全國流行性腦脊髓膜炎防治指南(試行)

行膜（（Neisseriameningitidis）、C于年和1977年先后發(fā)次全國1967年春季最403/105.49%，流A群疫／10AB群BC群有CNm級(jí)群眾的身人精選資料，歡迎下載疫級(jí)各6小時(shí)在小有關(guān)程序帶菌縣為單位以2歲以下健精選資料，歡迎下載分離的菌病預(yù)、當(dāng)內(nèi)23縣月內(nèi)5例或5痛6死出現(xiàn)及精選資料，歡迎下載首切接綜旦發(fā)現(xiàn)有病例為學(xué)％％，難以據(jù)病例的康人群帶A群流A+C群流省精選資料，歡迎下載A群流A+C群A群流月2與第3個(gè)月3時(shí)第2接種1＋流腦接2歲以2A群流A+CA3個(gè)月；22AA1針于1。A+C群流流腦督部院要早采精選資料，歡迎下載密切7熱吐務(wù)參考行免A群流6個(gè)月當(dāng)?shù)匕l(fā)C群2周小學(xué)生及流2歲以精選資料，歡迎下載1％通醫(yī)群眾筑工精選資料，歡迎下載

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轉(zhuǎn)血

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血eq\o\ac(□,)eq\o\ac(□,/)eq\o\ac(□,)eq\o\ac(□,/)eq\o\ac(□,)□血血精選資料，歡迎下載

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位項(xiàng)精選資料，歡迎下載附件2

流行性腦脊髓膜炎的樣品采集和運(yùn)送適宜的檢測(cè)樣品為腦脊液液膚粘膜出血點(diǎn)擠出液清及鼻咽拭子等例的腦脊液液膚粘膜出血點(diǎn)擠出液中檢出腦膜炎奈瑟菌可直接作為確診依據(jù)。一、樣品采集：拭子：長柄棉拭子采咽后壁兩側(cè)分泌物即接種于卵黃雙抗培養(yǎng)基（或巧克力血平板，也可將咽拭子放入液體雙抗增菌管內(nèi)，增菌8-12小時(shí)以后分離培養(yǎng)。．腦脊液：采集毫升腦脊液，可直接接種于巧克力EPV板，也可先增菌再進(jìn)行分離培養(yǎng)。液菌手續(xù)抽取發(fā)熱期病人全血毫升即加于50毫升的葡萄糖肉湯中增菌后再分離培養(yǎng)；．淤血點(diǎn)：選病人皮膚上的新鮮淤斑或淤血點(diǎn)，消毒后用針頭挑破，擠出組織液，用無菌棉簽蘸取先接種含雙抗的葡萄糖增菌肉湯管中增菌小時(shí)后分離培養(yǎng)或直接接種EPV平板片染色直接鏡檢涂片革蘭染色，直接鏡檢；涂片也可做免疫熒光檢查。．血清：采集病人發(fā)病早期和恢復(fù)期周內(nèi)）雙份血清，檢測(cè)血清中特異性抗體呈4倍或4倍以上升高。二、樣品的處理和運(yùn)送．及時(shí)處理樣品：腦膜炎奈瑟菌比較脆弱，采集樣品后，應(yīng)盡可能地做到床邊接種，若無可能則應(yīng)再最短的時(shí)間內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行接種培養(yǎng)。．早期采集樣品：應(yīng)盡可能采集病人用藥前的早期樣品，這可以明顯提高病原的撿出水平。．保溫運(yùn)送：腦膜炎奈瑟菌對(duì)溫度較為敏感，溫度過低或過高均可導(dǎo)致菌株死亡。在運(yùn)送樣品或培養(yǎng)物時(shí)，應(yīng)保持樣品處20℃-36℃之間，切記不能低溫運(yùn)送（檢測(cè)抗體的血清標(biāo)本除外要求每份血液標(biāo)本不少于3毫升離血清后低溫(<-20℃)保存檢測(cè)流腦抗體測(cè)定和/或細(xì)菌分離與鑒定。精選資料，歡迎下載附件2－A

流行性腦脊髓膜炎病原學(xué)診斷方法A1病原體(腦膜炎奈瑟氏菌Neissriameningitiｄｉs)分離從疑似流腦患者采集或急性期血液分離Nm。A1.1標(biāo)本的采集A1.1.1：無菌操作，吸出CSF立即放到無菌試管內(nèi)離心3000r/min30min)，用滅菌過的毛細(xì)管吸取沉淀物直接接種10％羊血巧克力色瓊脂上(CSF上清液部分供檢測(cè)Nm特異抗原，亦可將其置于20℃待測(cè)5％二氧化碳環(huán)境37℃培養(yǎng)24～72h日檢查細(xì)菌生長的情況時(shí)分離純培養(yǎng)物供鑒定。A1.1.2血液：采取病人急性期靜脈血液6mL，無菌操作，向盛有30mL菌用葡萄糖肉湯的三角瓶內(nèi)注入血(余下的2mL血液離心后吸出血清，供檢測(cè)Nm特異抗原和抗體，亦可將其置于20℃待測(cè))5％二氧化碳環(huán)境，培24～72h，每日進(jìn)行觀察、分離、培養(yǎng)。A1.2接種和菌種鑒定A1.2.1細(xì)菌形態(tài)應(yīng)為革蘭陰性卵圓形或腎形μm×0.6μm大小。常成對(duì)排列，臨近兩邊扁平凹陷。A1.2.2菌落接種于巧克力色瓊脂平皿上二氧化碳℃培24h后，其菌落直徑約1mm，表面突起、光滑、濕潤、圓整、略帶灰白色、半透明、不溶血、無色素。培養(yǎng)時(shí)間延長，菌落增大、變成黃色、不透明，并可出現(xiàn)顆粒狀中心和放射性周邊。A1.2.3生長及抗原特性大多數(shù)Nm菌株分解葡萄糖和麥芽糖酸不產(chǎn)氣。不分解蔗糖、果糖和乳糖。過氧化酶和氧化酶陽性。Nm新分離菌株具有下列主要抗原：血清群特異性莢膜多糖，主要外膜蛋白－OMP(包括血清型特異的2/3類OMP，亞型特異的類OMP以及4與5類OMP)，鐵調(diào)節(jié)蛋白，脂寡糖LOS)，脂蛋白、菌毛抗原等，根據(jù)群特異性莢膜多糖的結(jié)構(gòu)與組成成分，Nm可分為13個(gè)血清群(A、、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z)，其中90％以上的病例是由、BCNm起的。根據(jù)可將B群與C群Nm分成20個(gè)血清型差不多半數(shù)菌株目前尚不能分型可分型菌株中，1524型P1.2P1.1P1.12P1.15及P1.16亞型多見；精選資料，歡迎下載對(duì)于Nm現(xiàn)有與兩個(gè)血清型，以亞多見。可以分成13個(gè)LOS免疫型，其A群以L10和L11型多見B群中以L379復(fù)合型多見。Nm特異性莢膜多糖、型和亞型的OMP等抗原成分對(duì)流腦發(fā)病與流行及其菌苗的研究均具有重要價(jià)值。精選資料，歡迎下載附件2－B

流行性腦脊髓膜炎血清學(xué)診斷方法B1玻片凝集試驗(yàn)B1.1目的應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)對(duì)Nm病原菌株或帶菌者菌株進(jìn)行血清學(xué)分群。B1.2材料B1.2.1待檢的Nm菌株純培養(yǎng)物。B1.2.2Nm斷血清：多價(jià)I(包含、B、C、D)，多價(jià)Ⅱ〔包含1889(Y)、1890(H)1892(29E)［包319(W135)1916(X)1486(I)1811(K)群］及11群?jiǎn)蝺r(jià)血清，共計(jì)14種。B1.2.3潔凈載玻片。B1.2.4生理鹽水。B1.3試驗(yàn)方法B1.3.1先將診斷血清按說明書稀釋成所需的濃度，滴一滴在潔凈的玻片上。B1.3.2用白金耳刮取菌苔少許玻片上沾取少量血清一旁研磨均勻與血清混勻。B1.3.3輕輕搖動(dòng)玻片數(shù)次，在1～2min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者，即為陽性。B1.3.4檢查從病人分離的疑似時(shí)先試血清，若不與其發(fā)生凝集，則試用B或C群血清，仍不凝集時(shí)，則試用多價(jià)Ⅱ或多價(jià)Ⅲ血清。若發(fā)生凝集，再用單價(jià)血清定群。從病人分離的疑似Nm對(duì)現(xiàn)有診斷血清皆不凝集者則送研究單位進(jìn)一步鑒定。B1.3.5在玻片上與各群診斷血清水或正常兔血清皆發(fā)生凝集者定為自凝菌。B2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。B3殺菌力試驗(yàn)B3.1目的應(yīng)用微量殺菌力試驗(yàn)(TTC)測(cè)定病人急性期和恢復(fù)期血清中對(duì)Nm殺菌抗體水平。此方法也可用于健康人群的血清抗體測(cè)定。B3.2材料B3.2.1

靶菌：對(duì)補(bǔ)體的自然殺菌作用具有耐受性，但對(duì)殺菌抗體反應(yīng)敏感的Nm(A群29019，B群和C群Nm)。精選資料，歡迎下載B3.2.2稀釋液：Dulbeccos磷酸鹽緩沖鹽水液：氯化(NaCl)8.0g，氯化(KCl)0.2g，磷酸氫二(Na2HPO4)1.15g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g，蒸餾水800mL；液：氯化鈣(CaCl2)0.1g，蒸餾水100mL；液：氯化鎂(MgCl2·6H2O)0.1g，蒸餾水100mL。上述三液分別滅菌℃15min，4備用。需用時(shí)A液份B液和C液各1份的比例混合，pH為7.1。使用時(shí)釋液加滅活兔血1mL500gB2500單位或硫酸抗敵霉素5000單位。稀釋液盛于小瓶中，4℃?zhèn)溆?，可?周。B3.2.3滴定板部U”形的96孔有機(jī)玻璃微滴板備用同樣大小的普通玻璃作蓋板它們平放在80℃的烤箱內(nèi)烤后備用驗(yàn)完畢約80℃的熱水泡板1h殺死靶菌，再以自來水沖洗干凈，并用棉棒拭凈不潔凈的孔。最后以蒸餾水沖洗一次，37℃烤干后同上于80干烤。滴定板使用一段時(shí)間后或遇到雜菌污染較嚴(yán)重時(shí)水殺死靶菌并沖洗干凈；在比較稀的硫酸重鉻酸鉀清潔液內(nèi)浸泡，沖洗干凈后同上處理備用。B3.2.4兔補(bǔ)體：可以購買成品。B3.2.5

氯化三苯四氮唑TriphenylTetrazoliumChloride，TTC)瓊脂培養(yǎng)基(TTC瓊脂)B3.2.5.1TTC瓊脂配方：牛肉膏0.5％，氯化0.5％，日本蛋白3.0％，可溶性淀0.2％，以蒸餾水配制，調(diào)pH7.4～7.6，瓊脂0.5％。B3.2.5.2TTC瓊脂制作上述培養(yǎng)基成分熔化后裝于大試管滅15min，冷卻后置℃?zhèn)溆谩ＥR用前將培養(yǎng)基加熱熔化，每培基加50％葡萄糖注射液0.1mL1％TTC水溶液(4℃避光保存)0.1mL混勻放45℃水溶液中待用。B3.2.5.3陽性參考血清用Nm免疫兔制備的診斷血清，未加防腐劑，經(jīng)預(yù)試測(cè)定其殺菌抗體滴度較高(1∶3200以上)。B3.3殺菌抗體測(cè)定步驟B3.3.1靶菌液的制備精選資料，歡迎下載B3.3.1.1開啟A或C群Nm菌種種到巧克力色瓊脂平皿上℃二氧化碳孵箱或燭缸培養(yǎng)15～20h3～5個(gè)菌落涂于另一平皿～15h。B3.3.1.2用Nm診斷血清和生理鹽水進(jìn)行玻片凝集及顯微鏡檢查菌種。B3.3.1.3菌種被確證以后其菌苔勻于滅菌脫脂牛奶管中成濃菌液，分裝若干支小試管，每管約0.2mL置—20℃以下保存，Nm可存活～6個(gè)月。B3.3.1.4需用靶菌時(shí)，取出一支上述牛奶菌種管，熔化后立即轉(zhuǎn)種并放℃冰箱內(nèi)保存，供每日分離靶菌制作菌懸液，可備用周。在測(cè)定抗體的過程中，每次所用靶菌傳種的代數(shù)保持一致。B3.3.1.5從所分離的靶菌平皿上挑取～5典型菌落，涂抹轉(zhuǎn)種巧力色瓊脂平皿37℃燭缸培養(yǎng)4～6h，刮取菌苔，于盛3.5mL左右稀釋液的試管壁上用白金耳將其充分研磨，制成輕度混濁的均勻菌懸液，其光密度值相當(dāng)于0.1。B3.3.1.6取出上述菌懸液2mL加到0.5cm比色杯內(nèi)為540nm的分光光度計(jì)上測(cè)其光密度值。B3.3.1.7稀釋液用量按式(B1)計(jì)算：mL；

X＝OD×10—0.1……………(B1)

式中—稀釋液用量，OD——光密度值。按照式(B1)計(jì)算稀釋液用量后往里加入靶菌懸液時(shí)相當(dāng)于光密度值為0.1的靶菌液作了10倍稀釋吸均勻后其開始再連續(xù)作倍稀釋至10－5稀釋度，以菌液的最終濃度為每毫升含個(gè)菌落形成單位為宜。B3.3.1.8稀釋好的靶菌懸液在1h內(nèi)用完。B3.3.2殺菌抗體的測(cè)定B3.3.2.1先在微滴板每孔內(nèi)加1滴相當(dāng)于μL的稀釋液。B3.3.2.2用移液器從每排第一孔內(nèi)加25μ經(jīng)56℃30min滅活的待檢血清吸5～10次后吸出25μL至下一孔此作連續(xù)倍比稀釋至最后一孔份血清分別用一支移液槍頭。B3.3.2.3從低溫冰箱內(nèi)取出補(bǔ)體，37℃溫水中搖動(dòng)將其速溶，每孔加一滴。若補(bǔ)體已冷凍干燥往安瓿內(nèi)加相當(dāng)于補(bǔ)體血清原體積的稀釋液其融化后精選資料，歡迎下載即刻使用。B3.3.2.4每孔加一滴稀釋成合適濃度的靶菌菌液置微型振蕩器上中速振蕩5min，再在37℃培養(yǎng)25min，取出后重復(fù)上述振蕩。B3.3.2.5每孔加已熔化冷至℃左右的TTC脂后，微滴板置℃燭缸內(nèi)培養(yǎng)15～20h后觀察結(jié)果。B3.3.2.6每次試驗(yàn)需做下列對(duì)照：陽性參考血清對(duì)照；孔補(bǔ)體對(duì)照稀釋液、補(bǔ)體、菌液各一滴，檢查補(bǔ)體自然殺菌活性)；4細(xì)菌生長對(duì)照(稀釋液、滅活補(bǔ)體和靶菌菌液各1)。每次檢測(cè)時(shí)至少每5塊微滴板中應(yīng)有一組上述三種對(duì)照試驗(yàn)。B3.3.2.7往各孔滴完靶菌菌液之后菌液兩滴分別滴加到一個(gè)巧克力色瓊脂平皿的一端，沿著劃好的兩條線傾斜下流，于37℃燭缸內(nèi)同時(shí)培養(yǎng)，次日檢查每滴靶菌的菌落數(shù)及其純度。B3.3.2.8判斷結(jié)果時(shí)檢查上述三種對(duì)照試驗(yàn)的結(jié)果體的和細(xì)菌生長對(duì)照的各孔應(yīng)出現(xiàn)眾多的紅色點(diǎn)狀小菌落考血清應(yīng)達(dá)到原來確定的殺菌滴度各孔中紅色點(diǎn)狀菌落數(shù)目明顯地少于補(bǔ)體對(duì)照孔或不出現(xiàn)紅色點(diǎn)狀菌落時(shí)判斷為殺菌陽性果所試孔中的菌落數(shù)目接近補(bǔ)體對(duì)照孔的一半或更多時(shí)，則判斷為殺菌陰性。B3.3.2.9根據(jù)紅色點(diǎn)狀菌落數(shù)目的多少，以符號(hào)“＋”記錄試驗(yàn)結(jié)果。若補(bǔ)體及靶菌生長對(duì)照各孔的細(xì)菌正常生長時(shí)出現(xiàn)眾多紅色點(diǎn)狀菌落記＋＋＋＋各孔與其比較，菌落數(shù)減少30％以下，記為“＋＋＋50％左右記右記菌落則記以細(xì)菌生長成呈“＋”及以下者判斷為殺菌陽性；以“＋＋”及以上者判為殺菌陰性。以出現(xiàn)殺菌陽性的血清最高稀釋度為殺菌抗體的最高滴度。精選資料，歡迎下載附件2－CC1目的

流行性腦脊髓膜炎膠乳凝集試驗(yàn)應(yīng)用膠乳凝集試驗(yàn)測(cè)定病人CSF、急性期血清和尿中特異抗原，輔助流腦臨床診斷。C2材料可購買成品膠乳檢測(cè)試劑，按照說明書進(jìn)行操作。C3.2以膠乳凝集試驗(yàn)檢測(cè)疑似流腦病人標(biāo)本內(nèi)群特異性抗原。C3.2.1病人標(biāo)本的處理CSF離心(3000r/min30min)，取上清，沉淀部分作細(xì)菌培養(yǎng)；急性期血液(2mL)，分離血清，置℃將其滅活30min；急性期尿液5mL無乙醇，置4℃1～2h，離心(3000r/min，15min)，棄上清，收集沉淀部分加0.25mLBBSB液將其溶解，同前離心，小心地吸取上清液待測(cè)，不要吸取尿中不溶解的沉渣。C3.2.8在上述病人標(biāo)本中只要有一種標(biāo)本與抗任何一所致敏Lx發(fā)生明顯凝集反應(yīng)，則說明所檢標(biāo)本中含有相應(yīng)群特異的抗原，即可輔助臨床診斷為流腦。附件2－D

標(biāo)本及疑似菌株ＰＣＲ輔助鑒定對(duì)于不能用血清學(xué)分群的腦膜炎奈瑟菌疑似菌株或無法進(jìn)行腦膜炎奈瑟菌分離培養(yǎng)的腦脊液液清標(biāo)本可采用ＰＣＲ方法進(jìn)行ＤＮＡ擴(kuò)增輔助檢測(cè)鑒定。3.1目的基因：唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因（基因?yàn)镻CR擴(kuò)增的目的片段來區(qū)分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ等五個(gè)常見流腦血清群。orf-2因：可作為流腦奈瑟菌屬的特異性基因。3.2寡聚核苷酸引物序列crgAF:5’-gctggcgccgctggcaacaaaattc-3’,R:5’-cttctgcagattgcggcgtgccgt-3’Orf-2(A)F:5’-cgcaataggtgtatatattcttcc-3,R:5’-cgtaatagtttcgtatgccttctt-3’SiaD(B)F:5-ggatcatttcagtgttttccacca-3’R:5’-gcatgctggaggaataagcattaa-3’SiaD(C)F:5-tcaaatgagtttgcgaatagaaggt-3’R:5’-caatcacgatttgcccaattgac-3’SiaD(Y)F:5-ctcaaagcgaaggctttggtta-3，’R:5’-ctgaagcgttttcattataattgctaa-3’SiaD(W135)F:5-cagaaagtgagggatttccata-3’R:5’-cacaaccattttcattatagttactgt-3’3.3樣品處理可采用目前市售的ＤＮＡ提取試劑盒提取樣品ＤＮＡ取直接煮沸方法，將樣品煮沸３０分鐘，離心，取上清作為擴(kuò)增樣品。3.4擴(kuò)增及檢測(cè)條件92℃30秒，55℃40，72℃30秒37個(gè)環(huán)，反應(yīng)產(chǎn)物1.5-2%脂糖凝