家蠶己糖激酶基因進(jìn)化分析及其多轉(zhuǎn)錄本在胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性

本文格式為Word版，下載可任意編輯——家蠶己糖激酶基因進(jìn)化分析及其多轉(zhuǎn)錄本在胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性NDsilkwormeggs>DDsilkwormeggs，inIAsilkwormeggstherelativeexpressionofBmHK-areachedapeakat2hofdevelopment，andreachedapeakat48hofdevelopmentinNDsilkwormeggsandDDsilkwormeggs.Afterthat，itsexpressionwasrapidlydown-regulatedandremainedatalowleveluntil96hofdevelopment;expressionlevelofBmHK-binsilkwormeggsinthreespecieswasasfollows：IAsilkwormeggs>NDsilkwormeggs>DDsilkwormeggs.TherelativeexpressionlevelsofBmHK-binthethreesilkwormeggshadbasicallythesametrend，andtheyallshowedagradualupwardtrendwiththedevelopmenttime.TheexpressionofBmHK-cinthethreesilkwormeggswasgreatlydifferent.Theexpressionlevelinthefirst-layingsilkwormeggswasalreadyhigh，anditincreasedrapidlyafterfertilization.TherelativeexpressionlevelofBmHK-cinthethreesilkwormeggsat72hafterdeve-lopmentincreasedagain;therelativeexpressionofBmHK-dinthethreesilkwormeggsshowedanoveralltrendoffirstincreasingandthendecreasing，andateachtimepointitwasNDsilkwormeggs>IAsilkwormeggs>DDsilkwormeggs，butthepeakofBmHK-dexpressioninIAsilkwormeggsappearedearlierthanDDsilkwormeggsandNDsilkwormeggs.BmHK-aandBmHK-dmainlyplayanimportantroleintheearlyembryonicdevelopmentofthesilkworm（3dafterlayingeggsorsoakinginacid）;althoughBmHK-bisalsoinvolvedintheearlyembryonicdevelopmentofthesilkworm，itisnotthemainsugarmetabolismrelatedenzymes;BmHK-ciscloselyrelatedtotheearlyembryonicdeve-lopmentofthesilkworm，andprovidesenergyforembryonicdevelopmentthroughglycolysis.

Keywords：

Bombyxmori;hexokinase（HK）;transcript;diapause;glycolytic;earlyembryonicdevelopment

0引言

家蠶（Bombyxmori）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，也是鱗翅目的一種重要模式生物（唐芬芬等，2022）。根據(jù)家蠶在自然條件下一年發(fā)生的世代數(shù)，可分為一化性、二化性和多化性品系，而多化性品系又分為有滯育多化性和無滯育多化性（呂鴻聲，1991）。家蠶胚胎滯育發(fā)生時的能量代謝途徑一直被認(rèn)為是透露家蠶滯育調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵（沈張飛等，2022;解鴻青等，2022）。糖酵解是糖代謝的重要方式，也是好多動物組織能量的源頭。己糖激酶（Hexokinase，HK）是糖酵解最先出現(xiàn)的生物酶，能反應(yīng)生成丙酮酸參與三羧酸循環(huán)。HK廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物中，包含4種不同亞型，在進(jìn)化過程中高度保守且與多種生理活動密切相關(guān)。HK能促進(jìn)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，將葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其活性的升高有助于家蠶胚胎發(fā)育，是家蠶發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)理劑（許瑾，2022）。HK在滯育解除過程中還能催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為氨基酸和脂肪等物質(zhì)，產(chǎn)生大量能量，促進(jìn)家蠶胚胎頭部和胸節(jié)的分化。因此，分析HK基因在家蠶胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性，對解析二化性家蠶滯育的生理生化機(jī)制具有重要意義。家蠶滯育是一種十分典型的對光周期和環(huán)境溫度等主動適應(yīng)機(jī)制（卓德干等，2022;張曉燕等，2022），二化性品系蠶卵常溫（25℃）明催青時產(chǎn)下滯育卵，而低溫（20℃以下）暗催青時產(chǎn)下非滯育卵（黃君霆，2022;顧燕燕等，2022）。在家蠶親代胚胎發(fā)生期，特別是器官形成期，環(huán)境條件（高溫柔長光照等）的變化會影響子代蠶卵形成階段蛹期咽下神經(jīng)節(jié)（SG），促使其分泌滯育激素（DH）（Hommaetal.，2022;梁瀚清等，2022）;分泌至血淋巴中的DH與卵巢細(xì)胞上的受體結(jié)合，啟動卵巢中海藻糖酶基因的表達(dá)，促進(jìn)糖元積累，糖元再轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘油，即滯育發(fā)生（黃君霆，2022;Hulletal.，2022;王力剛等，2022）。DH在滯育準(zhǔn)備期通過調(diào)理碳水化合物即糖代謝，為家蠶卵滯育作準(zhǔn)備。糖代謝是生物體內(nèi)廣泛存在的代謝方式，包括由一系列酶促反應(yīng)構(gòu)成的分解代謝和合成代謝，是生命活動的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)（許瑾，2022）。在以家蠶二化性品系制備的滯育卵、非滯育卵及即時浸酸卵中，其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙酮酸激酶（PK）、乙酰膽堿酯酶（AchE）和乳酸脫氫酶（LDH）的活性存在明顯差異（范蘭芬等，2022）。在昆蟲體內(nèi)的能量代謝過程中，HK是糖代謝途徑的限速酶，具有催化己糖磷酸化的作用，生成的葡萄糖-6-磷酸是參與海藻糖合成、糖原合成及糖酵解過程的重要中間代謝產(chǎn)物（王力剛等，2022）。至今，有關(guān)果蠅（Drosophilamelanogaster）、麥紅吸漿蟲（Sitodiplosismosellana）、蔥蠅（Deliaantiqua）及棉鈴蟲（Bombyxmori）等物種的HK基因表達(dá)特征及功能研究已有較多報道。成衛(wèi)寧等（2022）研究說明，在麥紅吸漿蟲解除滯育過程中，其HK活力明顯升高，以促進(jìn)體內(nèi)糖酵解的順利進(jìn)行;郭強(qiáng)等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，蔥蠅的2個HK基因在夏季滯育時具有一致的表達(dá)規(guī)律，但在冬季滯育時浮現(xiàn)出相反的表達(dá)規(guī)律;Lin和Xu（2022）研究說明，HK在棉鈴蟲的滯育和壽命調(diào)理中發(fā)揮重要作用，且非滯育蛹中的HK表達(dá)水平顯著高于滯育蛹。家蠶滯育卵胚胎發(fā)育早期的糖代謝以能量和物質(zhì)貯存為主，而非滯育卵和即時浸酸卵的糖代謝以物質(zhì)分解代謝為主（許瑾等，2022）。大部分真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體是以同一方式剪接出一類mRNA，但也有某些基因的mRNA前體是通過不同剪接方式而形成不同剪接異構(gòu)體（LeeandRio，2022）。通過NCBI（https：//./）檢索到家蠶HK基因（BmHK）存在4個不同轉(zhuǎn)錄本，均由同一基因可變剪接產(chǎn)生，但至今鮮見BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本在家蠶胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性及其影響家蠶滯育作用機(jī)制的研究報道。根據(jù)NCBI檢索到BmHK基因的4個轉(zhuǎn)錄本設(shè)計特異引物，檢測各轉(zhuǎn)錄本在家蠶二化性品系胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性，為深入探究BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能及透露其在家蠶胚胎早期發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試家蠶二化性品系秋豐由XX省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點試驗室保存提供。TRIzon總RNA提取試劑盒、HiFiScriptgDNARemovalRTMasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒及UltraSYBRMixture試劑盒購自XX康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2BmHK基因進(jìn)化分析

從NCBI（https：//./）檢索并下載12種昆蟲的HK氨基酸序列信息（表1），基于HK氨基酸序列相像性，采用MEGA7.0的鄰接法（Neighbor-joiningmethod，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3蠶卵樣品制備

以家蠶二化性品系秋豐活化越年蠶卵（丙2胚胎）為材料，一部分蠶卵采用17℃暗催青，孵化后常規(guī)新鮮桑葉飼養(yǎng)，羽化后蛾區(qū)內(nèi)交配，制備非滯育命運(yùn)卵（Non-diapause-destinedeggs，ND）;另一部分采用25℃明催青，飼養(yǎng)后制備滯育命運(yùn)卵（Diapause-destinedeggs，DD），25℃保護(hù);20h后取一部分DD蠶卵用鹽酸溶液（1.075g/mL）于46℃下浸泡5min，清水漂洗10min后獲得即時浸酸卵（Immediatelyacid-treatedeggs，IA），IA蠶卵從浸酸后計算其發(fā)育時間。IA蠶卵在浸酸前的發(fā)育同DD蠶卵，為滯育發(fā)育;浸酸后蠶卵滯育被打破，胚胎繼續(xù)發(fā)育，類似于ND蠶卵。3種蠶卵分別于發(fā)育0、2、6、12、24、48、72和96h時取樣，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計與合成

從NCBI檢索BmHK基因（LOC101745054）的4個轉(zhuǎn)錄本（XM_004932593.3、XM_021352245.1、XM_004932595.3和XM_004932594.3），以ClustalW（http：//./）進(jìn)行多序列比對分析，篩選出各轉(zhuǎn)錄本的特異片段，采用Primer6.0分別設(shè)計上、下游引物（表2），并委托浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.5總RNA提取及cDNA合成

按TRIzon總RNA提取試劑盒說明提取蠶卵樣品總RNA：稱取100mg不同蠶卵樣品，加200.0μLTRIzon試劑，電動研磨器冰浴研磨30s，4℃下12000r/min離心5min;收集上清液并轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管中，參與800.00μLTRIzon試劑，混勻，室溫靜置5min;參與200.00μL氯仿，強(qiáng)烈振蕩呈乳化狀，靜置5min;4℃下12000r/min離心15min，提防吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管中;參與等體積異丙醇，振蕩混勻，冰浴30min，4℃下12000r/min離心10min;棄上清液，參與75%乙醇，離心后棄上清液，并向沉淀物中參與DEPC水，-80℃保存?zhèn)溆?。?00μL反應(yīng)管中參與16.00μL去RNA酶的ddH2O，4×gDNAwiperMix4.00μL，RNA模板（總RNA）約1μg，42℃孵育2min，除去DNA;然后參與4.00μL5×qRTSuperMixII進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：50℃15min，85℃2min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即為cDNA。

1.6實時熒光定量PCR檢測BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板、Actin3基由于內(nèi)參基因，參照蔣濤（2022）的方法進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系10.00μL：SYBRPrimixExTaq1.00μL，ROXReferenceDye6.00μL，cDNA模板0.50μL，上、下游引物各0.25μL，ddH2O2.00μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min;94℃30s，58℃25s，72℃30s，進(jìn)行45個循環(huán);95℃10s，65℃60s，97℃1min。通過2-△△Ct法換算BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本相對表達(dá)量（Zhuetal.，2022），采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗（Moribeetal.，2022），并以GraphPadPrism6.0制圖。

2結(jié)果與分析

2.1BmHK基因結(jié)構(gòu)

BmHK基因?qū)儆贖SP70-actin家族，存在4個不同的轉(zhuǎn)錄本，其長度分別為4610、4608、2818和1520bp（圖1），依次命名為BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。其中，BmHK-a的編碼區(qū)（CDS）序列為16～1440bp，全長1424bp;BmHK-b的CDS序列為14～1438bp，全長1424bp;BmHK-c的CDS序列為1466～2818bp，全長1352bp;BmHK-d的CDS序列為159～1520bp，全長1361bp。

2.2BmHK基因進(jìn)化分析結(jié)果

由圖2可看出，12種昆蟲的HK氨基酸序列可分為兩大分支，保守性較高;其中，BmHK氨基酸序列（XP_004923503.1）與野桑蠶HK氨基酸序列（XP_028037827.1）和煙草天蛾HK氨基酸序列（XP_030021779.1）聚類在一起，形成一個進(jìn)化分支，說明三者在系統(tǒng)分類上親緣關(guān)系較近，而與菜粉蝶HK氨基酸序列（XP_022112731.1）所在分支的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特性分析結(jié)果

2.3.1BmHK-a表達(dá)特性實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖3）顯示，BmHK-a在IA蠶卵、ND蠶卵和DD蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中（0～96h）整體上呈先升高后降低的表達(dá)變化趨勢，且各時間點均表現(xiàn)為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵。在IA蠶卵中，BmHK-a相對表達(dá)量于發(fā)育2h達(dá)峰值，且在48h內(nèi)均保持高水平，但至發(fā)育48h后快速下調(diào);在ND蠶卵和DD蠶卵中，BmHK-a相對表達(dá)量在發(fā)育2～48h期間均呈漸漸上升趨勢，至發(fā)育48h達(dá)峰值，此后BmHK-a的表達(dá)也快速下調(diào)。至發(fā)育96h，3種蠶卵中的BmHK-a相對表達(dá)量均處于較低水平。說明BmHK-a主要在蠶卵胚胎早期發(fā)育（產(chǎn)卵或浸酸后3d）過程中發(fā)揮重要作用，為胚胎發(fā)育提供能量。

2.3.2BmHK-b表達(dá)特性實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖4）顯示，BmHK-b在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的表達(dá)水平整體上表現(xiàn)為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵。在DD蠶卵中，BmHK-b相對表達(dá)量隨發(fā)育時間的推移呈十分緩慢上升趨勢，但變化差異不明顯;在ND蠶卵中，BmHK-b相對表達(dá)量的變化趨勢與DD蠶卵的基本一致;在IA蠶卵中，BmHK-b的表達(dá)在浸酸處理后72h內(nèi)呈緩慢上調(diào)趨勢，從72h后開始快速上調(diào)，至發(fā)育96h達(dá)峰值。說明BmHK-b參與家蠶胚胎早期發(fā)育過程，但不是主要的糖代謝相關(guān)酶。

2.3.3BmHK-c表達(dá)特性實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，DD蠶卵發(fā)育2h后，BmHK-c相對表達(dá)量快速升高，然后漸漸下降，于發(fā)育24h降至最低值，而后又漸漸上升;在ND蠶卵中，BmHK-c相對表達(dá)量呈上升—下降—上升的變化趨勢，于發(fā)育12h達(dá)峰值，然后迅速下降，至發(fā)育24h達(dá)最低值，之后又呈漸漸上升趨勢;在IA蠶卵中，BmHK-c相對表達(dá)量在浸酸處理后2h快速上升至較高水平，之后下降并穩(wěn)定在較低水平，至發(fā)育72h后再次快速上升。說明BmHK-c與家蠶胚胎早期發(fā)育密切相關(guān)，通過糖酵解為胚胎發(fā)育提供能量。

2.3.4BmHK-d表達(dá)特性實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖6）顯示，BmHK-d在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的相對表達(dá)量整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且各時間點均表現(xiàn)為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵。在DD蠶卵中，BmHK-d相對表達(dá)量在發(fā)育前12h處于較低水平且變化不明顯，然后快速上升，至發(fā)育24h達(dá)峰值，隨后漸漸下降;在ND蠶卵中，BmHK-d表達(dá)水平最高，其相對表達(dá)量在發(fā)育前24h呈漸漸升高趨勢，至發(fā)育24h達(dá)峰值，之后漸漸下降，但仍維持在較高水平;在IA蠶卵中，BmHK-d相對表達(dá)量于發(fā)育12h達(dá)峰值，之后漸漸下降，從發(fā)育72h后快速下降。IA蠶卵中BmHK-d表達(dá)峰值出現(xiàn)的時間早于DD蠶卵和ND蠶卵，可能與IA蠶卵以浸酸后為計時起點有關(guān)，峰值出現(xiàn)時間實際是在產(chǎn)卵后32h。BmHK-d主要在蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但在ND蠶卵發(fā)育48～96h仍有較高水平的穩(wěn)定表達(dá)，可能與ND蠶卵胚胎發(fā)育迅速有關(guān)。

3探討

真核生物mRNA前體剪接是基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的重要步驟，可變剪接廣泛存在于高等生物中（Kimetal.，2022）。人類基因平均含有8個外顯子，所有的基因都能發(fā)生可變剪接，并產(chǎn)生2個以上的mRNA異構(gòu)體（LeeandRio，2022）。已有研究證明，家蠶神經(jīng)肽Orcokinin基因（BmOK）存在選擇性剪接，產(chǎn)生2個轉(zhuǎn)錄本（BmOKA和BmOKB），BmOK參與色素合成調(diào)控，是2種類鶉斑突變體（q-lp和q-lb）形成的主要原因（Wangetal.，2022）;家蠶通過對Bmdsex結(jié)合蛋白的選擇性剪接，而調(diào)控其性別分化（Zhengetal.，2022）。HK在棉鈴蟲滯育中發(fā)揮重要作用，且非滯育蛹中的HK表達(dá)水平顯著高于滯育蛹（LinandXu，2022）。本課題組的前期研究也說明，家蠶非滯育卵和即時浸酸卵中的BmHK表達(dá)水平明顯高于滯育卵（許瑾等，2022）。

由于BmHK基因存在4個不同的轉(zhuǎn)錄本（BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d），為此本研究設(shè)計4個轉(zhuǎn)錄本的特異引物，通過實時熒光定量PCR檢測各轉(zhuǎn)錄本在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的表達(dá)狀況。BmHK-a在DD蠶卵、ND蠶卵和IA蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)模式相像，受精（發(fā)育2h）后的相對表達(dá)量迅速上升，其峰值基本接近且均出現(xiàn)在產(chǎn)卵或浸酸后48h，此后BmHK-a相對表達(dá)量快速下降，至發(fā)育96h達(dá)最低，說明BmHK-a是家蠶胚胎早期發(fā)育過程中HK的主要活性形式。BmHK-b在3種蠶卵中的表達(dá)模式基本一致，在初產(chǎn)蠶卵中已有一定的表達(dá)量，隨著發(fā)育時間的推移，其相對表達(dá)量緩慢上升，說明BmHK-b參與家蠶胚胎早期發(fā)育過程，但不是胚胎早期發(fā)育過程中HK的主要活性形式。IA蠶卵中的BmHK-b相對表達(dá)量隨著發(fā)育時間的推移呈漸漸上升趨