基因定位常用的方法課件

1第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年將紅綠色盲基因首次定位于X染色體上,開創(chuàng)了人類基因定位的先河.1968年,Donahue利用系譜分析的方法將Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體上,是人類首次在常染色體上進(jìn)行的基因定位.20世紀(jì)70年代后,體細(xì)胞雜交重組DNA、分子雜交和PCR等技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，基因定位的方法愈加先進(jìn)，基因定位的速度、數(shù)量明顯加快。人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，更加促進(jìn)了基因定位的進(jìn)程。基因定位對(duì)提高人類對(duì)疾病產(chǎn)生的病因?qū)W的認(rèn)識(shí)有重要意義。1第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年2

明確幾個(gè)基本概念基因：DNA的功能片段?；蚪M：有機(jī)體全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的總和。基因定位：是用一定的方法將基因確定到染色體的實(shí)際位置。2明確幾個(gè)基本概念基3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個(gè)基因分離趨勢(shì)為基礎(chǔ)來繪制基因座位間的距離，它表明基因之間連鎖關(guān)系和相對(duì)距離，并以重組率來計(jì)算和表示，以厘摩（cM）為單位。染色體定位：只把基因定位到某條染色體上。細(xì)胞水平上的基因圖又稱細(xì)胞遺傳圖區(qū)域定位：從細(xì)胞遺傳學(xué)水平，用染色體顯帶等技術(shù)在光學(xué)顯微鏡下觀察，將基因定位到染色體的具體區(qū)帶。3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個(gè)基因分離趨勢(shì)為4一、基因定位的方法1、體細(xì)胞雜交法基因定位：體細(xì)胞：即生物體除生殖細(xì)胞外的任一細(xì)胞。1）體細(xì)胞雜交的概念：也稱細(xì)胞融合（cellinfusion），是將來源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。新產(chǎn)生的細(xì)胞稱雜種細(xì)胞（hybridcell），含雙親不同的染色體。4一、基因定位的方法1、體細(xì)胞雜交法基因定位：5

2）對(duì)象：人的細(xì)胞鼠類：大鼠、小鼠、倉鼠

3）雜種細(xì)胞的特點(diǎn)：在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。52）對(duì)象：人的細(xì)胞64）原理：細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長條件的要求和代謝的差異來進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。64）原理：7HAT選擇系統(tǒng)：

人的突變細(xì)胞株：缺乏HGPRT酶小鼠細(xì)胞株：缺乏TK酶兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中

HAT培養(yǎng)基：

H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料7HAT選擇系統(tǒng)：人的突變細(xì)胞株：缺乏HG8因此在HAT培養(yǎng)基上

人細(xì)胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同時(shí)由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤通過旁路合成DNA（嘌呤合成障礙）

8因此在HAT培養(yǎng)基上人細(xì)胞：9鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙）

雜種細(xì)胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

9鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT10

將篩選出來的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號(hào)染色體上，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。10將篩選出來的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培11鼠人XTK-HPRT+TK+HPRT-鼠人鼠人鼠人TK+HPRT+173173173TK+TK+TK-HAT11鼠人XTK-TK+鼠人鼠人鼠人TK+1731731712②克隆嵌板法(clonepanelmethod)

根據(jù)不同雜種細(xì)胞保留或丟失的人染色體有時(shí)是重疊的情況,設(shè)計(jì)的一種簡便而實(shí)用的基因定位方法。

克隆嵌板

雜種克隆保留的人染色體

12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-12②克隆嵌板法(clonepanelmethod)132.原位雜交和熒光原位雜交

1）原位雜交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。

2）原理：堿基的互補(bǔ)配對(duì)，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，可檢測細(xì)胞基因組中的同源部分。132.原位雜交和熒光原位雜交143）原位雜交的特點(diǎn)：雜交在載玻片上的中期染色體上進(jìn)行，而不是在溶液和膜上進(jìn)行。所謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)度來確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定位。143）原位雜交的特點(diǎn)：154）原位雜交的步驟

制備中期染色體

DNA原位變性

變性放射性或非放射性標(biāo)記探針

雜交（在載玻片上）

洗膜

放射性標(biāo)記：放射自顯影

檢測非放射性標(biāo)記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合記錄雜交信號(hào)結(jié)合染色體形態(tài)進(jìn)行基因定位154）原位雜交的步驟制備中期染色體165）熒光原位雜交

（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）

用特殊熒光素（dig或Biotin）標(biāo)記探針DNA（Nicktranslation標(biāo)記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點(diǎn)：可用來作基因或特定DNA片段的染色體區(qū)域定位。缺點(diǎn)：必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行。165）熒光原位雜交

（florescenceinsit17單色FISH17單色FISH18

多色FISH18多色FISH193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念202）重組值（recombinationfraction）是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）3）遺傳標(biāo)記（geneticmarker）用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。202）重組值（recombinationfraction212122致病基因和標(biāo)記座的連鎖22致病基因和標(biāo)記座的連鎖23遺傳多態(tài)性：是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。常用的遺傳標(biāo)記：

①ABO血型蛋白多態(tài)

②血清蛋白泳動(dòng)學(xué)改變

③HLA

④RFLP小衛(wèi)星DNA：VNTR6-12個(gè)核苷酸DNA多態(tài)

⑤VNTR微衛(wèi)星DNA：STR2-6個(gè)的VNTR

⑥SNPs23遺傳多態(tài)性：是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，24

二、基因克隆致病基因克隆有兩種基本策略功能克隆定位克隆

1、功能克隆(functionalcloning)

是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進(jìn)行基因定位,進(jìn)而克隆該基因.

24二、基因克隆252、定位克隆(positionalcloning)

是先進(jìn)行基因定位作圖,然后找到來自該定位區(qū)的基因并進(jìn)行克隆,在此之后才能明確該基因的功能.

功能克隆和定位克隆的比較:

在傳統(tǒng)的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鑒定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鑒定基因.基因已鑒定后,可以進(jìn)行基因功能的選擇性研究.

252、定位克隆(positionalclonin262627

定位克隆鑒定的第一批基因利用了特定基因座的染色體畸變，Duchenne肌營養(yǎng)不良(DMD)基因的克隆是一個(gè)重要的例子。2728假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)

由于抗肌萎縮蛋白(dystrophin)遺傳性缺陷所致的進(jìn)行性肌萎縮的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病,發(fā)病率為1/3500，XR遺傳。

主要癥狀:通常3---5歲發(fā)病,開始走路不穩(wěn),鴨型步態(tài),上樓梯困難,Gower征陽性.進(jìn)行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大,10多歲下肢癱,一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭.28假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)

由于抗肌29DMD基因克隆的方法

研究者們通過對(duì)幾個(gè)女性患者的細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)病例受累的常染色體不同但在X染色體上的斷裂點(diǎn)總是p21。同時(shí)一個(gè)無任何遺傳缺陷家族史的男孩被發(fā)現(xiàn)患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病，在這個(gè)獨(dú)一無二個(gè)體的引發(fā)下，經(jīng)過仔細(xì)的遺傳學(xué)研究，最終發(fā)現(xiàn)了Xp21.1的微小缺失。29DMD基因克隆的方法研究者們通過對(duì)幾個(gè)女性患者30DMD女性患者的核型30DMD女性患者的核型31X染色體與常染色體易位時(shí)X染色體失活的結(jié)果31X染色體與常染色體易位時(shí)X染色體失活的結(jié)果32兩個(gè)研究小組分別采用兩種不同的方法克隆了DMD基因：一組是通過X常染色體易位，克隆了該基因的一部分。另一研究組使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA，利用消減技術(shù)，獲得了在正常X染色體存在而在這個(gè)男孩DNA中缺乏的DNA克隆片段。32兩個(gè)研究小組分別采用兩種不同的方法克隆了DMD基因：33一名患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病的男孩存在Xp21.2的微小臂內(nèi)缺失33一名患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病的男孩存在Xp21.34多重PCR篩查抗肌萎縮蛋白基因缺失34多重PCR篩查抗肌萎縮蛋白基因缺失35第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年將紅綠色盲基因首次定位于X染色體上,開創(chuàng)了人類基因定位的先河.1968年,Donahue利用系譜分析的方法將Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體上,是人類首次在常染色體上進(jìn)行的基因定位.20世紀(jì)70年代后,體細(xì)胞雜交重組DNA、分子雜交和PCR等技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，基因定位的方法愈加先進(jìn)，基因定位的速度、數(shù)量明顯加快。人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，更加促進(jìn)了基因定位的進(jìn)程?；蚨ㄎ粚?duì)提高人類對(duì)疾病產(chǎn)生的病因?qū)W的認(rèn)識(shí)有重要意義。1第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年36

明確幾個(gè)基本概念基因：DNA的功能片段?；蚪M：有機(jī)體全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的總和?；蚨ㄎ唬菏怯靡欢ǖ姆椒▽⒒虼_定到染色體的實(shí)際位置。2明確幾個(gè)基本概念基37遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個(gè)基因分離趨勢(shì)為基礎(chǔ)來繪制基因座位間的距離，它表明基因之間連鎖關(guān)系和相對(duì)距離，并以重組率來計(jì)算和表示，以厘摩（cM）為單位。染色體定位：只把基因定位到某條染色體上。細(xì)胞水平上的基因圖又稱細(xì)胞遺傳圖區(qū)域定位：從細(xì)胞遺傳學(xué)水平，用染色體顯帶等技術(shù)在光學(xué)顯微鏡下觀察，將基因定位到染色體的具體區(qū)帶。3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個(gè)基因分離趨勢(shì)為38一、基因定位的方法1、體細(xì)胞雜交法基因定位：體細(xì)胞：即生物體除生殖細(xì)胞外的任一細(xì)胞。1）體細(xì)胞雜交的概念：也稱細(xì)胞融合（cellinfusion），是將來源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。新產(chǎn)生的細(xì)胞稱雜種細(xì)胞（hybridcell），含雙親不同的染色體。4一、基因定位的方法1、體細(xì)胞雜交法基因定位：39

2）對(duì)象：人的細(xì)胞鼠類：大鼠、小鼠、倉鼠

3）雜種細(xì)胞的特點(diǎn)：在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。52）對(duì)象：人的細(xì)胞404）原理：細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長條件的要求和代謝的差異來進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。64）原理：41HAT選擇系統(tǒng)：

人的突變細(xì)胞株：缺乏HGPRT酶小鼠細(xì)胞株：缺乏TK酶兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中

HAT培養(yǎng)基：

H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料7HAT選擇系統(tǒng)：人的突變細(xì)胞株：缺乏HG42因此在HAT培養(yǎng)基上

人細(xì)胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同時(shí)由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤通過旁路合成DNA（嘌呤合成障礙）

8因此在HAT培養(yǎng)基上人細(xì)胞：43鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙）

雜種細(xì)胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

9鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT44

將篩選出來的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號(hào)染色體上，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。10將篩選出來的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培45鼠人XTK-HPRT+TK+HPRT-鼠人鼠人鼠人TK+HPRT+173173173TK+TK+TK-HAT11鼠人XTK-TK+鼠人鼠人鼠人TK+1731731746②克隆嵌板法(clonepanelmethod)

根據(jù)不同雜種細(xì)胞保留或丟失的人染色體有時(shí)是重疊的情況,設(shè)計(jì)的一種簡便而實(shí)用的基因定位方法。

克隆嵌板

雜種克隆保留的人染色體

12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-12②克隆嵌板法(clonepanelmethod)472.原位雜交和熒光原位雜交

1）原位雜交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。

2）原理：堿基的互補(bǔ)配對(duì)，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，可檢測細(xì)胞基因組中的同源部分。132.原位雜交和熒光原位雜交483）原位雜交的特點(diǎn)：雜交在載玻片上的中期染色體上進(jìn)行，而不是在溶液和膜上進(jìn)行。所謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)度來確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定位。143）原位雜交的特點(diǎn)：494）原位雜交的步驟

制備中期染色體

DNA原位變性

變性放射性或非放射性標(biāo)記探針

雜交（在載玻片上）

洗膜

放射性標(biāo)記：放射自顯影

檢測非放射性標(biāo)記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合記錄雜交信號(hào)結(jié)合染色體形態(tài)進(jìn)行基因定位154）原位雜交的步驟制備中期染色體505）熒光原位雜交

（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）

用特殊熒光素（dig或Biotin）標(biāo)記探針DNA（Nicktranslation標(biāo)記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點(diǎn)：可用來作基因或特定DNA片段的染色體區(qū)域定位。缺點(diǎn)：必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行。165）熒光原位雜交

（florescenceinsit51單色FISH17單色FISH52

多色FISH18多色FISH533.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念542）重組值（recombinationfraction）是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）3）遺傳標(biāo)記（geneticmarker）用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。202）重組值（recombinationfraction552156致病基因和標(biāo)記座的連鎖22致病基因和標(biāo)記座的連鎖57遺傳多態(tài)性：是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。常用的遺傳標(biāo)記：

①ABO血型蛋白多態(tài)

②血清蛋白泳動(dòng)學(xué)改變

③HLA

④RFLP小衛(wèi)星DNA：VNTR6-12個(gè)核苷酸DNA多態(tài)

⑤VNTR微衛(wèi)星DNA：STR2-6個(gè)的VNTR

⑥SNPs23遺傳多態(tài)性：是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，58

二、基因克隆致病基因克隆有兩種基本策略功能克隆定位克隆

1、功能克隆(functionalcloning)

是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進(jìn)行基因定位,進(jìn)而克隆該基因.

24二、基因克隆592