葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測(cè)試劑概述

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測(cè)試劑概述發(fā)布時(shí)間：2022-05-19（原創(chuàng)2022-05-19CMDE中國(guó)器審）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，其主要的功能是產(chǎn)生NADPH。NADPH對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能和形態(tài)具有極為重要的作用。當(dāng)其缺乏時(shí)，紅細(xì)胞極易受到氧化損傷，出現(xiàn)溶血性疾病，表現(xiàn)為黃疸甚至出現(xiàn)核黃疸。蠶豆病是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者在進(jìn)食蠶豆或蠶豆制品后所引發(fā)的急性血管內(nèi)溶血性貧血，臨床表現(xiàn)為皮膚、鞏膜黃染，有些病例出現(xiàn)血紅蛋白尿，有些則有肝腫大現(xiàn)象。蠶豆病多發(fā)于幼兒及兒童，以男性多見(jiàn)。G6PD基因突變是導(dǎo)致該基因缺乏的主要原因，G6PD基因定位于Xq28，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，編碼515個(gè)氨基酸。G6PD缺乏癥屬于X連鎖不完全顯性遺傳，早期的診斷和預(yù)防具有重大意義。

一、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶常用檢測(cè)方法

目前，G6PD常用檢測(cè)方法包括酶學(xué)和基因檢測(cè)兩大類，酶學(xué)檢測(cè)法包括葡萄糖-6-磷酸底物法、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconatedehydrogenase6PGD)比值法、高鐵血紅蛋白還原法、熒光斑點(diǎn)法等；常規(guī)基因檢測(cè)法包括等位基因特異性擴(kuò)增(ARMS)、等位基因寡核苷酸探針雜交(ASO)、錯(cuò)配堿基聚合酶鏈反應(yīng)/限制性內(nèi)切酶圖譜分析等。

二、目前已批準(zhǔn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶產(chǎn)品概況

目前已上市葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測(cè)產(chǎn)品包括檢測(cè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變情況的基因檢測(cè)法以及檢測(cè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶含量及活性的酶學(xué)檢測(cè)法。樣本類型包括血清、全血、新生兒足跟血濾紙干血片等多種類型。

1.基因檢測(cè)方法

已上市基因檢測(cè)產(chǎn)品的方法學(xué)包括熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點(diǎn)雜交法等，用于體外定性檢測(cè)人外周血基因組DNA中的中國(guó)人群常見(jiàn)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變。

2.酶學(xué)檢測(cè)方法

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶活性檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷、價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，已在臨床診斷中被廣泛應(yīng)用。已上市酶學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品的方法學(xué)多為葡萄糖-6-磷酸底物法。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在NADP（氧化型輔酶Ⅱ）存在條件下催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH（還原型輔酶Ⅱ）。在340nm處測(cè)定NADPH的生成速率，即可檢測(cè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。此外還有比值法檢測(cè)試劑，試劑A液用于檢測(cè)G6PD活性，B液用于檢測(cè)6PGD活性，兩者分別在不同的通道內(nèi)檢測(cè)，采用速率法分別檢測(cè)紅細(xì)胞中G6PD與6PGD的活性，反應(yīng)原理均為催化其相應(yīng)的底物反應(yīng)，同時(shí)將NADP還原為NADPH，通過(guò)監(jiān)測(cè)340nm處吸光度上升的速率即可計(jì)算兩者的活性，再計(jì)算兩者的比值，進(jìn)而判斷G6PD是否缺乏。

三、國(guó)際葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測(cè)試劑監(jiān)管概況

WHO于2016年10月發(fā)布了《葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性檢測(cè)體外診斷試劑指導(dǎo)原則》，該指南根據(jù)性別和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性將人群劃分為正常、缺陷和中介（如表1）?，F(xiàn)將該指南對(duì)分析性能評(píng)估的要求概述如下。表1

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性劃分1.適用樣本類型

（1）證明樣本類型的等效性

至少選用25個(gè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、25個(gè)中介樣本和25個(gè)缺陷樣本，證明每種聲稱樣本類型的等效性。

（2）證明聲稱抗凝劑的等效性

至少選用25個(gè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、25個(gè)中介樣本和25個(gè)缺陷樣本，證明每種聲稱抗凝劑的等效性。

2.樣本收集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸

樣本穩(wěn)定性研究應(yīng)考慮到儲(chǔ)存條件（不同溫度下的持續(xù)時(shí)間、濕度變化、溫度限制、凍融循環(huán)），運(yùn)輸條件（如適用），樣本采集和/或轉(zhuǎn)移裝置（包括干血斑濾紙）是否含有抗凝劑、是否可以密封。

3.精密度

重復(fù)性和再現(xiàn)性試驗(yàn)都應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途選用至少1個(gè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、1個(gè)中介樣本和1個(gè)缺陷樣本。所選樣本應(yīng)確保在關(guān)鍵決策點(diǎn)附近、具有良好的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性代表性。必須證明關(guān)鍵決策點(diǎn)附近樣本的精密度。每個(gè)測(cè)試樣本應(yīng)采用三批試劑，進(jìn)行5個(gè)重復(fù)，運(yùn)行3-5次，選擇3個(gè)不同的試驗(yàn)地點(diǎn)，酶學(xué)方法還應(yīng)選用2個(gè)溫度。

4.分析靈敏度

（1）最低檢出限

選擇至少8個(gè)樣本進(jìn)行最低檢出限研究，每個(gè)濃度至少檢測(cè)15次。將95%檢出率的最低酶活性作為最低檢出限。所檢測(cè)樣本的酶活性應(yīng)采用合適的生物學(xué)參考物質(zhì)以及合適的參考方法進(jìn)行校正。

（2）關(guān)鍵決策點(diǎn)性能驗(yàn)證

必須驗(yàn)證試劑區(qū)分葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的能力（如正常、缺陷、中介）。

可以采用不同比例混合葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常和缺陷樣本來(lái)實(shí)現(xiàn)，獲得廣泛的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，從而了解決策點(diǎn)（即缺陷/中介/正常）的性能。應(yīng)測(cè)試至少三對(duì)單獨(dú)試樣的混合物。

（3）測(cè)量范圍和相關(guān)性

定量檢測(cè)試劑必須采用經(jīng)合適生物學(xué)參考物質(zhì)以及合適參考方法進(jìn)行校正的、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性已知的樣本進(jìn)行測(cè)量范圍研究。對(duì)已知G6PD活性樣本的平行試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，還應(yīng)確定定量與適當(dāng)參考試驗(yàn)的相關(guān)性程度。

對(duì)于報(bào)告血紅蛋白濃度或?qū)⒀t蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化作為報(bào)告結(jié)果的一部分的試劑，還必須確定測(cè)定血紅蛋白濃度的定量測(cè)量范圍和相關(guān)程度。

5.分析特異性

特異性研究必須研究假正?；蚣偃毕萁Y(jié)果的可能性，研究可采用自然或人工樣本進(jìn)行。內(nèi)源性干擾物質(zhì)包括：總膽固醇，血脂、膽紅素和蛋白質(zhì)升高樣本，乳酸，乳酸脫氫酶，含銅化合物如氯化銅、硫酸銅，異常高值（54-65%）和異常低值（17-18%），血球壓積，網(wǎng)織紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板升高樣本，瘧疾，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，肺炎，傷寒，鐮狀細(xì)胞貧血，變異血紅蛋白（A、D、E、S、C），貧血，血紅蛋白病，缺鐵，白血病和/或其他紅細(xì)胞疾病，糖尿病。外源性干擾物質(zhì)包括相關(guān)藥物，如抗寄生蟲(chóng)、抗瘧疾、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗結(jié)核藥物、普通非處方抗炎藥物（阿司匹林、撲熱息痛、布洛芬）、乙醇、咖啡因和某些類固醇（醛固酮相關(guān)）。

四、對(duì)我國(guó)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測(cè)試劑審評(píng)的思考

目前已有相關(guān)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)上市，部分處于研發(fā)或計(jì)劃申報(bào)階段。此類產(chǎn)品對(duì)人體樣本中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進(jìn)行檢測(cè)，臨床上主要用于遺傳性紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的輔助診斷，產(chǎn)品臨床風(fēng)險(xiǎn)較高。企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中對(duì)產(chǎn)品的認(rèn)識(shí)程度不一，在參考品設(shè)置、分析性能評(píng)估等方面存在較多問(wèn)題，有必要對(duì)這些共性問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)規(guī)范，為申報(bào)企業(yè)從產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)至注冊(cè)申報(bào)階段提供更為全面的指導(dǎo)，為技術(shù)審評(píng)提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]WHO.Invitrodiagnostic