植物組織培養(yǎng)課件

植物組織培養(yǎng)問題解答徐程浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)問題解答1污染

癥狀

污染

癥狀2病毒

植物病毒引起的疾病對農(nóng)業(yè)和園藝都造成了巨大的損失。在組培中，無菌條件下工作尤為重要，將受病毒感染的外植體進(jìn)行微繁培養(yǎng)將產(chǎn)生成千上萬的帶病植株。然而，“無菌”這一術(shù)語并不明確。無菌？不存在，只進(jìn)行一些病毒測試？在對一種病毒進(jìn)行檢測后，植物就可以生產(chǎn)。組培中除掉病毒感染的一個(gè)方法是用分生組織進(jìn)行培養(yǎng)。為了除掉病毒感染首先必須知道植物的哪個(gè)部位感染了病毒。病毒可以分為35個(gè)家族或組。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有700多種。病毒植物病毒引起的疾病對農(nóng)業(yè)和園藝都造成了巨大的損失。3不同病毒的分類不同病毒的分類4病毒的檢測（方法）把病毒接種到宿主上——驗(yàn)證是否引起預(yù)定的疾病。電子顯微鏡——顯示病毒顆粒的大小和形態(tài)特征。

ELISA/血清檢驗(yàn)核酸雜交/PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可以擴(kuò)增病毒DNA特殊片段。這些片段可以通過凝膠電泳進(jìn)行分析。病毒的檢測（方法）把病毒接種到宿主上——驗(yàn)證是否引起預(yù)定的疾5ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

ELISA利用抗體檢測病毒。有很多方法，其原理見下圖。首先病毒結(jié)合到與ELISA盤孔內(nèi)壁表面，然后加入抗病毒的抗體。抗體加入要過量這樣所有的病毒顆粒都與抗體結(jié)合。而后過量的抗體可以洗去。這樣剩下的抗體數(shù)量與病毒是一致的?？贵w又與一種酶相結(jié)合。無色的底物加入孔中。由于酶的作用使這種底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾膹?fù)合物，這可以通過分光光度儀測出。顏色越深，病毒越多。ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

ELISA利用抗體檢測病毒。有6植物組織培養(yǎng)課件7植物組織培養(yǎng)課件8分生組織培養(yǎng)

分生組織培養(yǎng)可以或者也可不與母株的溫?zé)岑煼?>35°C)結(jié)合，在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抗菌劑（如virasol）。分生組織選取得越小，除去某種病毒或細(xì)菌的可能性越大。分生組織培養(yǎng)分生組織培養(yǎng)可以或者也可不與母株的溫?zé)岑煼?9植物組織培養(yǎng)課件10細(xì)菌在培養(yǎng)過程中我們沒有辦法做到與細(xì)菌完全隔絕。有時(shí)細(xì)菌感染的癥狀可以在植株或培養(yǎng)基上觀察到。通常可見的癥狀出現(xiàn)在培養(yǎng)后期，或是在繼代幾次后才出現(xiàn)。它們也可能不完全出現(xiàn)，但在馴化期早期會造成一些困難。并非所有的細(xì)菌都是致病，甚至有些是有益的。細(xì)菌在培養(yǎng)過程中我們沒有辦法做到與細(xì)菌完全隔絕。11組培中常見的一些細(xì)菌農(nóng)桿菌3%桿狀菌13%腸桿菌12%假單胞菌19%乳酸菌11%葡萄球菌26%一般組培過程中上述細(xì)菌出現(xiàn)頻率。組培中常見的一些細(xì)菌農(nóng)桿菌12Symptomsofbacteriainfection

(left:nobacteria;rightcontaminated)Symptomsofbacteriainfection13真菌

真菌感染主要來源是：表面滅菌不充分轉(zhuǎn)移操作過程中的污染真菌孢子隨微小的東西或牧草蟲傳播真菌污染可以輕易地用肉眼觀察到。真菌

真菌感染主要來源是：14

支原體

檢測支原體比較困難，因?yàn)樗鼈儾灰着囵B(yǎng)，所以鑒定也非常不容易。支原體

檢測支原體比較困難，因?yàn)樗鼈儾灰着囵B(yǎng)，所以鑒定也15小型節(jié)肢動物和牧草蟲

很多實(shí)驗(yàn)室都可見到小型的節(jié)肢動物或牧草蟲。這是一個(gè)主要的問題。雖然這是生物是無害的，但它們會傳播真菌孢子及細(xì)菌，從而給培養(yǎng)造成困難小型節(jié)肢動物和牧草蟲很多實(shí)驗(yàn)室都可見到小型的節(jié)肢動物或牧草16mitesmites17thripsthrips18fungalcontaminationbymitesfungalcontaminationbymites19生活史雌性螨把自己黏附在宿主上，并吮吸獲得食物。從那一刻起身體開始生長并且產(chǎn)卵，而后這些卵發(fā)育成胚，直至成蟲。10天以后，新的一代就產(chǎn)生了。最早出生的通常是1個(gè)雄性，然后接著出生約150個(gè)雌性。這些雌性都由這一雄性受孕。這也可以解釋為什么小昆蟲群落會成指數(shù)增長。生活史雌性螨把自己黏附在宿主上，并吮吸獲得食物。從那一刻起20螨螨21一個(gè)培養(yǎng)瓶中可容納幾千個(gè)螨一個(gè)培養(yǎng)瓶中可容納幾千個(gè)螨22肚子充滿卵的雌螨肚子充滿卵的雌螨23aburstfemale,

filledwithoffspringaburstfemale,

filledwitho24如何治療？病毒分生組織培養(yǎng)，延緩生長，溫?zé)岑煼?xì)菌分裂組織培養(yǎng)，抗生素？真菌適當(dāng)殺菌，避免小型節(jié)肢動物及牧草蟲支原體支原體消除劑小型節(jié)肢噴霧殺蟲劑，將器皿置于膠表面動物和牧草蟲如何治療？病毒分生組織培養(yǎng)，延緩生長，溫?zé)岑煼?5抗生素：在植物中沒有專一的抗生素可供使用。所有可得到的抗生素來自于在人類和動物上已經(jīng)適用的。經(jīng)典的抗生素只有對細(xì)菌的抑制效應(yīng)而對植物沒有殺菌劑量的忍耐性。它們可以暫時(shí)抵制細(xì)菌的出現(xiàn)。到目前為止，沒有一種清晰的診斷工具可以檢測外植體不受細(xì)菌污染?？股兀涸谥参镏袥]有專一的抗生素可供使用。所有可得到的抗生26檢測指數(shù)病毒細(xì)菌檢測指數(shù)病毒27細(xì)菌仔細(xì)觀察培養(yǎng)基的基部或許可以找到一些污染的證據(jù)，但對于生長緩慢的細(xì)菌、內(nèi)部寄生植物或不在培養(yǎng)基上生長的那些細(xì)菌，光用肉眼看就不夠了。為了檢測這種不可見的污染，有必要?jiǎng)?chuàng)造有利于真菌生長的環(huán)境。很多細(xì)菌，當(dāng)然不是所有的，轉(zhuǎn)移到兩到三種商業(yè)細(xì)菌培養(yǎng)基上就可以檢測到。為了標(biāo)定指數(shù)，需要把一系列莖的切片接種到液體培養(yǎng)基、瓊脂固化的酵母葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基及AC培養(yǎng)基上，30°C下孵化三周。如果可以看到污染物生長，就可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌學(xué)方法和特定的生化測驗(yàn)如革蘭染色、運(yùn)動性、白明膠酶、氧化酶和氧化/發(fā)酵等進(jìn)行純化。另外，可以選擇使用商業(yè)產(chǎn)品Biolog系統(tǒng)，它檢測碳源利用情況，并可提供24～48h的檢測記錄。然而，通過使用標(biāo)準(zhǔn)化的程序卻沒有檢測到細(xì)菌污染的事實(shí)也不一定就說明培養(yǎng)不受細(xì)菌污染。事實(shí)上，檢測細(xì)菌的大多數(shù)程序是在病原體基礎(chǔ)上開發(fā)的，顯然在組培中還有很多污染沒有被詳細(xì)描述。理論上，還沒有獲得標(biāo)準(zhǔn)的檢測程序。細(xì)菌仔細(xì)觀察培養(yǎng)基的基部或許可以找到一些污染的證據(jù)，但對于生28植物組織培養(yǎng)課件29生態(tài)生理學(xué)

保水能力水分運(yùn)輸

氣體生態(tài)生理學(xué)

保水能力30保水能力

測定葉片隨時(shí)間的失水狀況可以衡量植物的保水能力。圖示表明，與溫室中的植物相比，組培植物保水能力較差。將容器中的相對濕度降到75%，失水曲線的圖形與溫室植物相似。這說明水分控制是由于功能好的氣孔的作用。保水能力測定葉片隨時(shí)間的失水狀況可以衡量植物的保水能力。31植物組織培養(yǎng)課件32水分運(yùn)輸

在組培容器中水分流動非常重要。芽生存依賴的糖的濃度對水分流動不起主要作用，而瓊脂濃度卻起到了主要的作用。瓊脂濃度越高，就有越多的水分經(jīng)芽流向周圍環(huán)境。這些芽就具有較好的保水能力。水分運(yùn)輸

在組培容器中水分流動非常重要。芽生存依賴的糖的濃度33植物組織培養(yǎng)課件34褐化癥狀：分離后外植體或培養(yǎng)基很快轉(zhuǎn)成褐色或黑色。生長受抑制，并且往往組織死亡。那些自然環(huán)境下含有高濃度單寧酸或間苯二酚的品種的生長抑制是嚴(yán)重的，褐化可能受取材時(shí)外植體年齡、污染的存在以及滅菌過程等的影響。褐化癥狀：分離后外植體或培養(yǎng)基很快轉(zhuǎn)成褐色或黑色。生長受抑35ExplantbrowningExplantbrowning36產(chǎn)生褐化的原因

組織變黑是由于含銅的氧化酶（如多酚氧化酶和酪氨酸酶）的作用，當(dāng)組織受損時(shí)可以被釋放或合成，表現(xiàn)出氧化性。不同的組織這些酶的底物不同。酶和底物分別處于細(xì)胞的不同部位，當(dāng)細(xì)胞受損或垂死時(shí)相互結(jié)合。苯酚有一個(gè)重要的屬性是可以調(diào)節(jié)IAA的氧化（生長素保護(hù)劑）。苯酚的毒性可能主要是與蛋白質(zhì)可逆的氫鍵結(jié)合。當(dāng)苯酚氧化形成高活性的苯醌復(fù)合物，然后循環(huán)、聚合或氧化蛋白質(zhì)，不斷形成黑色復(fù)合物，就產(chǎn)生了不可挽回的生長抑制。產(chǎn)生褐化的原因組織變黑是由于含銅的氧化酶（如多酚氧化酶和酪37

38Polyphenolicdeposits(P)containedwithin:

1Nepenthespitchercells2Nepenthesstemcells

3Nepenthesleafcells

4Sarraceniapitchercells

Polyphenolicdeposits(P)cont39挽救措施組織和培養(yǎng)基的褐化通?？梢酝ㄟ^下列方法解決：挽救措施組織和培養(yǎng)基的褐化通常可以通過下列方法解決：40除去已形成的酚復(fù)合物

過濾或驅(qū)散：預(yù)處理：流水沖洗分離后在無菌水中浸泡2～3h轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上（分泌液被瓊脂吸收，濃度增加）[間隔2～3d轉(zhuǎn)移一次，轉(zhuǎn)移5～6次，直到酚氧化終止為止]在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行初始培養(yǎng)活性炭吸附：從培養(yǎng)基中吸收1～5g/L的抑制復(fù)合物，但同時(shí)也吸收其他物質(zhì)（主要是有機(jī)分子）利用PVP吸收：如果被多酚或單寧抑制，蛋白質(zhì)、氨基化合物和聚酰氨可恢復(fù)酶活力。但PVP不是次次靈。除去已形成的酚復(fù)合物

過濾或驅(qū)散：41

修改潛在的氧化還原作用（弱化劑或抗氧化劑）抗氧化劑是一種易于氧化的產(chǎn)品，因而它可以延長酚醌氧化的停滯階段。常用的產(chǎn)品有：抗壞血酸維生素C、檸檬酸、L-半胱氨酸氫氯化物、dithiothreitol、谷胱甘肽、巰基乙醇、[滅菌前或后經(jīng)濾紙過濾]這些復(fù)合物可以單獨(dú)或配合使用。一些抗氧化劑氧化后就變成強(qiáng)的氧化劑，例如抗壞血酸維生素C。所以，將它們加入培養(yǎng)基中長時(shí)間是有害的。修改潛在的氧化還原作用（弱化劑或抗氧化劑）抗氧化劑是一種42植物組織培養(yǎng)課件43酚酶失活（酚氧化酶作用的抑制）

酚氧化酶的作用可以被以下物質(zhì)抑制：

螯合劑：螯合銅離子

diethyldithiocarbamate

dimethyldithiocarbamate酚酶失活（酚氧化酶作用的抑制）

酚氧化酶的作用可以被以下物質(zhì)44降低酚酶活性和底物的可獲得性

在pH為6.5時(shí)，多酚氧化酶活性最高，在低于這個(gè)值時(shí)活性下降降低PGR水平（初始）降低KNO3

用葡萄糖代替蔗糖黑暗[黑暗或低光照]降低酚酶活性和底物的可獲得性

在pH為6.5時(shí)，多酚氧化酶活45BlackeningoftissueBlackeningoftissue46PreventionofblackeningPreventionofblackening47體細(xì)胞變異來自于植物細(xì)胞培養(yǎng)和不定芽的個(gè)體高度變異的現(xiàn)象稱為體細(xì)胞變異。體細(xì)胞克隆變異不限制于，但在愈傷組織再分化時(shí)普遍存在。變異可以是基因型，也可以是表型的。后者在起源上是可遺傳或后生的。典型的遺傳變化有：染色體數(shù)目的變化（加倍或非整倍的），染色體結(jié)構(gòu)變化（顛換、缺失、重復(fù)），DNA序列（堿基突變）。典型的和后生相關(guān)的事件：基因擴(kuò)增、基因甲基化。體細(xì)胞變異來自于植物細(xì)胞培養(yǎng)和不定芽的個(gè)體高度變異的現(xiàn)象稱為48SomoclonalvariationinRhododendronplants

derivedfromadventitious

shootsSomoclonalvariationinRhodod49如果看不出明顯的形態(tài)遺傳變化，就要用其他的方法來檢測。體細(xì)胞克隆變異有利有弊：利：體細(xì)胞克隆變異最可能的益處是植物的改良。體細(xì)胞克隆變異導(dǎo)致產(chǎn)生基因額外的多變性。在離體培養(yǎng)過程中體細(xì)胞突變體的變異使特性大大豐富，包括抗病抗毒性、抗除草劑能力以及對環(huán)境和化學(xué)壓力的忍耐力，以及次生代謝產(chǎn)物的增加。弊：在操作過程中體細(xì)胞變異一個(gè)嚴(yán)重的不足是產(chǎn)品非一致性。在應(yīng)用組培的園藝和林業(yè)中，需要對優(yōu)良的基因型進(jìn)行快速繁殖。如果看不出明顯的形態(tài)遺傳變化，就要用其他的方法來檢測。體細(xì)胞50減少體細(xì)胞變異的方法：為了避免體細(xì)胞變異，可以采用不同的步驟。眾所周知，增加繼代次數(shù)就會增加體細(xì)胞變異的可能性，所以繼代的次數(shù)必須維持在最小。定期從新的外植體引發(fā)克隆可以減少變異。另一個(gè)減少體細(xì)胞克隆變異的方法是培養(yǎng)基中避免使用2,4-D，因?yàn)檫@種激素可以誘導(dǎo)變異。減少體細(xì)胞變異的方法：為了避免體細(xì)胞變異，可以采用不同的步51植物組織培養(yǎng)問題解答徐程浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)問題解答52污染

癥狀

污染

癥狀53病毒

植物病毒引起的疾病對農(nóng)業(yè)和園藝都造成了巨大的損失。在組培中，無菌條件下工作尤為重要，將受病毒感染的外植體進(jìn)行微繁培養(yǎng)將產(chǎn)生成千上萬的帶病植株。然而，“無菌”這一術(shù)語并不明確。無菌？不存在，只進(jìn)行一些病毒測試？在對一種病毒進(jìn)行檢測后，植物就可以生產(chǎn)。組培中除掉病毒感染的一個(gè)方法是用分生組織進(jìn)行培養(yǎng)。為了除掉病毒感染首先必須知道植物的哪個(gè)部位感染了病毒。病毒可以分為35個(gè)家族或組。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有700多種。病毒植物病毒引起的疾病對農(nóng)業(yè)和園藝都造成了巨大的損失。54不同病毒的分類不同病毒的分類55病毒的檢測（方法）把病毒接種到宿主上——驗(yàn)證是否引起預(yù)定的疾病。電子顯微鏡——顯示病毒顆粒的大小和形態(tài)特征。

ELISA/血清檢驗(yàn)核酸雜交/PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可以擴(kuò)增病毒DNA特殊片段。這些片段可以通過凝膠電泳進(jìn)行分析。病毒的檢測（方法）把病毒接種到宿主上——驗(yàn)證是否引起預(yù)定的疾56ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

ELISA利用抗體檢測病毒。有很多方法，其原理見下圖。首先病毒結(jié)合到與ELISA盤孔內(nèi)壁表面，然后加入抗病毒的抗體。抗體加入要過量這樣所有的病毒顆粒都與抗體結(jié)合。而后過量的抗體可以洗去。這樣剩下的抗體數(shù)量與病毒是一致的?？贵w又與一種酶相結(jié)合。無色的底物加入孔中。由于酶的作用使這種底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾膹?fù)合物，這可以通過分光光度儀測出。顏色越深，病毒越多。ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

ELISA利用抗體檢測病毒。有57植物組織培養(yǎng)課件58植物組織培養(yǎng)課件59分生組織培養(yǎng)

分生組織培養(yǎng)可以或者也可不與母株的溫?zé)岑煼?>35°C)結(jié)合，在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抗菌劑（如virasol）。分生組織選取得越小，除去某種病毒或細(xì)菌的可能性越大。分生組織培養(yǎng)分生組織培養(yǎng)可以或者也可不與母株的溫?zé)岑煼?60植物組織培養(yǎng)課件61細(xì)菌在培養(yǎng)過程中我們沒有辦法做到與細(xì)菌完全隔絕。有時(shí)細(xì)菌感染的癥狀可以在植株或培養(yǎng)基上觀察到。通常可見的癥狀出現(xiàn)在培養(yǎng)后期，或是在繼代幾次后才出現(xiàn)。它們也可能不完全出現(xiàn)，但在馴化期早期會造成一些困難。并非所有的細(xì)菌都是致病，甚至有些是有益的。細(xì)菌在培養(yǎng)過程中我們沒有辦法做到與細(xì)菌完全隔絕。62組培中常見的一些細(xì)菌農(nóng)桿菌3%桿狀菌13%腸桿菌12%假單胞菌19%乳酸菌11%葡萄球菌26%一般組培過程中上述細(xì)菌出現(xiàn)頻率。組培中常見的一些細(xì)菌農(nóng)桿菌63Symptomsofbacteriainfection

(left:nobacteria;rightcontaminated)Symptomsofbacteriainfection64真菌

真菌感染主要來源是：表面滅菌不充分轉(zhuǎn)移操作過程中的污染真菌孢子隨微小的東西或牧草蟲傳播真菌污染可以輕易地用肉眼觀察到。真菌

真菌感染主要來源是：65

支原體

檢測支原體比較困難，因?yàn)樗鼈儾灰着囵B(yǎng)，所以鑒定也非常不容易。支原體

檢測支原體比較困難，因?yàn)樗鼈儾灰着囵B(yǎng)，所以鑒定也66小型節(jié)肢動物和牧草蟲

很多實(shí)驗(yàn)室都可見到小型的節(jié)肢動物或牧草蟲。這是一個(gè)主要的問題。雖然這是生物是無害的，但它們會傳播真菌孢子及細(xì)菌，從而給培養(yǎng)造成困難小型節(jié)肢動物和牧草蟲很多實(shí)驗(yàn)室都可見到小型的節(jié)肢動物或牧草67mitesmites68thripsthrips69fungalcontaminationbymitesfungalcontaminationbymites70生活史雌性螨把自己黏附在宿主上，并吮吸獲得食物。從那一刻起身體開始生長并且產(chǎn)卵，而后這些卵發(fā)育成胚，直至成蟲。10天以后，新的一代就產(chǎn)生了。最早出生的通常是1個(gè)雄性，然后接著出生約150個(gè)雌性。這些雌性都由這一雄性受孕。這也可以解釋為什么小昆蟲群落會成指數(shù)增長。生活史雌性螨把自己黏附在宿主上，并吮吸獲得食物。從那一刻起71螨螨72一個(gè)培養(yǎng)瓶中可容納幾千個(gè)螨一個(gè)培養(yǎng)瓶中可容納幾千個(gè)螨73肚子充滿卵的雌螨肚子充滿卵的雌螨74aburstfemale,

filledwithoffspringaburstfemale,

filledwitho75如何治療？病毒分生組織培養(yǎng)，延緩生長，溫?zé)岑煼?xì)菌分裂組織培養(yǎng)，抗生素？真菌適當(dāng)殺菌，避免小型節(jié)肢動物及牧草蟲支原體支原體消除劑小型節(jié)肢噴霧殺蟲劑，將器皿置于膠表面動物和牧草蟲如何治療？病毒分生組織培養(yǎng)，延緩生長，溫?zé)岑煼?6抗生素：在植物中沒有專一的抗生素可供使用。所有可得到的抗生素來自于在人類和動物上已經(jīng)適用的。經(jīng)典的抗生素只有對細(xì)菌的抑制效應(yīng)而對植物沒有殺菌劑量的忍耐性。它們可以暫時(shí)抵制細(xì)菌的出現(xiàn)。到目前為止，沒有一種清晰的診斷工具可以檢測外植體不受細(xì)菌污染?？股兀涸谥参镏袥]有專一的抗生素可供使用。所有可得到的抗生77檢測指數(shù)病毒細(xì)菌檢測指數(shù)病毒78細(xì)菌仔細(xì)觀察培養(yǎng)基的基部或許可以找到一些污染的證據(jù)，但對于生長緩慢的細(xì)菌、內(nèi)部寄生植物或不在培養(yǎng)基上生長的那些細(xì)菌，光用肉眼看就不夠了。為了檢測這種不可見的污染，有必要?jiǎng)?chuàng)造有利于真菌生長的環(huán)境。很多細(xì)菌，當(dāng)然不是所有的，轉(zhuǎn)移到兩到三種商業(yè)細(xì)菌培養(yǎng)基上就可以檢測到。為了標(biāo)定指數(shù)，需要把一系列莖的切片接種到液體培養(yǎng)基、瓊脂固化的酵母葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基及AC培養(yǎng)基上，30°C下孵化三周。如果可以看到污染物生長，就可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌學(xué)方法和特定的生化測驗(yàn)如革蘭染色、運(yùn)動性、白明膠酶、氧化酶和氧化/發(fā)酵等進(jìn)行純化。另外，可以選擇使用商業(yè)產(chǎn)品Biolog系統(tǒng)，它檢測碳源利用情況，并可提供24～48h的檢測記錄。然而，通過使用標(biāo)準(zhǔn)化的程序卻沒有檢測到細(xì)菌污染的事實(shí)也不一定就說明培養(yǎng)不受細(xì)菌污染。事實(shí)上，檢測細(xì)菌的大多數(shù)程序是在病原體基礎(chǔ)上開發(fā)的，顯然在組培中還有很多污染沒有被詳細(xì)描述。理論上，還沒有獲得標(biāo)準(zhǔn)的檢測程序。細(xì)菌仔細(xì)觀察培養(yǎng)基的基部或許可以找到一些污染的證據(jù)，但對于生79植物組織培養(yǎng)課件80生態(tài)生理學(xué)

保水能力水分運(yùn)輸

氣體生態(tài)生理學(xué)

保水能力81保水能力

測定葉片隨時(shí)間的失水狀況可以衡量植物的保水能力。圖示表明，與溫室中的植物相比，組培植物保水能力較差。將容器中的相對濕度降到75%，失水曲線的圖形與溫室植物相似。這說明水分控制是由于功能好的氣孔的作用。保水能力測定葉片隨時(shí)間的失水狀況可以衡量植物的保水能力。82植物組織培養(yǎng)課件83水分運(yùn)輸

在組培容器中水分流動非常重要。芽生存依賴的糖的濃度對水分流動不起主要作用，而瓊脂濃度卻起到了主要的作用。瓊脂濃度越高，就有越多的水分經(jīng)芽流向周圍環(huán)境。這些芽就具有較好的保水能力。水分運(yùn)輸

在組培容器中水分流動非常重要。芽生存依賴的糖的濃度84植物組織培養(yǎng)課件85褐化癥狀：分離后外植體或培養(yǎng)基很快轉(zhuǎn)成褐色或黑色。生長受抑制，并且往往組織死亡。那些自然環(huán)境下含有高濃度單寧酸或間苯二酚的品種的生長抑制是嚴(yán)重的，褐化可能受取材時(shí)外植體年齡、污染的存在以及滅菌過程等的影響。褐化癥狀：分離后外植體或培養(yǎng)基很快轉(zhuǎn)成褐色或黑色。生長受抑86ExplantbrowningExplantbrowning87產(chǎn)生褐化的原因

組織變黑是由于含銅的氧化酶（如多酚氧化酶和酪氨酸酶）的作用，當(dāng)組織受損時(shí)可以被釋放或合成，表現(xiàn)出氧化性。不同的組織這些酶的底物不同。酶和底物分別處于細(xì)胞的不同部位，當(dāng)細(xì)胞受損或垂死時(shí)相互結(jié)合。苯酚有一個(gè)重要的屬性是可以調(diào)節(jié)IAA的氧化（生長素保護(hù)劑）。苯酚的毒性可能主要是與蛋白質(zhì)可逆的氫鍵結(jié)合。當(dāng)苯酚氧化形成高活性的苯醌復(fù)合物，然后循環(huán)、聚合或氧化蛋白質(zhì)，不斷形成黑色復(fù)合物，就產(chǎn)生了不可挽回的生長抑制。產(chǎn)生褐化的原因組織變黑是由于含銅的氧化酶（如多酚氧化酶和酪88

89Polyphenolicdeposits(P)containedwithin:

1Nepenthespitchercells2Nepenthesstemcells

3Nepenthesleafcells

4Sarraceniapitchercells

Polyphenolicdeposits(P)cont90挽救措施組織和培養(yǎng)基的褐化通常可以通過下列方法解決：挽救措施組織和培養(yǎng)基的褐化通?？梢酝ㄟ^下列方法解決：91除去已形成的酚復(fù)合物

過濾或驅(qū)散：預(yù)處理：流水沖洗分離后在無菌水中浸泡2～3h轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上（分泌液被瓊脂吸收，濃度增加）[間隔2～3d轉(zhuǎn)移一次，轉(zhuǎn)移5～6次，直到酚氧化終止為止]在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行初始培養(yǎng)活性炭吸附：從培養(yǎng)基中吸收1～5g/L的抑制復(fù)合物，但同時(shí)也吸收其他物質(zhì)（主要是有機(jī)分子）利用PVP吸收：如果被多酚或單寧抑制，蛋白質(zhì)、氨基化合物和聚酰氨可恢復(fù)酶活力。但PVP不是次次靈。除去已形成的酚復(fù)合物

過濾或驅(qū)散：92

修改潛在的氧化還原作用（弱化劑或抗氧化劑）抗氧化劑是一種易于氧化的產(chǎn)品，因而它可以延長酚醌氧化的停滯階段。常用的產(chǎn)品有：抗壞血酸維生素C、檸檬酸、L-半胱氨酸氫氯化物、dithiothreitol、谷胱甘肽、巰基乙醇、[滅菌前或后經(jīng)濾紙過濾]這些復(fù)合物可以單獨(dú)或配合使用。一些抗氧化劑氧化后就變成強(qiáng)的氧化劑，例如抗壞血酸維生素C。所以，將它們加入培養(yǎng)基中長時(shí)間是有害的。修改潛在的氧化還原作用（弱化劑或抗氧化劑）抗氧化劑是一種