基因的損傷修復(fù)和基因突變xu課件

第四章DNA的復(fù)制

Chapter4DNAReplication生物機(jī)體的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子中，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)錄給RNA.然后翻譯成特定的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生物功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。復(fù)制是指以原來DNA分子作為模板合成出互補(bǔ)分子的過程；轉(zhuǎn)錄是在DNA分子上合成出與其核苷酸順序相對應(yīng)的RNA的過程；而翻譯則是在RNA的控制下，根據(jù)核酸鏈上三個(gè)核苷酸決定一個(gè)氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的肽鏈(蛋白質(zhì)〉過程。在某些情況下RNA也可以是遺傳信息的基本攜帶者。細(xì)胞在每次分裂的過程中，整個(gè)基因組都必須精確地復(fù)制一次。如何保證這一點(diǎn)？兩個(gè)原則(1)DNA復(fù)制的啟動(dòng)決定了細(xì)胞的進(jìn)一步分裂;(2)復(fù)制過程完成前，細(xì)胞是不會(huì)發(fā)生分裂的。電鏡觀察DNA復(fù)制（真核生物）4.1.1半保留復(fù)制概述DNA復(fù)制的假設(shè)：有3種可能：

1）全保留式；

2）半保留式；

3）混合式。實(shí)驗(yàn)證明：方法：將E.Coli培養(yǎng)在以15NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長；提取其DNA；進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。再移至14N培養(yǎng)基中生長、提取DNA、離心分析。4.1.2DNA復(fù)制的一些基本概念1.復(fù)制子基因組內(nèi)能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicon)或復(fù)制單位。每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)(origin)和控制復(fù)制終止的終止點(diǎn)(terminus)。因此，從復(fù)制起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)復(fù)制子。原核生物的復(fù)制起點(diǎn)通常在它染色體的一個(gè)特定位點(diǎn)，并且只有一個(gè)起點(diǎn)，因此原核生物的染色體只有一個(gè)復(fù)制子；真核生物染色體可以在多個(gè)位點(diǎn)起始復(fù)制，有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，是多復(fù)制子。不同生物復(fù)制子的數(shù)目質(zhì)粒一般是一個(gè)自主環(huán)狀的DNA基因組，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立復(fù)制子；原核生物基因組中一般只含一個(gè)復(fù)制子，在唯一的起始點(diǎn)啟動(dòng)就會(huì)引起整個(gè)基因組復(fù)制；真核生物基因組含多個(gè)復(fù)制子（一般40-100kb/個(gè)）。2.復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)可以起始一個(gè)復(fù)制循環(huán)，并可控制復(fù)制起始反應(yīng)的頻率。3.復(fù)制終點(diǎn)大腸桿菌DNA是環(huán)形分子，復(fù)制終點(diǎn)(termini)在起始點(diǎn)OriC的相對位置(旋轉(zhuǎn)180°，距離OriC270kb處。復(fù)制從QriC開始，雙向進(jìn)行(bidirectionalreplication)。復(fù)制叉(replicationfork)向兩個(gè)相反方向沿環(huán)狀DNA前進(jìn)，最后兩個(gè)復(fù)制叉相遇在一個(gè)位點(diǎn)而停止，此停止的部位稱為終止位點(diǎn)(ter)。5.復(fù)制方向通過放射自顯影實(shí)驗(yàn)可以判斷DNA復(fù)制是雙向還是單向進(jìn)行。復(fù)制開始時(shí)，先用低放射的3H-脫氧胸苷標(biāo)記大腸桿菌。數(shù)分鐘后，再轉(zhuǎn)移到含有高放射性的3H-脫氧胸苷培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行標(biāo)記。這樣在放射自顯影圖像上，復(fù)制起始區(qū)的放射性標(biāo)記密度比較低，感光還原的銀顆粒密度也較低；繼續(xù)合成區(qū)標(biāo)記密度較高，銀顆粒密度也就較高。若是單向復(fù)制，銀顆粒的密度分布是一端低，另一端高；而雙向復(fù)制，則是中間密度低，兩端高。由大腸桿菌所獲得的放射自顯影圖像都是兩端密度高，中間低，證明大腸桿菌染色體DNA是雙向復(fù)制。(1)相向復(fù)制從兩個(gè)起點(diǎn)分別起始兩條鏈的復(fù)制，即有兩個(gè)復(fù)制叉的生長端，但在復(fù)制叉中只有一條鏈?zhǔn)悄０濉?3)雙向復(fù)制復(fù)制起始于一個(gè)位點(diǎn)，但向兩側(cè)分別形成復(fù)制叉，向相反方向移動(dòng)。在每個(gè)復(fù)制叉上，兩條DNA模板都被拷貝。在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，這種復(fù)制方式最普遍?？莶菅颗輻U菌染色體DNA復(fù)制雖是雙向的，但兩個(gè)復(fù)制叉移動(dòng)的距離不同。一個(gè)復(fù)制叉先在染色體上移動(dòng)1/5的距離后停下來，等待另一復(fù)制叉完成4/5的距離。質(zhì)粒R6K兩個(gè)復(fù)制叉的移動(dòng)也不對稱，第一個(gè)復(fù)制叉到達(dá)1/5距離即停下來，從反方向開始形成第二個(gè)復(fù)制叉并完成其余部分的復(fù)制。質(zhì)粒ColE1的復(fù)制完全是單向的，復(fù)制叉只向一個(gè)方向移動(dòng)。(2)滾動(dòng)環(huán)式復(fù)制滾動(dòng)環(huán)式(rollingcircle)復(fù)制是單向復(fù)制的特殊方式。是很多病毒、細(xì)菌因子以及真核生物中基因放大的基礎(chǔ)。滾動(dòng)環(huán)式復(fù)制步驟如下：1)首先(十)鏈DNA復(fù)制起點(diǎn)被特異性蛋白切開，形成缺口，使游離出5’和3’-OH端游離出來，(+)鏈的5’端與雙鏈脫離開；2)以(-)鏈DNA為模板，(+)鏈的3’-OH端為引物，由DNA聚合酶III催化聚合反應(yīng)，從(+)鏈的3’-OH端加入dNTP，使鏈不斷延長，3’端不斷延伸，取代原有的(十)鏈，被取代的(+)鏈不斷從(一)鏈上剝離出來；3)(+)鏈從3’端不斷被合成，好像(-)鏈在滾動(dòng)，(+)鏈5’形成越來越長的“尾巴”；4)原來的(+)鏈被滾動(dòng)出一定長度之后，作為模板重新合成(一)鏈；5)最后形成線性的正負(fù)雙鏈分子，或進(jìn)一步兩端連接形成雙鏈，這種雙鏈DNA是滾動(dòng)環(huán)式復(fù)制的中間產(chǎn)物，稱為復(fù)制型(replicativeform，RF)。滾環(huán)復(fù)制φX174噬菌體由一個(gè)單鏈環(huán)狀DNA組成，這條鏈稱為正（+）鏈；合成的互補(bǔ)鏈稱為負(fù)（一）鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。TheAproteiniscis-acting(3)D環(huán)（D-loop)式另-種單向復(fù)制的特殊方式稱為取代環(huán)或D環(huán)式復(fù)制。線粒體DNA的復(fù)制即是一例（纖毛蟲線粒體DNA為線性分子，其復(fù)制方式與此不同）。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制，但兩條鏈的合成高度不對稱，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到呈D環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到定程度，露出另一條鏈的復(fù)制起點(diǎn)時(shí)，才開始復(fù)制。表明復(fù)制起點(diǎn)是先以條鏈為模板起始合成DNA的一段序列；兩條鏈的起點(diǎn)并不在同一點(diǎn)上，由于兩條鏈的起點(diǎn)分開一定距離，所以產(chǎn)生D環(huán)復(fù)制。葉綠體DNA的復(fù)制也采取D環(huán)的方式，雙鏈環(huán)兩條鏈的起點(diǎn)不在同一位置，但同時(shí)在起點(diǎn)處解開雙鏈，進(jìn)行D環(huán)復(fù)制，故稱為2D環(huán)復(fù)制。7.復(fù)制速度真核生物DNA的復(fù)制速度比原核生物慢。真核生物染色體DNA的復(fù)制實(shí)為多復(fù)制子的同步復(fù)制。雖然各復(fù)制子發(fā)動(dòng)復(fù)制的時(shí)間有先后之差，但就整個(gè)細(xì)胞而言，能夠滿足細(xì)胞對DNA的需要。真核生物與原核生物染色體DNA的復(fù)制還有一個(gè)明顯的區(qū)別是：真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前起點(diǎn)不再重新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生物中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物在快速生長時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。4.1.3DNA復(fù)制的酶體系與DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶包括多種DNA聚合酶和DNA連接酶。1.DNA聚合酶催化的反應(yīng)在有適量DNA和鎂離子存在時(shí)，DNA聚合酶(DNApolymerase)能催化4種脫氧核糖核苷三磷酸合成DNA。反應(yīng)底物為dATP、dGTP、dCTP和dTTP4種脫氧三磷酸核苷酸，統(tǒng)稱為dNTP。在DNA聚合酶催化下，以有3’-羥基的核酸鏈作為引物，dNTP被加到DNA鏈的末端，同時(shí)釋放無機(jī)焦磷酸，鏈延長的信息來自對應(yīng)的互補(bǔ)鏈。①以4種dNTP作為底物；②反應(yīng)需要接受模板指導(dǎo)；③鏈延伸需有引物3

’-羥基存在；④鏈延伸方向?yàn)?

’→3

’

；⑤產(chǎn)物DNA的極性與模板相對。2.大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌中共有5種不同的DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶I、II、Ⅲ、IV和V。3.DNA連接酶DNA連接酶（DNAligase)催化雙鏈DNA切口處的5

’-磷酸基和3’-羥基生成磷酸二酯鍵。連接反應(yīng)需要能量：大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作為能量來源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以腺苷三磷酸(ATP)作為能量來源。4.1.4DNA的半不連續(xù)復(fù)制走向?yàn)?’→5’的DNA新合成鏈實(shí)際上是由許多5’→3’方向合成的DNA片段連接起來的。當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)一條鏈連續(xù)，另一條鏈不連續(xù)，因此稱半不連續(xù)復(fù)制。前導(dǎo)鏈（leadingstrand):

以3’→5’

鏈為模板，新生鏈以5’→3’方向連續(xù)合成；后隨鏈(laggingstrand):

由岡崎片段連接成的DNA鏈為后隨鏈。DNA合成的引物：所有已知的DNA聚合酶都不能發(fā)動(dòng)新鏈的合成，只能催化已有鏈的延伸反應(yīng)。然而RNA聚合酶則不同，它只需要DNA模板存在，就可以在其上合成新的RNA鏈。研究證明，在DNA模板上需先合成一段RNA引物，DNA聚合酶從RNA引物的3'-OH端開始合成新的DNA鏈。4.1.5DNA合成的高保真性DNA的復(fù)制是一個(gè)高保真的系統(tǒng)。與DNA復(fù)制的忠實(shí)性有關(guān)的因素包括RNA引物作用、DNA聚合酶的自我校正功能、細(xì)胞內(nèi)幾種校正和修復(fù)系統(tǒng)等。4.1.6DNA復(fù)制的拓?fù)湫再|(zhì)兩條互相纏繞的雙螺旋DNA分子具有許多拓?fù)鋵W(xué)上的性質(zhì)和關(guān)系。在DNA分子的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和裝配等過程中都涉及拓?fù)洚悩?gòu)體的轉(zhuǎn)變。DNA拓?fù)洚悩?gòu)體之間的轉(zhuǎn)變是通過拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)實(shí)現(xiàn)的。有兩類的拓?fù)洚悩?gòu)酶:I型和II型拓?fù)洚悩?gòu)酶。對原核生物來說，拓?fù)洚悩?gòu)酶I主要消除負(fù)起螺旋，但也能引起DNA的其他拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；II型拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種DNA旋轉(zhuǎn)酶，通過引入負(fù)超螺旋，從而抵消了DNA復(fù)制中產(chǎn)生的正超螺旋。真核生物的該酶略有不同。4.2細(xì)菌DNA復(fù)制的過程以大腸桿菌為例。大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制過程分為3個(gè)階段:起始、延伸和終止。其間的反應(yīng)和參與作用的酶與輔助因子各有不同。在DNA合成的生長點(diǎn)即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，它們構(gòu)成的復(fù)合物稱為復(fù)制體(replisome）。DNA復(fù)制的階段表現(xiàn)在其復(fù)制體結(jié)構(gòu)的變化上。4.2.1大腸桿菌復(fù)制的起始起始階段涉及多種酶和蛋白質(zhì)輔助因子的參與。4.2.2復(fù)制的延伸在復(fù)制的延伸階段，同時(shí)進(jìn)行著前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成。前者持續(xù)合成，后者分段合成，親代DNA雙鏈解開，由SSB穩(wěn)定并形成復(fù)制叉之后，前導(dǎo)鏈與后隨鏈的合成便有所不同。1.復(fù)制叉多種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點(diǎn)參與組裝形成復(fù)制叉。包括特異性識別和結(jié)合于起始點(diǎn)的起始蛋白、參與組裝但不涉及以后DNA合成步驟的荷載因子(loadingfactor)等。復(fù)制叉組裝大體分為兩步。第一步是起始因子對復(fù)制起始點(diǎn)的識別和雙螺旋DNA解鏈的開始。第二步是荷載因子和解鏈酶以復(fù)合體形式吸納到復(fù)制起始點(diǎn)，使雙鏈DNA解開，形成復(fù)制所需要的單鏈模板，從而形成復(fù)制叉。2.復(fù)制體和回環(huán)模型在復(fù)制叉上，同一個(gè)DNA聚合酶III分子負(fù)責(zé)雙鏈DNA同時(shí)協(xié)同地復(fù)制前導(dǎo)鏈和后隨鏈，即前導(dǎo)鏈的合成和后隨鏈的合成同步進(jìn)行。已知DNA聚合酶III全酶是一個(gè)不對稱的異二聚體，有兩個(gè)DNA合成的催化中心，前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成各利用一個(gè)催化中心。大量研究證實(shí)，這樣一個(gè)復(fù)雜的復(fù)制過程由復(fù)制體承擔(dān)，復(fù)制是發(fā)生在復(fù)制體上的一系列反應(yīng)?；丨h(huán)結(jié)構(gòu)模型能夠解釋在不連續(xù)復(fù)制的延伸中，復(fù)制叉內(nèi)處于兩個(gè)不同模板上的前導(dǎo)鏈和后隨鏈之間具有什么樣的空間和時(shí)間關(guān)系。當(dāng)兩條鏈同時(shí)復(fù)制時(shí)，后隨鏈模板經(jīng)過復(fù)制叉的部位就形成一個(gè)回環(huán)，以適應(yīng)雙鏈同時(shí)向前行進(jìn)。這種復(fù)制模型稱為回環(huán)模型.復(fù)制延伸過程歸納：前導(dǎo)鏈的合成比較簡單，全酶異二聚體的一個(gè)亞單位與前導(dǎo)鏈模板結(jié)合，在引物RNA合成的基礎(chǔ)上，連續(xù)地合成DNA，其行進(jìn)方向與復(fù)制叉一致。后隨鏈的合成分為4個(gè)步驟：1)后隨鏈的模板形成回環(huán)，聚合酶異二聚體中的一個(gè)亞單位和引發(fā)體都與后隨鏈模板結(jié)合，準(zhǔn)備開始合成引物。2)引物行進(jìn)5’→3’方向的合成，由于模板呈環(huán)狀，所以引物行進(jìn)的方向就與復(fù)制叉行進(jìn)方向一致。3)模板鏈的環(huán)不斷擴(kuò)大，在引物3'-OH端開始合成DNA片段，合成方向?yàn)?'→3'，行進(jìn)方向與復(fù)制叉行進(jìn)方向一致。4)當(dāng)DNA新片段合成到距離前一片段的5‘端僅剩一小空隙時(shí)，酶的行進(jìn)受阻，模板鏈解環(huán)，新合成的片段隨即移動(dòng)到與復(fù)制叉行進(jìn)相反的方向，至此后隨鏈的一個(gè)岡崎片段的合成完成。與此同時(shí)，前移的復(fù)制體內(nèi)引物酶又尋找新的引發(fā)位點(diǎn)，起始轉(zhuǎn)錄段新的RNA引物。后隨鏈模板又繞DNA聚合酶III形成一個(gè)新回環(huán)，再次合成下一個(gè)岡崎片段。DNA聚合酶III合成的岡崎片段，由DNA聚合酶I切除5'端的RNA引物，填補(bǔ)片段之間的空缺，最后由DNA連接酶把它們連接成一條完整的子代鏈。3.復(fù)制的終止細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉向前推移，最后在終止區(qū)(terminusregion)相遇并停止復(fù)制，該區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)位點(diǎn)。兩個(gè)復(fù)制叉在終止區(qū)相遇后停止復(fù)制，復(fù)制體解體，其間仍有50~100bp未被復(fù)制，由修復(fù)方式填補(bǔ)空缺，其后兩條鏈解開。4.3真核生物DNA的復(fù)制真核生物的DNA纏繞在組蛋白核心上，每形成一個(gè)核小體大約相當(dāng)于引入1.2個(gè)負(fù)超螺旋。真核生物DNA復(fù)制的同崎片段長約200bp，相當(dāng)于一個(gè)核小體DNA的長度。真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。4.3.1DNA聚合酶真核生物有多種DNA聚合酶。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離出了5種，分別為α、β、γ、δ、ε。真核DNA聚合酶和細(xì)菌的基本性質(zhì)相同。聚合酶α和δ是染色體復(fù)制所需要的酶；聚合酶ε相當(dāng)于細(xì)菌聚合酶Ⅰ，是一種修復(fù)酶；聚合酶β也是一種修復(fù)酶；聚合酶γ是線粒體DNA合成酶。4.3.2真核生物染色體端粒的復(fù)制原核生物的染色體是環(huán)狀的，其5'端岡崎片段的RNA引物被切除后可借助DNA模板鏈的另半圈向前延伸得到填補(bǔ)。但真核生物的線性染色體在復(fù)制叉到達(dá)線性末端時(shí)，前導(dǎo)鏈可以連續(xù)復(fù)制直到線性染色體模板鏈的末端，產(chǎn)生和釋放完整的子代染色單體。而線性的后隨鏈模板是以不連續(xù)方式復(fù)制的，不能像原核那樣在切除引物后填補(bǔ)5'端的空缺。如果生物體沒有特殊的修復(fù)機(jī)制，后隨鏈的模板鏈就很可能被不完整復(fù)制，從而使后隨鏈子代DNA的5'端序列逐步縮短，導(dǎo)致每次細(xì)胞分裂時(shí)由后隨鏈合成產(chǎn)生的子代染色單體DNA都要短一截。真核生物能夠通過形成端粒(telomere)結(jié)構(gòu)以及具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的端粒酶(telomerase)來防止DNA復(fù)制時(shí)后隨鏈縮短而產(chǎn)生的染色體缺短。端粒酶可以外加重復(fù)單位到5‘端上，維持端粒一定的長度。端粒酶，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，能利用自身攜帶的RNA鏈作為模板，以dNTP為原料，以逆轉(zhuǎn)錄的方式催化互補(bǔ)于RNA模板的后隨鏈DNA片段的合成，防止因后隨鏈縮短而產(chǎn)生的染色體缺短，它是RNA與蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白（RNP)復(fù)合體。4.4DNA復(fù)制的