PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件

PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理1PCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成：①模板的熱變性；②引物復(fù)性到單鏈模板上；③熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的延伸PCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成：①模板的熱變性；②引物復(fù)性2PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件3變性在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，變性溫度在94-95℃下進(jìn)行，這也是TaqDNA聚合酶進(jìn)行30個(gè)或30個(gè)以上PCR循環(huán)而活力不受到過多損失時(shí)能耐受的最高溫度。有時(shí)把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為5min，以便大分子模板DNA徹底變性的概率。對于GC含量為55%或更低的線性DNA模板，推薦PCR的變性條件是94-95℃變性45s。變性在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，變性溫度4復(fù)性溫度（退火溫度）至關(guān)重要?。?！退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率會非常低；退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增；退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的Tm值低3-5℃下進(jìn)行。最好通過對復(fù)性溫度比兩條引物的Tm值低2-10℃內(nèi)進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對復(fù)性條件的優(yōu)化。引物和模板DNA的復(fù)性復(fù)性溫度（退火溫度）至關(guān)重要?。?！引物和模板DNA的復(fù)性5對TaqDNA聚合酶來說，最適溫度為72-78℃，時(shí)間約為1min。引物的延伸與循環(huán)數(shù)目哺乳動物DNA為模板時(shí)，至少進(jìn)行25個(gè)循環(huán)才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為30-33個(gè)循環(huán)。對TaqDNA聚合酶來說，最適溫度為72-78℃，時(shí)6引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1）堿基組成：GC含量應(yīng)在40%-60%（45%-55%）之間，4中堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，沒有二核苷酸重復(fù)序列，如GCGCGC等；（2）引物長度：引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為18-25個(gè)核苷酸長度，上下引物長度差別不能大于3bp，如上游引物為19bp，下游引物為24bp等。引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1）堿基組成：7（3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會阻止引物和模板之間的復(fù)性。（3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：8（4）上下引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3'末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，因?yàn)镻CR中引物濃度較高，會形成引物二聚體。當(dāng)一個(gè)PCR有多對引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)3'末端都不能和其他任何引物互補(bǔ)。（4）上下引物的互補(bǔ)性：9（5）解鏈溫度（Tm值）：計(jì)算出來的兩個(gè)引物的Tm值相差不能大于5℃，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般為50-70℃。這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)PCR循環(huán)可有效變性。（5）解鏈溫度（Tm值）：10（6）3’末端3’末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。如果可能的話，每個(gè)引物的3’末端堿基為G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推薦3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。（6）3’末端11當(dāng)末端堿基為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；當(dāng)末端堿基為T時(shí)，錯(cuò)配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，所以一般PCR反應(yīng)中，引物3’末端的堿基最好選T、C、G，而不選A。引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：當(dāng)末端堿基為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；12一些概念有意鏈（Sensestrand），正義鏈（positivestrand），編碼鏈（codingstrand）；無意鏈（anti-sensestrand），負(fù)義鏈（negativestrand），模板鏈（templatestrand）

一些概念有意鏈（Sensestrand），正義鏈（posi13正向引物（forwardprimer）：處于DNA雙鏈上游的引物。如用于測序，則從5’→3’方向讀出DNA正鏈的序列。反向引物（Reverseprimer）：處于目的DNA雙鏈下游的引物。如用于測序，則讀出DNA負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。

正向引物（forwardprimer）：處于DNA雙鏈上14

15PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評估的軟件主要界面分為序列編輯窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和MotifPrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物是由加拿16正向（Asis）、反向（reversed）、互補(bǔ)（complemented）及反向互補(bǔ)（reversecomplemented）。正向（Asis）、反向（reversed）、互補(bǔ)（comp17正向（Asis）正向（Asis）18反向（reversed）反向（reversed）19互補(bǔ)（complemented）互補(bǔ)（complemented）20EnzymeEnzyme21軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊Seq或Map，分別以序列或圖示的方式顯示結(jié)果。缺點(diǎn)：不能以文本的形式保存結(jié)果。軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊Seq或Map，分別22Motif

Motif23PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件24PrimerPrimer25點(diǎn)擊Search，進(jìn)行引物搜索點(diǎn)擊Search，進(jìn)行引物搜索26Searchcriteria窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。PrimerLength常設(shè)置在18－30bp,短了特異性不好，長了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Searchcriteria窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。Pr27Manual→Searchparameters→人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Searchstringency應(yīng)選High。GC含量一般是40－60％。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。Manual→Searchparameters→人工搜索28Searchprogress窗口中顯示SearchCompleted→OK鍵Searchprogress窗口中顯示SearchCo29結(jié)果窗口→有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為100。選其中的一對引物，在主窗口顯示結(jié)果。對于上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。搜索出來的引物，按Rating排序，逐個(gè)送Oligo軟件里評估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。引物3端≥2個(gè)A或T,或引物內(nèi)部連續(xù)的G或C太多，或引物3端≥2個(gè)G或C，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。結(jié)果窗口→有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物30該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”和“A”可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度??！第四層：四種重要指標(biāo)的分析該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”和“A”可31引物長度：控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。長的PCR引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級結(jié)構(gòu)。適宜引物長度為18-27nt。Tm融鏈溫度：根據(jù)相鄰二堿基對作用原理來計(jì)算融鏈溫度。PCR反應(yīng)的合適Tm范圍為56-63℃（50-70℃）GC%含量：對于PCR反應(yīng)來說GC含量在50%左右比較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性，盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異性，盡量避免3’末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。

引物長度：控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。長的32BLAST驗(yàn)證引物進(jìn)入http:///BLAST/,點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)BLAST驗(yàn)證引物進(jìn)入http://www.ncbi.n33在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：例：引物為5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5’→3’。輸入上游引物后，加上≥20個(gè)字母n，再輸入下游引物。在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：34在ChooseSearchSet欄中：Database根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選Humangenomic+transcript或Others在ChooseSearchSet欄中：Database根35在ProgramSelection中：選擇Somewhatsimilarsequences(blastn)項(xiàng)，如下圖：在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithmparameters參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。在ProgramSelection中：選擇Somewhat36在GeneralParameters中：Expectthresshold期望閾值須改為1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框?qū)?shù)字改為7。在GeneralParameters中：Expectth37圖中：序列與引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游引物，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并與下游引物互補(bǔ)（Strand=Plus/Minus），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。圖中：序列與引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-38Accession，數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序列的信息Desscription序列的簡單描述高的就是有兩線段間有連線的代表隨機(jī)匹配的可能性。E值接近零時(shí)最有意義，也就是說序列完全匹配了。Accession，數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序39比對到的序列長度E值越小為好！！匹配上的堿基數(shù)占總序列長度的比例缺失或插入，用“-”來表示Query1、2表示輸入的兩對引物，Sbjct表示在庫里比對的序列PrimerBLAST的詳細(xì)結(jié)果比對到的序列長度E值越小為好?。∑ヅ渖系膲A基數(shù)占總序列長度的40ncbi在線primer設(shè)計(jì)ncbi在線primer設(shè)計(jì)41默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。

默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你42PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件43PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件44PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件45用Oligo軟件設(shè)計(jì)/評估PCR引物啟動Oligo，選擇File→open，打開要進(jìn)行引物分析的序列。用Oligo軟件設(shè)計(jì)/評估PCR引物啟動Oligo，選擇Fi46圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：Tm值、ΔG和Frequencies。退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的主窗口，其他兩個(gè)具有輔助作用。圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：Tm值、ΔG和Frequencies。47因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動窗口的Cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為Tile方式。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動窗口的Cascade排列方式不48用Tile方式顯示窗口用Tile方式顯示窗口49Tm，退火溫度窗口Tm值曲線以選取72℃附近為佳；5’到3’端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。圈出來的序列部分及黃色的bar即代表當(dāng)前分析的21個(gè)堿基的Tm值可點(diǎn)擊窗口的左下角的Upper、Lower按鈕選擇上游引物、下游引物。Tm，退火溫度窗口Tm值曲線以選取72℃附近為佳；圈出來的序50Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了51顯示了裝載的整個(gè)序列的6-7mers寡核苷酸順序的相對頻率。寡核苷酸的3'端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫（GenBank的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。

Frequencies，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為3'末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物（比如整個(gè)基因組DNA）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性PCR產(chǎn)物的形成。

顯示了裝載的整個(gè)序列的6-7mers寡核苷酸順序的相對頻52平均頻率為1000的話，CTTGGC的頻率為1500以上，而TTGGCG德頻率很低，約300。平均頻率為1000的話，CTTGGC的頻率為1500以上，而53ΔG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性(五聚體的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；最好引物的ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低。ΔG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性(五聚54在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以自由能ΔG表示。第二個(gè)核苷酸第一個(gè)（5’）核苷酸例子：雙鏈d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以55顯示了3’末端序列ΔG值較低，適合引發(fā)。3’末端序列ΔG太高。顯示了3’末端序列ΔG值較低，適合引發(fā)。3’末端序列ΔG太高56你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此時(shí)，點(diǎn)擊Uper，上游引物即可顯示。同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物。對你設(shè)計(jì)的引物質(zhì)量進(jìn)一步分析。你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此57同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物。同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物58參數(shù)設(shè)置與搜索選擇search→forprimersandprobes，進(jìn)行如右圖設(shè)置。點(diǎn)擊searchranges，設(shè)置引物范圍和PCR產(chǎn)物的大小點(diǎn)擊parameters，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上。同時(shí)選compatiblepairs默認(rèn)下，對引物的要求：無二聚體、3’高度特異、GC%含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。參數(shù)設(shè)置與搜索選擇search→forprimersan59引物的長度及產(chǎn)物的長度設(shè)置。PrimerLength設(shè)置在18－30bp,短了特異性不好，長了沒有必要;PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊。上限沒有太多的限定。引物的長度及產(chǎn)物的長度設(shè)置。PrimerLength設(shè)置在60普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)從高到低六個(gè)等級的設(shè)定，最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)對軟件功能不了解時(shí)，應(yīng)選veryhigh/High。選automaticallychangestring后，搜索引物時(shí)，如果在高等級設(shè)定中無法搜索到引物對時(shí)自動降級一個(gè)等級來搜索，直到找到為止。反向引物時(shí)用普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)從高到低六個(gè)等級的設(shè)定，最后有一個(gè)用61讓引物的長度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE（primeEfficeince）值（引發(fā)效率）。可以限定所選引物對的最大數(shù)目。讓引物的長度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE（prime62實(shí)際上需要我們改動的只有引物的長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動。其他的參數(shù)就使用Oligo默認(rèn)值，一般無需改動。實(shí)際上需要我們改動的只有引物的長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動。63直接使用Oligo默認(rèn)值，一般也無需改變。直接使用Oligo默認(rèn)值，一般也無需改變。64參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OK，程序即進(jìn)行引物搜索。參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OK，程序即進(jìn)行引物搜索。65引物搜索結(jié)果如入：Oligo提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫度、GC含量等的排列方式。引物搜索結(jié)果如入：66Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。選擇其中的一對引物，這時(shí)程序自動彈出一個(gè)PCR分析窗口。Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了67PCRoptimalannealingtemperature

（最佳退火溫度）數(shù)值得參考。在PCR摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范圍就可以了。產(chǎn)物Tm值與引物Tm值（低的那個(gè)）的差異，一般控制在20度以內(nèi)。引物間Tm值的差異，一般控制在5-6度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度PCRoptimalannealingtemperatu68在Analyze菜單中，Oligo提供了眾多分析功能。選擇相應(yīng)的功能，分析結(jié)果。在Analyze菜單中，Oligo提供了眾多分析功能。選69點(diǎn)擊Selectedprimers，會給出兩條引物的概括性信息;其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計(jì)算，會比Primer5中引物的Tm值略高;引物的DeltaG和3’端的DeltaG:3’端的DeltaG過高，會在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對值應(yīng)該小一些，最好不要超過9。KeyInfo點(diǎn)擊Selectedprimers，會給出兩條引物的概括性70Duplexformation，引物二聚體引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素→應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其ΔG值應(yīng)該偏低→由退火溫度決定，50°的退火溫度和65°對二聚體的影響肯定不一樣。Themoststable3’-Dimer

DeltaG絕對值一般不要超過4.5kcal/mol?！鱃絕對值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合堿基對不要超過3個(gè)。themoststableDimeroverall絕對值一般應(yīng)小于多少kcal/mol跟PCR退火溫度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明在PCR退火溫度65°時(shí)，6.7kcal/mol沒有問題。Duplexformation，引物二聚體引物二聚體是影71Hairpinformation，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)DeltaG絕對值一般不要超過4.5kcal/mol。結(jié)合堿基對不要超過3個(gè)。特定的發(fā)夾如果沒有顯示Tm值，那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成。Hairpinformation，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)Delta72結(jié)合堿基對已經(jīng)超過3個(gè)。結(jié)合堿基對已經(jīng)超過3個(gè)。73在3’形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)量。在3’形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)引74CompositionandTm上下游引物的GC％控制在40％～60％。最后一種是Primer5所采用的方法。TdisanormalizedTmin1MsaltconditionstheTmisavariablevalue,thatdependsonsaltandDNAconcentrationsetintheSearchParameterswindowTm值高時(shí)錯(cuò)配很少，特異性強(qiáng)。CompositionandTm上下游引物的GC％控制在75Falseprimingsites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)oligo會給正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率。一般的原則：使誤引發(fā)效率控制在100以下。有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400～500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。Primer的primingefficiency應(yīng)該是錯(cuò)配地方的4倍左右，更多當(dāng)然更好。Falseprimingsites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)olig76下游引物對于負(fù)鏈，沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。下游引物對于負(fù)鏈，沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。77SelectedOligoSelectedOligo78Primerpairs系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對。Primerpairs系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對。79internalstabilityInternalstability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3端不要過于穩(wěn)定。引物3端過于穩(wěn)定，很容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。internalstabilityInternalst80上游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到上游引物處。上游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到上游引物處。81對應(yīng)的下游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到下游引物處。對應(yīng)的下游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到下游引物處。82Hybridizationtime，雜交時(shí)間該窗口顯示了不同長度、不同濃度的寡核苷酸的雜交時(shí)間

Hybridizationtime，雜交時(shí)間該窗口顯示了不83Concentration您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地實(shí)現(xiàn)對你地引物、PCR產(chǎn)物、DNA模版鏈即時(shí)的濃度、體積、OD值、分子量的轉(zhuǎn)換。該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的時(shí)間保存計(jì)算器。Concentration您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地實(shí)現(xiàn)對你84Oligo不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文本的形式保存。在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇File→dataAs，把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。Oligo不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文本的形式85文本保存的結(jié)果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度文本保存的結(jié)果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度86Primerpremier5設(shè)計(jì)引物→Oligo引物評估

舉例說明：ncbi里查找基因LIF的mRNA序列，用FASTA格式直接保存改基因的CDS區(qū)序列。Primerpremier5設(shè)計(jì)引物→Oligo引物評估87上游引物上游引物88下游引物下游引物89可以看出，Oligo對引物進(jìn)行了非常全面的分析，為選擇最佳的引物提供了參考。Oligo不僅能對所搜索的引物進(jìn)行全面分析，還能對任意的寡核苷酸進(jìn)行分析。選擇File→newsequence，在出現(xiàn)的窗口中輸入要分析的寡核苷酸序列，完畢后按回車鍵或選擇Accept/Discard→Accept?？梢钥闯觯琌ligo對引物進(jìn)行了非常全面的分析，為選擇最佳的90溫馨小提示：當(dāng)你驗(yàn)證引物時(shí)，不要如圖似的把引物序列直接黏貼。此處，應(yīng)該把模板序列輸進(jìn)去。溫馨小提示：當(dāng)你驗(yàn)證引物時(shí)，不要如圖似的把引物序列直接黏貼。91editnewsequence里用鍵盤輸入上游引物的模板序列（A），選擇Accept/Discard→Accept。輸入S或dsDNA是錯(cuò)誤的。editnewsequence里用鍵盤輸入上游引物的模92注意：看到的序列是模板，而不是需要驗(yàn)證的引物。注意：看到的序列是模板，而不是需要驗(yàn)證的引物。93PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件94看：上游引物已經(jīng)顯示了！顯示的是方框/當(dāng)前序列的位置也可以這樣操作：方框定位到288，點(diǎn)擊Upper，即可顯示上游引物。錯(cuò)誤！當(dāng)方框短于引物時(shí)，可改變當(dāng)前序列長度看：上游引物已經(jīng)顯示了！顯示的是方框/當(dāng)前序列的位置也可以這95PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件96下游引物也顯示了！引物序列長度不同于當(dāng)前的引物，從“Change”菜單中改變當(dāng)前的引物長度！引物輸入完畢，接下來分析各個(gè)參數(shù)下游引物也顯示了！引物序列長度不同于當(dāng)前的引物，從“Chan97PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件98上下引物3’末端沒有二聚體產(chǎn)生。Primerpremier5Oligo上下引物間產(chǎn)生的二聚體，ΔG絕對值應(yīng)小于4.5值。上下引物3’末端沒有二聚體產(chǎn)生。Primerpremier99Primerpremier5Oligo上引物內(nèi)部形成的二聚體。ΔG絕對值大于9，有點(diǎn)不能接受，而且核苷酸為4個(gè)。Primerpremier5Oligo上引物內(nèi)部形成的二100Primerpremier5Oligo下引物內(nèi)部形成的二聚體。ΔG絕對值小于4.5，可以接受，最佳退火溫度時(shí)可以忽略。Primerpremier5Oligo下引物內(nèi)部形成的二101OligoPrimerpremier5上引物內(nèi)部形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ΔG絕對值小于4.5，可以接受。下引物內(nèi)部沒有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。OligoPrimerpremier5上引物內(nèi)部形成的發(fā)102FalsePrimingSites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有分析，但不如oligo詳細(xì)。Primerpremier5注意：此處，引物在非特異位點(diǎn)進(jìn)行引發(fā)，錯(cuò)誤引發(fā)。FalsePrimingSites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在P103Primerpremier5Primerpremier5104上下引物內(nèi)部穩(wěn)定性分析上下引物內(nèi)部穩(wěn)定性分析105上引物6-mers出現(xiàn)頻率分析上引物6-mers出現(xiàn)頻率分析106下引物6-mers出現(xiàn)頻率分析下引物6-mers出現(xiàn)頻率分析107PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理108PCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成：①模板的熱變性；②引物復(fù)性到單鏈模板上；③熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的延伸PCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成：①模板的熱變性；②引物復(fù)性109PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件110變性在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，變性溫度在94-95℃下進(jìn)行，這也是TaqDNA聚合酶進(jìn)行30個(gè)或30個(gè)以上PCR循環(huán)而活力不受到過多損失時(shí)能耐受的最高溫度。有時(shí)把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為5min，以便大分子模板DNA徹底變性的概率。對于GC含量為55%或更低的線性DNA模板，推薦PCR的變性條件是94-95℃變性45s。變性在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，變性溫度111復(fù)性溫度（退火溫度）至關(guān)重要?。?！退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率會非常低；退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增；退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的Tm值低3-5℃下進(jìn)行。最好通過對復(fù)性溫度比兩條引物的Tm值低2-10℃內(nèi)進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對復(fù)性條件的優(yōu)化。引物和模板DNA的復(fù)性復(fù)性溫度（退火溫度）至關(guān)重要?。?！引物和模板DNA的復(fù)性112對TaqDNA聚合酶來說，最適溫度為72-78℃，時(shí)間約為1min。引物的延伸與循環(huán)數(shù)目哺乳動物DNA為模板時(shí)，至少進(jìn)行25個(gè)循環(huán)才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為30-33個(gè)循環(huán)。對TaqDNA聚合酶來說，最適溫度為72-78℃，時(shí)113引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1）堿基組成：GC含量應(yīng)在40%-60%（45%-55%）之間，4中堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，沒有二核苷酸重復(fù)序列，如GCGCGC等；（2）引物長度：引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為18-25個(gè)核苷酸長度，上下引物長度差別不能大于3bp，如上游引物為19bp，下游引物為24bp等。引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1）堿基組成：114（3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會阻止引物和模板之間的復(fù)性。（3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：115（4）上下引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3'末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，因?yàn)镻CR中引物濃度較高，會形成引物二聚體。當(dāng)一個(gè)PCR有多對引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)3'末端都不能和其他任何引物互補(bǔ)。（4）上下引物的互補(bǔ)性：116（5）解鏈溫度（Tm值）：計(jì)算出來的兩個(gè)引物的Tm值相差不能大于5℃，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般為50-70℃。這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)PCR循環(huán)可有效變性。（5）解鏈溫度（Tm值）：117（6）3’末端3’末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。如果可能的話，每個(gè)引物的3’末端堿基為G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推薦3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。（6）3’末端118當(dāng)末端堿基為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；當(dāng)末端堿基為T時(shí)，錯(cuò)配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，所以一般PCR反應(yīng)中，引物3’末端的堿基最好選T、C、G，而不選A。引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：當(dāng)末端堿基為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；119一些概念有意鏈（Sensestrand），正義鏈（positivestrand），編碼鏈（codingstrand）；無意鏈（anti-sensestrand），負(fù)義鏈（negativestrand），模板鏈（templatestrand）

一些概念有意鏈（Sensestrand），正義鏈（posi120正向引物（forwardprimer）：處于DNA雙鏈上游的引物。如用于測序，則從5’→3’方向讀出DNA正鏈的序列。反向引物（Reverseprimer）：處于目的DNA雙鏈下游的引物。如用于測序，則讀出DNA負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。

正向引物（forwardprimer）：處于DNA雙鏈上121

122PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評估的軟件主要界面分為序列編輯窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和MotifPrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物是由加拿123正向（Asis）、反向（reversed）、互補(bǔ)（complemented）及反向互補(bǔ)（reversecomplemented）。正向（Asis）、反向（reversed）、互補(bǔ)（comp124正向（Asis）正向（Asis）125反向（reversed）反向（reversed）126互補(bǔ)（complemented）互補(bǔ)（complemented）127EnzymeEnzyme128軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊Seq或Map，分別以序列或圖示的方式顯示結(jié)果。缺點(diǎn)：不能以文本的形式保存結(jié)果。軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊Seq或Map，分別129Motif

Motif130PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件131PrimerPrimer132點(diǎn)擊Search，進(jìn)行引物搜索點(diǎn)擊Search，進(jìn)行引物搜索133Searchcriteria窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。PrimerLength常設(shè)置在18－30bp,短了特異性不好，長了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Searchcriteria窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。Pr134Manual→Searchparameters→人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Searchstringency應(yīng)選High。GC含量一般是40－60％。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。Manual→Searchparameters→人工搜索135Searchprogress窗口中顯示SearchCompleted→OK鍵Searchprogress窗口中顯示SearchCo136結(jié)果窗口→有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為100。選其中的一對引物，在主窗口顯示結(jié)果。對于上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。搜索出來的引物，按Rating排序，逐個(gè)送Oligo軟件里評估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。引物3端≥2個(gè)A或T,或引物內(nèi)部連續(xù)的G或C太多，或引物3端≥2個(gè)G或C，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。結(jié)果窗口→有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物137該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”和“A”可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度?。〉谒膶樱核姆N重要指標(biāo)的分析該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”和“A”可138引物長度：控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。長的PCR引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級結(jié)構(gòu)。適宜引物長度為18-27nt。Tm融鏈溫度：根據(jù)相鄰二堿基對作用原理來計(jì)算融鏈溫度。PCR反應(yīng)的合適Tm范圍為56-63℃（50-70℃）GC%含量：對于PCR反應(yīng)來說GC含量在50%左右比較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性，盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異性，盡量避免3’末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。

引物長度：控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。長的139BLAST驗(yàn)證引物進(jìn)入http:///BLAST/,點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)BLAST驗(yàn)證引物進(jìn)入http://www.ncbi.n140在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：例：引物為5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5’→3’。輸入上游引物后，加上≥20個(gè)字母n，再輸入下游引物。在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：141在ChooseSearchSet欄中：Database根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選Humangenomic+transcript或Others在ChooseSearchSet欄中：Database根142在ProgramSelection中：選擇Somewhatsimilarsequences(blastn)項(xiàng)，如下圖：在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithmparameters參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。在ProgramSelection中：選擇Somewhat143在GeneralParameters中：Expectthresshold期望閾值須改為1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框?qū)?shù)字改為7。在GeneralParameters中：Expectth144圖中：序列與引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游引物，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并與下游引物互補(bǔ)（Strand=Plus/Minus），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。圖中：序列與引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-145Accession，數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序列的信息Desscription序列的簡單描述高的就是有兩線段間有連線的代表隨機(jī)匹配的可能性。E值接近零時(shí)最有意義，也就是說序列完全匹配了。Accession，數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序146比對到的序列長度E值越小為好?。∑ヅ渖系膲A基數(shù)占總序列長度的比例缺失或插入，用“-”來表示Query1、2表示輸入的兩對引物，Sbjct表示在庫里比對的序列PrimerBLAST的詳細(xì)結(jié)果比對到的序列長度E值越小為好??！匹配上的堿基數(shù)占總序列長度的147ncbi在線primer設(shè)計(jì)ncbi在線primer設(shè)計(jì)148默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。

默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你149PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件150PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件151PCR引物設(shè)計(jì)原理剖析課件152用Oligo軟件設(shè)計(jì)/評估PCR引物啟動Oligo，選擇File→open，打開要進(jìn)行引物分析的序列。用Oligo軟件設(shè)計(jì)/評估PCR引物啟動Oligo，選擇Fi153圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：Tm值、ΔG和Frequencies。退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的主窗口，其他兩個(gè)具有輔助作用。圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：Tm值、ΔG和Frequencies。154因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動窗口的Cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為Tile方式。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動窗口的Cascade排列方式不155用Tile方式顯示窗口用Tile方式顯示窗口156Tm，退火溫度窗口Tm值曲線以選取72℃附近為佳；5’到3’端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。圈出來的序列部分及黃色的bar即代表當(dāng)前分析的21個(gè)堿基的Tm值可點(diǎn)擊窗口的左下角的Upper、Lower按鈕選擇上游引物、下游引物。Tm，退火溫度窗口Tm值曲線以選取72℃附近為佳；圈出來的序157Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了158顯示了裝載的整個(gè)序列的6-7mers寡核苷酸順序的相對頻率。寡核苷酸的3'端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫（GenBank的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。

Frequencies，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為3'末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物（比如整個(gè)基因組DNA）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性PCR產(chǎn)物的形成。

顯示了裝載的整個(gè)序列的6-7mers寡核苷酸順序的相對頻159平均頻率為1000的話，CTTGGC的頻率為1500以上，而TTGGCG德頻率很低，約300。平均頻率為1000的話，CTTGGC的頻率為1500以上，而160ΔG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性(五聚體的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；最好引物的ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低。ΔG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性(五聚161在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以自由能ΔG表示。第二個(gè)核苷酸第一個(gè)（5’）核苷酸例子：雙鏈d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以162顯示了3’末端序列ΔG值較低，適合引發(fā)。3’末端序列ΔG太高。顯示了3’末端序列ΔG值較低，適合引發(fā)。3’末端序列ΔG太高163你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此時(shí)，點(diǎn)擊Uper，上游引物即可顯示。同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物。對你設(shè)計(jì)的引物質(zhì)量進(jìn)一步分析。你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此164同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物。同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物165參數(shù)設(shè)置與搜索選擇search→forprimersandprobes，進(jìn)行如右圖設(shè)置。點(diǎn)擊searchranges，設(shè)置引物范圍和PCR產(chǎn)物的大小點(diǎn)擊parameters，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上。同時(shí)選compatiblepairs默認(rèn)下，對引物的要求：無二聚體、3’高度特異、GC%含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。參數(shù)設(shè)置與搜索選擇search→forprimersan166引物的長度及產(chǎn)物的長度設(shè)置。PrimerLength設(shè)置在18－30bp,短了特異性不好，長了沒有必要;PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊。上限沒有太多的限定。引物的長度及產(chǎn)物的長度設(shè)置。PrimerLength設(shè)置在167普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)從高到低六個(gè)等級的設(shè)定，最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)對軟件功能不了解時(shí)，應(yīng)選veryhigh/High。選automaticallychangestring后，搜索引物時(shí)，如果在高等級設(shè)定中無法搜索到引物對時(shí)自動降級一個(gè)等級來搜索，直到找到為止。反向引物時(shí)用普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)從高到低六個(gè)等級的設(shè)定，最后有一個(gè)用168讓引物的長度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE（primeEfficeince）值（引發(fā)效率）?？梢韵薅ㄋx引物對的最大數(shù)目。讓引物的長度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE（prime169實(shí)際上需要我們改動的只有引物的長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動。其他的參數(shù)就使用Oligo默認(rèn)值，一般無需改動。實(shí)際上需要我們改動的只有引物的長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動。170直接使用Oligo默認(rèn)值，一般也無需改變。直接使用Oligo默認(rèn)值，一般也無需改變。171參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OK，程序即進(jìn)行引物搜索。參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OK，程序即進(jìn)行引物搜索。172引物搜索結(jié)果如入：Oligo提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫度、GC含量等的排列方式。引物搜索結(jié)果如入：173Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。選擇其中的一對引物，這時(shí)程序自動彈出一個(gè)PCR分析窗口。Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了174PCRoptimalannealingtemperature

（最佳退火溫度）數(shù)值得參考。在PCR摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范圍就可以了。產(chǎn)物Tm值與引物Tm值（低的那個(gè)）的差異，一般控制在20度以內(nèi)。引物間Tm值的差異，一般控制在5-6度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度PCRoptimalannealingtemperatu175在Analyze菜單中，Oligo提供了眾多分析功能。選擇相應(yīng)的功能，分析結(jié)果。在Analyze菜單中，Oligo提供了眾多分析功能。選176點(diǎn)擊Selectedprimers，會給出兩條引物的概括性信息;其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計(jì)算，會比Primer5中引物的Tm值略高;引物的DeltaG和3’端的DeltaG:3’端的DeltaG過高，會在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對值應(yīng)該小一些，最好不要超過9。KeyInfo點(diǎn)擊Selectedprimers，會給出兩條引物的概括性177Duplexformation，引物二聚體引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素→應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其ΔG值應(yīng)該偏低→由退火溫度決定，50°的退火溫度和65°對二聚體的影響肯定不一樣。Themoststable3’-Dimer

DeltaG絕對值一般不要超過4.5kcal/mol?！鱃絕對值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合堿基對不要超過3個(gè)。themoststableDimeroverall絕對值一般應(yīng)小于多少kcal/mol跟PCR退火溫度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明在PCR退火溫度65°時(shí)，6.7kcal/mol沒有問題。Duplexformation，引物二聚體引物二聚體是影178Hairpinformation，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)DeltaG絕對值一般不要超過4.5kcal/mol。結(jié)合堿基對不要超過3個(gè)。特定的發(fā)夾如果沒有顯示Tm值，那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成。Hairpinformation，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)Delta179結(jié)合堿基對已經(jīng)超過3個(gè)。結(jié)合堿基對已經(jīng)超過3個(gè)。180在3’形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)量。在3’形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)引181CompositionandTm上下游引物的GC％控制在40％～60％。最后一種是Primer5所采用的方法。TdisanormalizedTmin1MsaltconditionstheTmisavariablevalue,thatdependsonsaltandDNAconcentrationsetintheSearchParameterswindowTm值高時(shí)錯(cuò)配很少，特異性強(qiáng)。CompositionandTm上下游引物的GC％控制在182Falseprimingsites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)oligo會給正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率。一般的原則：使誤引發(fā)效率控制在100以下。有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400～500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。Primer的primingefficiency應(yīng)該是錯(cuò)配地方的4倍左右，更多當(dāng)然更好。Falsepr