酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)全解課件

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

郭建惠

郭建惠簡(jiǎn)介1971年，一位瑞典學(xué)者和一位荷蘭學(xué)者分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)ELISA就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)。簡(jiǎn)介1971年，一位瑞典學(xué)者和一位荷蘭學(xué)者分別報(bào)道將免ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病基本原理先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法洗去多余的分離抗原-抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定?；驹硐葘⒁阎目贵w或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保反應(yīng)模式酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法、生物素-親和素等。反應(yīng)模式酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、1，雙抗體夾心法：此法常用于檢測(cè)抗原它是檢測(cè)抗原最常用的ELISA，適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)。

1，雙抗體夾心法：此法常用于檢測(cè)抗原它是檢測(cè)抗原最常用的EL2，間接法測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。2，間接法測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體將已知抗原連接在固相載體3，競(jìng)爭(zhēng)法此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測(cè)物含量成反比。3，競(jìng)爭(zhēng)法此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用4，捕獲法（反向間接法）主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分以目前最常用的IgM測(cè)定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM和IgG同時(shí)存在，而后者可干擾IgM的測(cè)定。因此，先針對(duì)IgM的第二抗體連接于固相載體，用以“捕獲”樣品中所有IgM；洗滌除去IgG等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測(cè)IgM結(jié)合；再次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色后，即可對(duì)待IgM進(jìn)行定性和定量測(cè)定。4，捕獲法（反向間接法）主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分以目5，生物素-親和素

ABS為親和素、生物素系統(tǒng)的略語(yǔ)。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來，就可大提高ELISA的敏感度。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素－酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。5，生物素-親和素ABS為親和素、生物素系統(tǒng)的略語(yǔ)。親和素試劑組成：

1.包被板：包被有被檢物質(zhì)的抗原（抗體）

2.陰陽(yáng)對(duì)照：主要為含被檢物質(zhì)的陰性陽(yáng)性血清

3酶標(biāo)工作液：HRP(辣根過氧化物酶)

4.底物液A、B：TMB(四甲基聯(lián)苯胺）

5.終止液：2MH2SO4

6.濃縮洗滌液:PBS(磷酸鹽緩沖液）

儀器：

1.加樣槍

2.37℃恒溫水浴箱

3.PHOMO酶標(biāo)儀

試劑組成：儀器：2.加待檢樣本：孵育使標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

具體步驟1.包被:將特異性抗體包被固相載體孵育一定時(shí)間，使形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)4.加入底物：顯色固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物通過比色，測(cè)標(biāo)本中抗原的量。3.加入酶標(biāo)抗體：孵育，使形成固相抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗體。5.加入終止：終止反應(yīng)6.結(jié)果判定：將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，根據(jù)要求調(diào)整測(cè)量波長(zhǎng),在根據(jù)開單要求報(bào)定性定量值即可。2.加待檢樣本：孵育使標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)1

標(biāo)本的影響

溶血，脂血標(biāo)本清ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性標(biāo)本受細(xì)菌污染標(biāo)本保存不當(dāng)塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性標(biāo)本凝固不全1

標(biāo)本的影響溶血，脂血標(biāo)本清ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)2

試劑影響

ELISA檢測(cè)試劑廠家較多；因選用國(guó)家批準(zhǔn)文號(hào)，不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。試劑因妥善保管在4℃冰箱內(nèi)，使用前要想平衡室溫。不同批號(hào)試劑不能混用。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。2

試劑影響ELISA檢測(cè)試劑廠家較多；因選用國(guó)

3

操作技術(shù)的影響吸量的準(zhǔn)確性

吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測(cè)結(jié)果。因此加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)溫浴影響抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求。

加樣次序影響有時(shí)我們?cè)诩訕舆^程中，常常會(huì)遇到個(gè)別標(biāo)本未離心等情況，為了節(jié)約時(shí)間，往往這時(shí)我們會(huì)先加酶結(jié)合物，然后等標(biāo)本分離好后再加標(biāo)本，這樣常常會(huì)造成假陰性。洗滌方法對(duì)結(jié)果的影響洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果

3

操作技術(shù)的影響吸量的準(zhǔn)確性

溫浴影響4

干擾物質(zhì)的影響

大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等藥物的影響：如有些高效價(jià)的免疫球蛋白等4

干擾物質(zhì)的影響大約40%的人血清標(biāo)本中含有應(yīng)用ELISA法由于測(cè)定靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定、易于自動(dòng)化、無反射性污染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，使其成為目前應(yīng)用最廣泛而且發(fā)展最快的一種免疫測(cè)定技術(shù)。市場(chǎng)上符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測(cè)儀不斷研究發(fā)明問世，極大地促進(jìn)了ELISA測(cè)定技術(shù)的普及。應(yīng)用ELISA法由于測(cè)定靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、酶標(biāo)記謝謝大家！謝謝大家！酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

郭建惠

郭建惠簡(jiǎn)介1971年，一位瑞典學(xué)者和一位荷蘭學(xué)者分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)ELISA就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)。簡(jiǎn)介1971年，一位瑞典學(xué)者和一位荷蘭學(xué)者分別報(bào)道將免ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病基本原理先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法洗去多余的分離抗原-抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。基本原理先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保反應(yīng)模式酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法、生物素-親和素等。反應(yīng)模式酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、1，雙抗體夾心法：此法常用于檢測(cè)抗原它是檢測(cè)抗原最常用的ELISA，適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)。

1，雙抗體夾心法：此法常用于檢測(cè)抗原它是檢測(cè)抗原最常用的EL2，間接法測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。2，間接法測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體將已知抗原連接在固相載體3，競(jìng)爭(zhēng)法此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測(cè)物含量成反比。3，競(jìng)爭(zhēng)法此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用4，捕獲法（反向間接法）主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分以目前最常用的IgM測(cè)定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM和IgG同時(shí)存在，而后者可干擾IgM的測(cè)定。因此，先針對(duì)IgM的第二抗體連接于固相載體，用以“捕獲”樣品中所有IgM；洗滌除去IgG等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測(cè)IgM結(jié)合；再次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色后，即可對(duì)待IgM進(jìn)行定性和定量測(cè)定。4，捕獲法（反向間接法）主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分以目5，生物素-親和素

ABS為親和素、生物素系統(tǒng)的略語(yǔ)。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來，就可大提高ELISA的敏感度。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素－酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。5，生物素-親和素ABS為親和素、生物素系統(tǒng)的略語(yǔ)。親和素試劑組成：

1.包被板：包被有被檢物質(zhì)的抗原（抗體）

2.陰陽(yáng)對(duì)照：主要為含被檢物質(zhì)的陰性陽(yáng)性血清

3酶標(biāo)工作液：HRP(辣根過氧化物酶)

4.底物液A、B：TMB(四甲基聯(lián)苯胺）

5.終止液：2MH2SO4

6.濃縮洗滌液:PBS(磷酸鹽緩沖液）

儀器：

1.加樣槍

2.37℃恒溫水浴箱

3.PHOMO酶標(biāo)儀

試劑組成：儀器：2.加待檢樣本：孵育使標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

具體步驟1.包被:將特異性抗體包被固相載體孵育一定時(shí)間，使形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)4.加入底物：顯色固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物通過比色，測(cè)標(biāo)本中抗原的量。3.加入酶標(biāo)抗體：孵育，使形成固相抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗體。5.加入終止：終止反應(yīng)6.結(jié)果判定：將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，根據(jù)要求調(diào)整測(cè)量波長(zhǎng),在根據(jù)開單要求報(bào)定性定量值即可。2.加待檢樣本：孵育使標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)1

標(biāo)本的影響

溶血，脂血標(biāo)本清ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性標(biāo)本受細(xì)菌污染標(biāo)本保存不當(dāng)塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性標(biāo)本凝固不全1

標(biāo)本的影響溶血，脂血標(biāo)本清ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)2

試劑影響

ELISA檢測(cè)試劑廠家較多；因選用國(guó)家批準(zhǔn)文號(hào)，不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。試劑因妥善保管在4℃冰箱內(nèi)，使用前要想平衡室溫。不同批號(hào)試劑不能混用。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。2

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