細胞工程制藥復習課件

第四章

細胞融合與單克隆抗體CellFusionandMonoclonalAntibodies第四章

細胞融合與單克隆抗體1細胞融合單克隆抗體技術細胞融合2第一節(jié)細胞融合一、細胞融合劑二、細胞融合方式三、細胞融合技術四、雜種細胞的篩選第一節(jié)細胞融合3第一節(jié)細胞融合定義：指將不同來源的原生質(zhì)體相融合，并使之分化再生、形成新物種或新品種的過程，又稱為體細胞雜交第一節(jié)細胞融合定義：指將不同來源的原生質(zhì)體相融合，并使之4第一節(jié)細胞融合原理：植物細胞->去細胞壁(酶消化)動物細胞->分散(酶消化)->單個原生質(zhì)體->誘導融合->篩選關鍵：建立細胞橋第一節(jié)細胞融合原理：5一、細胞融合劑

受體作用電荷作用一、細胞融合劑

受體作用電荷作用6二、細胞融合方式完整細胞之間的融合核體、胞質(zhì)體與完整細胞的融合作用微小細胞與完整細胞的融合脂質(zhì)體介導的細胞融合二、細胞融合方式完整細胞之間的融合7三、細胞融合技術生物法（病毒誘導融合）化學法（化學劑誘導融合）物理法（電融合）三、細胞融合技術生物法（病毒誘導融合）8生物法生物法9化學法：聚乙二醇（PEG）

介導的細胞融合原理：①促使細胞凝結(jié)（負電荷作用）②破壞接觸處細胞膜（被洗脫）化學法：聚乙二醇（PEG）

介導的細胞融合原理：10影響因素：

分子量：4000—6000濃度：20—60%（通常：30—50%）pH：偏堿為宜（pH7.4—8.0）其他：二甲亞砜、植物血凝素影響因素：11原理： 細胞在電場中極化成偶極子，并排列成串，然后用高強度、短時程的電脈沖擊穿細胞膜。物理法：

細胞電融合原理：物理法：

細胞電融合12細胞工程制藥復習課件13甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接2）脈沖刺激后30s50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接14注意事項1）介質(zhì)要求高2）控制電壓的強度和時間注意事項1）介質(zhì)要求高15優(yōu)點：融合率高 融合率＝（融合組多核細胞的核數(shù)－對照組多核細胞的核數(shù)/對照組的全部細胞數(shù)）×100％可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可直接挑選雜種細胞優(yōu)點：融合率高16原理：兩種親本細胞融合混合物中可有多種類型細胞，篩選目的是獲得優(yōu)良雜種細胞。四、雜種細胞的篩選原理：四、雜種細胞的篩選17同核體異核體多核體異胞質(zhì)體核質(zhì)體細胞工程制藥復習課件181植物細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法如親本1： 葉綠體缺陷型親本2：光致死型

融合細胞：正常1植物細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法192）抗性互補篩選法如：親本1：放線菌素D＋，MS－親本2：放線菌素D－，MS＋雜種細胞：放線菌素D＋，MS＋而親本和其它細胞死亡2）抗性互補篩選法203）利用物理特性篩選法親本1：異硫氰酸熒光素（FITC）標記親本2：堿性蕊香紅熒光素標記 熒光顯微鏡下，親本1：綠色，親本2：紅色，雜種細胞可以區(qū)分3）利用物理特性篩選法214）利用生長特性篩選法如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞：外源激素融合細胞：內(nèi)源激素4）利用生長特性篩選法22動物細胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)親本A：Amp－，Kan＋親本B：Kan－，Amp＋雜種細胞：Amp＋，Kan＋動物細胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)232）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，親本細胞均死亡。2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)243）溫度敏感突變型親本一：Kan＋，37度親本二：高溫敏感突變型，Kan－雜種細胞能在高溫和含Kan培養(yǎng)基生長。3）溫度敏感突變型25第二節(jié)單克隆抗體一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能二、單克隆抗體的制備和生產(chǎn)三、單克隆抗體的改造和應用第二節(jié)單克隆抗體26細胞工程制藥復習課件27細胞工程制藥復習課件28抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)。一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)。一、抗體的結(jié)構(gòu)與功29二、單克隆抗體的制備雜交瘤技術：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。單克隆抗體(monoclonalantibody，簡稱McAb)：單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子。二、單克隆抗體的制備雜交瘤技術：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞和30單抗的特點1.高度特異性2.高度穩(wěn)定性3.高抗體活性4.不可知性5.過于單一性單抗的特點1.高度特異性31單抗的制備原理1.病毒轉(zhuǎn)化2.細胞雜交單抗的制備原理1.病毒轉(zhuǎn)化32單抗的制備過程1.動物免疫與親本選擇2.細胞融合3.雜交瘤細胞的篩選4.單抗制備和凍存5.單抗純化單抗的制備過程1.動物免疫與親本選擇331.動物免疫與親本選擇1）骨髓瘤細胞一般不分泌抗體能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)為HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。1.動物免疫與親本選擇1）骨髓瘤細胞342）淋巴細胞免疫方法體內(nèi)法體外法2）淋巴細胞352.細胞融合脾細胞和骨髓細胞混勻離心沉淀滴加50%的PEG0.5ml靜置90秒滴加不含血清培液或BSS5－10ml靜置10分鐘2.細胞融合脾細胞和骨髓細胞混勻363.HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞細胞團塊分散，加HAT溶液，稀釋加入有飼細胞的多孔培養(yǎng)板2－3天半量換液，7天后完成3.HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞細胞團塊分散，加HAT溶液，稀37細胞融合的選擇示意圖細胞融合的選擇示意圖381）HAT選擇系統(tǒng)HAT：是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關。DNA合成途徑有兩種。1）HAT選擇系統(tǒng)HAT：是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋39原理：雜交瘤技術中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一，無補救途徑。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了全合成途徑。淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-或TK-親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。原理：402）特異性雜交瘤細胞的篩選可溶性抗原:放射免疫、免疫酶標測定等細胞抗原:免疫熒光、被動血凝實驗、補體依賴的細胞毒等2）特異性雜交瘤細胞的篩選可溶性抗原:放射免疫、免疫酶標測定41利用培養(yǎng)基對單抗進行鑒定的過程利用培養(yǎng)基對單抗進行鑒定的過程42一種制備人腫瘤單克隆抗體的方案一種制備人腫瘤單克隆抗體的方案434.雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、流式細胞儀等。4.雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)44有限稀釋法通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞。4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進行克隆化。有限稀釋法通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的45軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25％的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)。軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂465.單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水（動物生物反應器）2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維系統(tǒng)等進行大規(guī)模培養(yǎng)（人工生物反應器）5.單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水（動物生物反應器）47三、單克隆抗體的改造和應用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病雜交人－鼠單克隆抗體三、單克隆抗體的改造和應用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化48單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。用同位素標記的單抗在特定的組織中成象的技術可以用于腫瘤、心血管畸形的體內(nèi)診斷。單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在491、單克隆抗體靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)通過化學反應使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基與抗體分子的氨基反應形成西佛氏堿，最后還原。這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。如：1，4－溴柔紅霉素1、單克隆抗體靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)502）藥物通過小分子與單抗連接通過一些小分子交聯(lián)劑，把藥物分子上的某些基團連接起來。小分子交聯(lián)劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、戊二酐；異型雙功能試劑：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。順烏頭酸酐制成的最常用2）藥物通過小分子與單抗連接513）藥物通過大分子與抗體相連大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等?？傊?，利用單抗試劑合可以作為靶向藥物，針對腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、各種病原體病等。3）藥物通過大分子與抗體相連522、雜交人－鼠單克隆抗體鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，還可能引發(fā)人對鼠源抗體本身的免疫反應。Fc片段利用人源的Fc區(qū)域的DNA片段替換鼠源單抗的Fc的DNA片段。嵌合抗體可以保留其目標專一性，降低人的抗鼠反應。2、雜交人－鼠單克隆抗體鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫533、人源單克隆抗體方法1：分離人B細胞，使之與熒光標記的抗原相結(jié)合，通過熒光標記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的B細胞，并用Epstein－Barr病毒轉(zhuǎn)化，得到少量的單抗。方法2：將人源免疫干細胞導入缺失大部分免疫細胞的小鼠體內(nèi)，遇到抗原時，產(chǎn)生人源的抗體。方法3：將改造過的人的抗體基因?qū)胧笈咛ブ?，能在免疫后得到產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠3、人源單克隆抗體方法1：分離人B細胞，使之與熒光標記的抗原544、抗體融合蛋白將抗體的可變區(qū)與一非抗體蛋白融合起來，使融合蛋白繼承有抗體分子的結(jié)合特異性?？梢员Ａ舨煌潭鹊目贵w結(jié)合特異性和激發(fā)其他免疫反應的能力。4、抗體融合蛋白將抗體的可變區(qū)與一非抗體蛋白融合起來，使融合555、抗體酶一種對酶促反應過渡態(tài)特異的抗體結(jié)合了酶與抗體的優(yōu)點，既可以起酶促催化作用，又可以起抗體的選擇性和專一性結(jié)合抗原的作用。5、抗體酶一種對酶促反應過渡態(tài)特異的抗體結(jié)合了酶與抗體的優(yōu)點566、單鏈抗體在大腸桿菌的系統(tǒng)中，可以表達VL－銜接物－VH的序列，產(chǎn)生單鏈抗體。單鏈FV片段:抗體體積小、免疫原性較低，滲透性好，用于實體腫瘤的診斷和治療。生物導彈：利用單鏈抗體序列接上一段藥物蛋白的編碼序列，表達后的蛋白可以根據(jù)抗原抗體反應，而達到專一性治療疾病的目的。雙功能抗體片段：兩個抗原結(jié)合特異性不同的Fab或Fv片段通過二硫鍵連接起來，如一個結(jié)合腫瘤特異性抗原，一個結(jié)合殺傷性T細胞，這樣識別和消滅腫瘤細胞的功能可以統(tǒng)一在一個單鏈抗體分子上。6、單鏈抗體在大腸桿菌的系統(tǒng)中，可以表達VL－銜接物－VH的57第四章

細胞融合與單克隆抗體CellFusionandMonoclonalAntibodies第四章

細胞融合與單克隆抗體58細胞融合單克隆抗體技術細胞融合59第一節(jié)細胞融合一、細胞融合劑二、細胞融合方式三、細胞融合技術四、雜種細胞的篩選第一節(jié)細胞融合60第一節(jié)細胞融合定義：指將不同來源的原生質(zhì)體相融合，并使之分化再生、形成新物種或新品種的過程，又稱為體細胞雜交第一節(jié)細胞融合定義：指將不同來源的原生質(zhì)體相融合，并使之61第一節(jié)細胞融合原理：植物細胞->去細胞壁(酶消化)動物細胞->分散(酶消化)->單個原生質(zhì)體->誘導融合->篩選關鍵：建立細胞橋第一節(jié)細胞融合原理：62一、細胞融合劑

受體作用電荷作用一、細胞融合劑

受體作用電荷作用63二、細胞融合方式完整細胞之間的融合核體、胞質(zhì)體與完整細胞的融合作用微小細胞與完整細胞的融合脂質(zhì)體介導的細胞融合二、細胞融合方式完整細胞之間的融合64三、細胞融合技術生物法（病毒誘導融合）化學法（化學劑誘導融合）物理法（電融合）三、細胞融合技術生物法（病毒誘導融合）65生物法生物法66化學法：聚乙二醇（PEG）

介導的細胞融合原理：①促使細胞凝結(jié)（負電荷作用）②破壞接觸處細胞膜（被洗脫）化學法：聚乙二醇（PEG）

介導的細胞融合原理：67影響因素：

分子量：4000—6000濃度：20—60%（通常：30—50%）pH：偏堿為宜（pH7.4—8.0）其他：二甲亞砜、植物血凝素影響因素：68原理： 細胞在電場中極化成偶極子，并排列成串，然后用高強度、短時程的電脈沖擊穿細胞膜。物理法：

細胞電融合原理：物理法：

細胞電融合69細胞工程制藥復習課件70甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接2）脈沖刺激后30s50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接71注意事項1）介質(zhì)要求高2）控制電壓的強度和時間注意事項1）介質(zhì)要求高72優(yōu)點：融合率高 融合率＝（融合組多核細胞的核數(shù)－對照組多核細胞的核數(shù)/對照組的全部細胞數(shù)）×100％可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可直接挑選雜種細胞優(yōu)點：融合率高73原理：兩種親本細胞融合混合物中可有多種類型細胞，篩選目的是獲得優(yōu)良雜種細胞。四、雜種細胞的篩選原理：四、雜種細胞的篩選74同核體異核體多核體異胞質(zhì)體核質(zhì)體細胞工程制藥復習課件751植物細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法如親本1： 葉綠體缺陷型親本2：光致死型

融合細胞：正常1植物細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法762）抗性互補篩選法如：親本1：放線菌素D＋，MS－親本2：放線菌素D－，MS＋雜種細胞：放線菌素D＋，MS＋而親本和其它細胞死亡2）抗性互補篩選法773）利用物理特性篩選法親本1：異硫氰酸熒光素（FITC）標記親本2：堿性蕊香紅熒光素標記 熒光顯微鏡下，親本1：綠色，親本2：紅色，雜種細胞可以區(qū)分3）利用物理特性篩選法784）利用生長特性篩選法如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞：外源激素融合細胞：內(nèi)源激素4）利用生長特性篩選法79動物細胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)親本A：Amp－，Kan＋親本B：Kan－，Amp＋雜種細胞：Amp＋，Kan＋動物細胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)802）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，親本細胞均死亡。2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)813）溫度敏感突變型親本一：Kan＋，37度親本二：高溫敏感突變型，Kan－雜種細胞能在高溫和含Kan培養(yǎng)基生長。3）溫度敏感突變型82第二節(jié)單克隆抗體一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能二、單克隆抗體的制備和生產(chǎn)三、單克隆抗體的改造和應用第二節(jié)單克隆抗體83細胞工程制藥復習課件84細胞工程制藥復習課件85抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)。一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)。一、抗體的結(jié)構(gòu)與功86二、單克隆抗體的制備雜交瘤技術：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。單克隆抗體(monoclonalantibody，簡稱McAb)：單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子。二、單克隆抗體的制備雜交瘤技術：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞和87單抗的特點1.高度特異性2.高度穩(wěn)定性3.高抗體活性4.不可知性5.過于單一性單抗的特點1.高度特異性88單抗的制備原理1.病毒轉(zhuǎn)化2.細胞雜交單抗的制備原理1.病毒轉(zhuǎn)化89單抗的制備過程1.動物免疫與親本選擇2.細胞融合3.雜交瘤細胞的篩選4.單抗制備和凍存5.單抗純化單抗的制備過程1.動物免疫與親本選擇901.動物免疫與親本選擇1）骨髓瘤細胞一般不分泌抗體能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)為HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。1.動物免疫與親本選擇1）骨髓瘤細胞912）淋巴細胞免疫方法體內(nèi)法體外法2）淋巴細胞922.細胞融合脾細胞和骨髓細胞混勻離心沉淀滴加50%的PEG0.5ml靜置90秒滴加不含血清培液或BSS5－10ml靜置10分鐘2.細胞融合脾細胞和骨髓細胞混勻933.HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞細胞團塊分散，加HAT溶液，稀釋加入有飼細胞的多孔培養(yǎng)板2－3天半量換液，7天后完成3.HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞細胞團塊分散，加HAT溶液，稀94細胞融合的選擇示意圖細胞融合的選擇示意圖951）HAT選擇系統(tǒng)HAT：是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關。DNA合成途徑有兩種。1）HAT選擇系統(tǒng)HAT：是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋96原理：雜交瘤技術中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一，無補救途徑。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了全合成途徑。淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-或TK-親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。原理：972）特異性雜交瘤細胞的篩選可溶性抗原:放射免疫、免疫酶標測定等細胞抗原:免疫熒光、被動血凝實驗、補體依賴的細胞毒等2）特異性雜交瘤細胞的篩選可溶性抗原:放射免疫、免疫酶標測定98利用培養(yǎng)基對單抗進行鑒定的過程利用培養(yǎng)基對單抗進行鑒定的過程99一種制備人腫瘤單克隆抗體的方案一種制備人腫瘤單克隆抗體的方案1004.雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、流式細胞儀等。4.雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)101有限稀釋法通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞。4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進行克隆化。有限稀釋法通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的102軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25％的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)。軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂1035.單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水（動物生物反應器）2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維系統(tǒng)等進行大規(guī)模培養(yǎng)（人工生物反應器）5.單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水（動物生物反應器）104三、單克隆抗體的改造和應用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病雜交人－鼠單克隆抗體三、單克隆抗體的改造和應用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化105單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。用同位素標記的單抗在特定的組織中成象的技術可以用于腫瘤、心血管畸形的體內(nèi)診斷。單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在1061、單克隆抗體靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)通過化學反應使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基與抗體分子的氨基反應形成西佛氏堿，最后還原。這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。如：1，4－溴柔紅霉素1、單克隆抗體靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)1072）藥物通過小分子與單抗連接通過一些小分子交聯(lián)劑，把藥物分子上的某些基團連接起來。小分子交聯(lián)劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬