng)理論當兩種DNA分子相連時,它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果,這些結(jié)果與以下因素有關(guān):1)

連接反應(yīng)系統(tǒng)中的總DNA濃度i2)

一個DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j,該值與DNA的長度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化)3)

兩種不同DNA分子的克分子濃度之比值.2.

連接反應(yīng)條件

1)

評估連接反應(yīng)結(jié)果的方法

i.

瓊脂糖凝膠電泳

ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化

2)

反應(yīng)條件二.DNA的連接反應(yīng)77i.

溫度

ii.ATP濃度

iii.時間

iv.連接酶濃度

v.克分子比率DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制課件78

第六節(jié)

PCR技術(shù)第六節(jié)

79一．DNA體外擴增技術(shù)

1.

PCR反應(yīng)體系

1)基本原理(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶鏈式反應(yīng))

一個DNA經(jīng)n次擴增后,一個DNA分子可變?yōu)?n個分子DNA擴增需要對待擴增的DNA序列有所了解，至少要對其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物

2)基本操作待擴增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl緩沖液+兩引物90℃變性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′進入第二次循環(huán)25-30次循環(huán)一．DNA體外擴增技術(shù)80PCR原理示意圖PCR原理示意圖812.PCR產(chǎn)物的鑒定

1)PCR產(chǎn)物的大小和限制酶譜分析2)寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）

OR分析對于PCR產(chǎn)物的限制酶位點上發(fā)生了點突變的檢測極其有用2.PCR產(chǎn)物的鑒定2)寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析82PCR產(chǎn)物的OR鑒定PCR產(chǎn)物的OR鑒定833)分子雜交適合于檢測PCR產(chǎn)物的非限制酶位點上堿基突變。它是利用兩條引物鏈間的特異性DNA片段作探針(常為人工合成的一段低聚核苷酸，約20n.t.).當這種探針的核苷酸序列與待測的DNA核苷酸序列完全互補時才能雜交。如果利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針（allele-specificOligonucleotide,ASO）與PCR產(chǎn)物進行雜交，可檢測出PCR產(chǎn)物的堿基突變?？芍苯永冒唿c雜交方法用于基因型分析3)分子雜交844)核苷酸序列分析

DNA擴增產(chǎn)物變性與末端標記的擴增引物或定序引物退火雙脫氧核苷酸鏈終止反應(yīng)，測定DNA序列4)核苷酸序列分析85二．TaqDNA聚合酶的特點

TaqDNA聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌YT-1中分離純化而得。該酶的分子量為63-68kD

1.無磷酸單酯酶、磷酸二酯酶以及單鏈外切酶活性，無內(nèi)切酶活性，但具有依賴于聚合酶活性的5’3’外切酶活性

2.最適反應(yīng)溫度為80℃

3.最適pH8.0和最佳反緩沖液Tris·HCl

4.最佳二價陽離子Mg2+

（10mM）

5.具良好的熱穩(wěn)定性：在90℃下連續(xù)反應(yīng)30分鐘仍有70%的酶活二．TaqDNA聚合酶的特點86TaqDNA聚合酶的特性TaqDNA聚合酶的特性87當采用TaqDNA聚合酶進行DNA體外擴增時，必須考慮到以下五個參數(shù)：

1）熱穩(wěn)定性：在PCR循環(huán)中DNA的變性時間常為30-60″，若循環(huán)30次，其累計加熱變性時間為15-30′。TaqDNA聚合酶在90℃下保溫30′仍具有70%酶活性，可大大減少操作步驟，易于實現(xiàn)自動化*2）模板與引物的特異性：當退火溫度和DNA鏈延伸時溫度偏低時，引物與模板配對的特異性大大降低，從而導(dǎo)致一些不需要的DNA片段被擴增。顯然，其產(chǎn)物的專一性大大降低，使結(jié)果無法分析。由于TaqDNA聚合酶最適反應(yīng)溫度為80℃，退火溫度可提高到55℃以上，由此大大減少了引物與模板的非專一性結(jié)合，使產(chǎn)物均一性大大增加**3）合成產(chǎn)率：反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反應(yīng)進入平臺期，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進行20次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當采用TaqDNA聚合酶時，擴增25次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可大4×106***4）延伸長度：有時為了獲取較長DNA片段的擴增，這就要求DNA聚合酶具有較強的延伸能力。當擴增片段大于250bp時，Klenow片段和T4聚合酶擴增產(chǎn)率大大降低。利用T7DNA聚合酶，可使擴增片段達2Kb。當利用TaqDNA聚合酶時，最長延伸長度為4.4Kb.當采用TaqDNA聚合酶進行DNA體外擴增時，必須考慮到以88

經(jīng)改造的TaqDNA聚合酶可擴增出40kb的DNA片段.5）擴增產(chǎn)物的可靠性：評估DNA聚合酶的一個重要指標是它復(fù)制DNA的可靠性，即摻入錯誤堿基的頻率。這對于PCR技術(shù)的可靠性是至關(guān)重要的。Klenow片段的錯誤摻入率為10-4，TaqDNA聚合酶的錯誤摻入率為5×10-3

，而T4聚合酶的錯誤摻入率為10-7。

*注：1）退火溫度常與引物的長度和堿基組成有直接相關(guān)關(guān)系，引物越長或GC含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低些。退火溫度越高，引物與模板（即擴增的DNA）結(jié)合的特異性越高，這可大大減少非特異性DNA片段的擴增。引物的長度常為20-28聚體，其中有50%以上的GC含量，無自身互補序列，特別是3'末端不應(yīng)有內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)，引物加量為每100μll20pmol.**2)出現(xiàn)平臺期的原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。***3）鏈延伸長度與延伸時間有關(guān)，對于TaqDNA聚合