生物樣品前處理詳解

生物樣品前處理詳解演示文稿第一頁，共二十七頁。優(yōu)選生物樣品前處理第二頁，共二十七頁。第一節(jié)樣品分離的預(yù)提取第二節(jié)細(xì)胞的破碎與分離第一章緒論3第二章生物樣品前處理第三頁，共二十七頁。第一節(jié)樣品分離的預(yù)提?。ㄇ疤幚恚┣疤幚淼哪康模簩δ繕?biāo)組分進(jìn)行初步富集，對干擾成分進(jìn)行去除；

2.1.1概述預(yù)處理材料的種類和特點(diǎn)

動物細(xì)胞反應(yīng)液植物細(xì)胞反應(yīng)液微生物細(xì)胞反應(yīng)液植物組織提取液動物組織提取液“發(fā)酵液”“產(chǎn)物”，胞內(nèi)or胞外？組織4第二章生物樣品前處理第四頁，共二十七頁。2.1.2植物組織提取物的制備植物組織材料來源部位不同，前處理方法不同。葉片、根、莖——清洗去泥沙、灰塵等雜質(zhì)（-4°C——-30°C低溫保存?zhèn)溆茫?；種子（大豆、蓮子）、中藥提取的原材料等——泡漲，粉碎。5第二章生物樣品前處理第五頁，共二十七頁。一些酶必須從富含酚、多酚的綠葉、水果和其它組織中提取，大量的分類化合物給提取帶來困難。在完整的細(xì)胞組織中，酶和酚類物質(zhì)處于彼此隔離的狀態(tài)，細(xì)胞組織被破壞后，彼此接觸，很容易發(fā)生酶促反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物苯醌和單寧類還會繼續(xù)和酶蛋白質(zhì)反應(yīng)，破壞目的酶的活性。所以要在預(yù)處理階段去除酚類化合物。2.1.2.1植物組織中酶的提取6第二章生物樣品前處理第六頁，共二十七頁。例子：植物組織中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1.步驟：100g新鮮葉片→切成小片（打孔器、切片）→置入提取液中（穩(wěn)定酶活性）→PVPP預(yù)浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）→間歇高速攪拌（充分接觸混勻）→紗布過濾→濾液加入PVPP重復(fù)輕攪（重復(fù)一次）→離心去除PVPP→酶粗提液。7第二章生物樣品前處理第七頁，共二十七頁。2.條件討論低溫（4～5度），器皿、溶液預(yù)冷、操作要快；5～7倍于固形材料的提取液，攪拌不產(chǎn)生氣泡（氣泡不利于酶活穩(wěn)定）；PH6.5~7.0，中性，未知蛋白酶要遠(yuǎn)離等電點(diǎn)；PVPP優(yōu)良，不溶性；PPO抑制劑，DTT、2-ME；蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，劇毒。8第二章生物樣品前處理第八頁，共二十七頁。2.1.2.2多糖提取重要活性多糖步驟：原料→粉碎→醇醚回流脫脂→水提取→粗提液去蛋白策略：Sevag法，蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性TCA法，低濃度的TCA可沉淀蛋白質(zhì)，離心后即可除去蛋白質(zhì)。9第二章生物樣品前處理第九頁，共二十七頁。2.1.2.3細(xì)菌重組蛋白的提取重組蛋白：工程菌可表達(dá)大量的重組目的蛋白，40%總蛋白含量，但易形成包涵體（蛋白質(zhì)以不溶形式包涵在細(xì)胞質(zhì)中）。10第二章生物樣品前處理第十頁，共二十七頁。例：E.coli.中提取重組蛋白1.步驟：酶解菌體細(xì)胞：離心收集菌體→溶菌酶→去核酸（DNaseⅠ）→電泳檢測；清洗包涵體：去除雜蛋白，保證包涵體蛋白不被溶解；溶解包涵體：釋放目的蛋白；目的蛋白再折疊：恢復(fù)活性11第二章生物樣品前處理第十一頁，共二十七頁。第二節(jié)細(xì)胞的破碎與分離微生物代謝產(chǎn)物：胞外產(chǎn)物（氨基酸、細(xì)菌堿性蛋白酶、糖化酶等）胞內(nèi)產(chǎn)物（大多數(shù)蛋白質(zhì)、類脂）微生物代謝產(chǎn)物大多數(shù)分泌到胞外，但有些目標(biāo)產(chǎn)物存在細(xì)胞內(nèi)部。目前重組DNA技術(shù)，表達(dá)的產(chǎn)品（如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素等），都是胞內(nèi)產(chǎn)物。首先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。2.2.1概述12第二章生物樣品前處理第十二頁，共二十七頁。2.2.2常用破碎方法機(jī)械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、X-press法等；對物料的擠壓和剪切作用非機(jī)械法：酶溶法、化學(xué)滲透法、凍融法、干燥法等；13第二章生物樣品前處理第十三頁，共二十七頁。2.2.2.1珠磨法原理：進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑（玻功小珠、石英砂、氧化鋁d<1mm）一起快速攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間互相碰撞、剪切，使細(xì)胞破碎，釋放內(nèi)含物。玻璃珠（石英砂、氧化鋁等研磨劑）+細(xì)胞懸浮液→研磨→釋放胞內(nèi)物14第二章生物樣品前處理第十四頁，共二十七頁。破碎過程產(chǎn)生熱能，要注意熱交換，溫度控制——夾套冷卻，實(shí)驗(yàn)室預(yù)冷器皿；適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞的破碎高破碎率，但難以實(shí)現(xiàn)固液分離，漿狀特點(diǎn)：15第二章生物樣品前處理第十五頁，共二十七頁。高壓勻漿器；細(xì)胞懸浮液受高壓作用→快速從針形閥射出→經(jīng)歷剪切、碰撞、高壓至常壓變化后導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞→釋放胞內(nèi)物2.2.2.2高速勻漿法原理16第二章生物樣品前處理第十六頁，共二十七頁。特點(diǎn)增大壓力和破碎次數(shù)，對于高濃度的細(xì)胞或難破碎的細(xì)胞常采用多次循環(huán)操作的方法30～60Mpa最佳易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌不適合較小的革蘭氏陽性菌（細(xì)胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不適合17第二章生物樣品前處理第十七頁，共二十七頁。2.2.2.3超聲破碎法可聽波（次：地震、海嘯）20~20KHz（超）?？栈F(xiàn)象指超聲波在傳播過程中與組織中的氣核或微氣泡相互作用，使其突然爆破，產(chǎn)生巨大的瞬間壓力，從而改變組織結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象?？栈F(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎工作原理18第二章生物樣品前處理第十八頁，共二十七頁。適應(yīng)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的應(yīng)用（操作簡單、液量損失少，可加冰或加冷水）工作頻率25～130KHz功率正比于破碎效果細(xì)胞濃度低有利于空化泡的形成及爆破，破碎效果好于粘稠液不同的微生物需采用不同的破碎參數(shù)（功率、破碎時間、間隔時間、循環(huán)次數(shù)），G->G+>酵母。易失活物質(zhì)不宜用（超聲波可促使產(chǎn)生一些化學(xué)自由，基因使敏感活性物質(zhì)失活），可加入保護(hù)劑N2、PMSF等特點(diǎn)：19第二章生物樣品前處理第十九頁，共二十七頁。溶菌酶（細(xì)菌），β-3，3-葡聚糖酶，β-1，6-葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鍵內(nèi)切酶，殼多糖酶，細(xì)胞壁溶解酶（復(fù)合酶），酵母。酶有專一性。特點(diǎn)：條件溫和，核酸泄出量少，選擇性釋放產(chǎn)物（可從細(xì)胞不同位置）價格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，最佳條件不易確定；產(chǎn)物抑制的存在：在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖→蛋白酶，葡聚糖→葡聚糖酶2.2.2.4酶溶法外加酶20第二章生物樣品前處理第二十頁，共二十七頁。將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。特點(diǎn)：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)變性。自溶后，細(xì)胞懸浮液粘度上升，過濾速率下降。自溶法21第二章生物樣品前處理第二十一頁，共二十七頁。2.2.2.5化學(xué)滲透法原理：使用某些可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性）的化學(xué)試劑，使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來，稱為化學(xué)滲透法。22第二章生物樣品前處理第二十二頁，共二十七頁。表面活性物質(zhì)：促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞破碎EDTA螯合劑：與結(jié)構(gòu)中ca2+或Mg2+螯合，使其原有結(jié)構(gòu)破壞而破裂有機(jī)溶劑：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高級醇等，能被細(xì)胞壁中的類脂吸收，使胞壁膜溶脹，導(dǎo)致細(xì)胞破碎；變性劑：與水中氫鍵作用，減弱水的極性，使疏水性化合物溶于水23第二章生物樣品前處理第二十三頁，共二十七頁。特點(diǎn)選擇性釋放產(chǎn)物。可使一些較小分子量的溶質(zhì)，如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)。細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。通用性差，某種試劑只能作用于某種特定類型細(xì)胞；時間長、效率低，胞內(nèi)物一般釋放率不超過80%；有些化學(xué)試劑有毒，在其后產(chǎn)物提取精時，需分離除去。24第二章生物樣品前處理第二十四頁，共二十七頁。將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。2.2.2.6反復(fù)凍結(jié)——融化法原理：25第二章生物樣品前處理第二十五頁，共二十七頁。使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥干燥法26第二章生物樣品前處理第二十六頁，共二十七頁。X-pr